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1、暗河式厌氧产沼技术生物学基础研究学 号：20059026100012005902610001姓 名：李冰冰（博士生）指导教师：肖 波（教 授） 胡志泉（副教授） 环境科学与工程学院 环境工程专业 目录一、课题的来源、目的、意义，国内外概况和预测二、预计需达到的要求、技术指标，预计的技术关 键、技术方案和主要试验研究情况三、课题研究进展计划四、现有的条件、人员及主要设备情况五、需要增添的主要设备、仪器和材料。六、经费概算和来源。七、承担单位和主要协作单位及分工。一、课题的来源、目的、意义 国内外概况和预测1 课题的来源2 课题提出背景3 前期研究基础4 课题研究目的5 课题研究意义6 国内外概况
2、和预测1 课题来源、本课题来源于湖北省科技攻关项目 暗河式生物质产沼技术研究。2 课题提出的背景2.1环保与社会发展背景 农业污染问题：全世界每年的农作物秸秆产量超过20亿t。1988年，我国农业部估计全国畜禽粪尿年排放量为18.84亿吨，相当于工业废弃物排放量的3.4倍。1999年我国畜禽粪便产生量为19亿t，是工业固体废弃物的2.4倍，其中畜禽粪尿COD排放量已达7118万t，远远超过工业废水与生活污水的排放量之和。截至目前，我国农村每年约有农业生物的废弃物达到40多亿吨，其中，牲畜粪便的排放量达到26亿吨，农业农作物达到17亿吨， 目前，农村大量的秸秆等有机固体废物大多焚烧处理，这样既浪
3、费资源，又造成了严重的大气污染；畜禽粪便及其冲刷污水大多自然排放污染水体。2 课题提出的背景城市污染：随着我国城市化进程的加快和城市人口的增多，城市生活垃圾产量迅速增长。据建设部统计资料表明，我国2004年城市生活垃圾的产生量为2亿t，总积存量达66亿吨，且每年以810%的速度递增。据估计至2010年垃圾年产量将达2.2亿吨。垃圾不仅占用大量的土地资源，而且影响我国的城市形象，同时给城市居民的身体健康带来极大危害，从而成为制约我国社会经济健康发展的重要因素。2 课题提出的背景2.2 能源危机背景能源是社会文明发展的物质基础。近四百年来,人类将地球上“积蓄”了25亿年的化石燃料如煤炭、石油和天然
4、气几乎耗尽。而化石燃料作为不可再生资源，长期的开发和使用势必使得这类能源资源越来越少，这些不可再生资源日趋紧缺,能源危机已直接威胁到世界的和平与发展,成为不同政治制度国家共同关注的难题，此时人们将目光投到了生物质能源的开发与利用上。 2 课题提出的背景2.3 社会发展政策背景我国国务院“关于加快发展循环经济的若干意见（国发200522号）”将大力开展资源综合利用,最大程度实现废物资源化和再生资源回收利用和大力发展环保产业,注重开发减量化、再利用和资源化技术与装备等作为工作的重点之一。并进一步指出：“要加快循环经济技术开发。国务院有关部门和地方各级人民政府有关部门要加大科技投入,支持循环经济共性
5、和关键技术的研究开发”。“组织开发绿色再制造技术以及新能源和可再生能源开发利用技术等,提高循环经济技术支撑能力和创新能力。” 农业部日前发出关于贯彻国务院关于建设节约型社会近期重点工作的通知的意见中提出建设节约型农业八大重点，其中第六条就是巩固提高农村可再生资源综合循环利用水平，加强农村沼气和可再生加强农村沼气和可再生能源综合开发利用能源综合开发利用；积极发展太阳能、风能、生物质能生物质能和农村水电等可再生能源。 2 课题提出的背景2.4 经济发展背景由于地球上生物数量巨大，生物质所蕴藏的能量相当惊人。根据生物学家估算，地球上每年生长的生物能总量约1400-1800亿吨（干重），相当于目前世界
6、总能耗的10倍。我国的生物质能也极为丰富，现在每年农村中的秸秆量约6.5亿吨，到2010年将达7.26亿吨，相当于5亿吨标煤。薪柴和林业废弃物数量也很大，林业废弃物每年约达3700万立方米，相当于2000万吨标煤。从资源学的观点看，城市生活垃圾也是资源，而且是目前世界上唯一不断增长的潜在资源。垃圾中蕴藏着巨大的潜能。如果用1.4108t 垃圾发电，可以节约2.3107t煤炭。据有关测算，充分利用中国目前的城市垃圾，每年可以创造25亿元的财富。 3 前期研究基础 “暗河式生物质产沼技术”是在湖北省自然科学基金资助下发展起来的，它是将生物质转化为能源的一种新技术。本实验室研制的暗河式厌氧反应器，已
7、获得国家专利（专利号ZL200420065078.3）。本实验室课题组之前在暗河式垃圾厌氧消化技术和工艺研究方面取得了一定成果，这种工艺将有机固废流态化，实现有机固废厌氧发酵进出料的连续化，解决产沼的连续性问题。 4 课题研究目的 （1）在前期研究与试验的基础上，运用好氧堆肥对暗河式厌氧反应器进行保温实验，解决反应器越冬问题；（2）对发酵原料进行生物预处理以提高反应器启动的时间和发酵原料的生物转化率；（3）重点对暗河式产沼反应进行深入的生物学基础研究，揭示反应器每一反应阶段中微生物优势菌群、群落演替和生理生化指标变化对厌氧发酵工艺的影响，为厌氧发酵工艺的进一步优化与控制提供理论依据。（4）运用
8、微生物学技术、生化和分子生物学技术对产甲烷菌进行培养和研究，力争筛选出适合生物质厌氧发酵各个阶段的高效菌群，提高反应器的产气率和生物质转化率。5 课题研究的意义5.1环境意义运用厌氧消化技术处理有机垃圾具有很大的优越性。厌氧消化产生的沼气可以作为能源加以有效利用，同时也减少了CO2、CH4等温室气体的排放；反应设备均为密闭状态，不会有更多异味逸出；消化后产生的残渣数量较少进行厌氧消化工艺研究，有机垃圾的资源化处理，对解决环境压力有着非常重大的意义。5 课题研究的意义通过沼气发酵，可杀灭畜禽粪水中的病原微生物。血吸虫卵在常温沼气池内722天被杀灭；钩虫卵经30天杀灭90，两个月死亡率达99；蛔虫
9、卵3040天被杀灭；痢疾杆菌在沼气池中30 h死亡。所以，厌氧消化产沼技术的研究，对于改善生活环境，减少了人畜共患病的发生，保证了人民的身体健康同样有着重要意义。5 课题研究的意义5.2能源意义生物质是植物通过光合作用生成的有机物，它的能量最初来源于太阳能，所以生物质能是太阳能最主要的吸收器和储存器，是人类最主要的可再生能源之一。生物质能源的生产和利用将成为人类能源的发展方向，其高效转换和洁净利用日益受到全世界的重视。本课题利用暗河厌氧反应器，以城市生活垃圾、畜禽粪便、秸秆、污泥等生物质为原料，进行高效产沼试验研究，有着非同寻常的能源利用意义。 5 课题研究的意义5.3经济意义利用厌氧生物处理
10、技术将有机物分解为甲烷、二氧化碳和水。这种处理方式一般不需消耗能源，处理后废水也可达标排放，更重要的是可实现废弃物的综合利用，变废为宝、化害为利。利用沼气工程处理畜禽粪便污水，每去除一公斤有机物可获得一定的清洁沼气燃料(可发0.6度电)。再加上上述日益增长的城市垃圾的排放量，厌氧发酵产生的沼气即可带来巨大的经济效益。沼渣液气的综合利用所带来的经济和社会效益同样是不可估量的。6 国内外概况和预测6.1厌氧消化机理研究生物质经过厌氧消化产生沼气的过程就是在特定的厌氧条件下，微生物将有机质进行分解，其中一部分碳素物质转化为 CH4 和CO2，由于厌氧消化参加反应的微生物种类繁多，所以过程复杂。国内外
11、一些学者对厌氧发酵过程中物质的代谢、转化和各种菌群的作用等进行了大量的研究。对厌氧消化的微生物学和生物化学的认识，经历了一个由肤浅到深入的逐渐完善的过程。6.1厌氧消化机理研究1776年，意大利物理学家Alexander Volta测出湖底植物体腐烂所产生的气体中含有甲烷。1875年，俄国科学家Popof首先利用河泥加入纤维素物质中产生甲烷，发现甲烷发酵是一个为生物学过程 。 1901年，荷兰学者所Sohngen对产甲烷菌的形态特征以及它们所能进行的转化作用提出了一个较清楚的概念，并发现氢和二氧化碳的混合物发酵能够生成甲烷。1916年，俄国生物学家Omeliansky分离出第一株产甲烷菌（现已
12、证明不是一个纯种），命名为奥式甲烷菌（Methanobaillus），6.1厌氧消化机理研究1936年，H.ABarker采用化学合成培养基培养下水道污泥，获得了能很好发酵乙醇、丙醇和丁酸的有机体，并发现沼气发酵分为产酸和分解酸产生甲烷两个阶段，初步形成了甲烷发酵的两阶段理论。该理论将厌氧发酵分为分解产酸阶段和产气阶段6.1厌氧消化机理研究1950年，美国R.E Hungate教授建立了厌氧技术，解决了产甲烷菌的分离培养技术问题，为以后对甲烷菌的研究提供了条件。 1967年，M P Bryant采用改良的Hungate技术分离纯化了奥式甲烷菌，证明它是产甲烷杆菌MOH菌株（Atethanoba
13、ctervium）和“s” 有机体的共生体，从而揭示了产氢细菌和产甲烷菌之间的相互依赖关系，进一步推动了厌氧发酵的机理研究 6.1厌氧消化机理研究1972年，Bryantlzgl等人对两阶段理论进行了修正，提出了厌氧消化的三阶段理论，突出了产氢产乙酸菌的地位和作用。（1）水解阶段：厌氧有机物分解菌产生胞外水解酶把非水溶性大分子的碳水化合物、脂肪和蛋白质等水解成可溶性的较小分子化合物 ；（2）产氢产酸阶段：此阶段是由厌氧的产氢、产乙酸菌群把第一阶段产生的各种有机酸分解成乙酸、H2和CO2的过程。 （3）产气阶段：此阶段是由严格厌氧的产甲烷菌群利用一碳化合物（CO2、甲醇、甲酸、甲基胺或CO）、二
14、碳化合物（乙酸）和H2产生甲烷的过程。 6.1厌氧消化机理研究与此同时，Zeikuslao等人提出了厌氧消化的四类群理论，反映了同型产乙酸菌的作用该理论认为专性产氢产乙酸菌对还原性有机物的氧化作用，生成H2、HC03、CH3COOH。同型产乙酸细菌将H2、HC03转化为CH3COOH，同时有少量的CH4、CO2、N2生成。 6.2厌氧消化微生物类群研究参加厌氧消化过程的微生物，有发酵性细菌、产氢产乙酸菌、同型产乙酸菌和产甲烷菌。在厌氧消化中，发酵性细菌、产氢产乙酸菌、同型产乙酸菌等可将复杂的大分子有机物水解为简单的小分子有机物，并进一步发酵为乙酸、丙酸、丁酸等挥发酸和乙醇等，这类细菌种类繁多，
15、代谢能力强，繁殖速度快，世代时间短(几十分钟)。产甲烷阶段的生物相主要是产甲烷菌，他们的种类相对较少，利用底物的专一性强，繁殖速度慢，世代时间最长可达4-6d，而且对环境因素的影响要比发酵细菌敏感得多。随着对产甲烷菌研究的不断深入，截至2000年，发现的产甲烷菌种数已达99种 6.2厌氧消化微生物类群研究水解阶段的细菌：（厌氧和兼性厌氧）气杆菌属(Aerobacter,Aeromonas)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、芽抱杆菌属(Bacillus)、拟杆菌属(Bacteroides)、梭状芽抱杆菌属(Clostridium)、埃希氏菌属(Escherichia)、克氏杆菌属(Kleb
16、siella)、细螺旋体(Leptospira)、小球菌属(Micrococcus)、奈氏球菌属(Nesseria)、副大肠杆菌属(Paracolobacterium)、变形杆菌属(Proteus)、赛氏杆菌属(Serratia)、链菌属(Streptococcus)、假单胞菌属(Pseudimonas)、红极毛杆菌属(Rhodoseudomonas)、八叠球菌属(Sarcina)等，此外还有一些真菌(霉菌和酵母菌)和及少量的原生动物(鞭毛虫纤毛虫和变形虫等)。6.2厌氧消化微生物类群研究产氢产酸阶段的细菌：厌氧的产氢、产乙酸菌群 。主要是S菌和M.O.H （Methanogenic orga
17、nism utilizes H2的简写)菌的共生体。 2CH3CH2OH + 2H2O CH3COO- + 4H2 + 2H+ G。=192千然耳反应 4H2 + HCO- + H+ CH4 + 3H2O G。= -135.6千然耳反应S菌M.O.H菌6.2厌氧消化微生物类群研究S菌株属于产氢产乙酸细菌。产氢产乙酸细菌为产甲烷菌提供乙酸和氢气，促进产甲烷菌的生长；产甲烷细菌由于能利用分子氢而降低氢的分压，有利于产氢产乙酸细菌的生长，因此两者共生联合或称互营联合作用。在自然界除S菌株外，还存在着其它种类的产氢产乙酸细菌，此群细菌将第一阶段的发酵产物如丙酸等三碳以上的有机酸、长链脂肪酸、芳香族酸和
18、醇类等氧化分解成乙酸和分子氢，目前产氢产乙酸细菌仅有少数被分离出来。6.2厌氧消化微生物类群研究产气阶段菌群：起主要作用的细菌主要有马氏甲烷细菌(Methanococcusmazei)、产甲烷球菌属(Methanococusvanniel)、产甲烷八叠球菌属(Methanosarcinamethanica、Methanosarcinabarkeru)、利用乙酸盐甲烷杆菌属(Methanobacteriumformicicum)、奥氏甲烷杆菌属(Methanobacteriumomeliansku)、利用丙酸盐甲烷杆菌属(Methanobacteriumpropionicum)、利用醋酸盐甲烷杆
19、菌属(Methanobacteriumruminanlium)、利用酪酸盐甲烷杆菌属(Methanobacteriumsuboxydans)、孙氏甲烷杆菌属(Methanobacteriumsohngeny)等。6.2厌氧消化微生物类群研究产气阶段是由严格厌氧的产甲烷菌群利用一碳化合物（CO2、甲醇、甲酸、甲基胺或CO）、二碳化合物（乙酸）和H2产生甲烷的过程。形成的甲烷中，约30的甲烷来自氢的氧化和二氧化碳的还原作用；70的甲烷来自乙酸。因此乙酸的降解形成甲烷，是甲烷形成过程中一个很重要的途径。6.3厌氧消化微生物分子生态学研究 分子生态学是应用分子生物学的原理和方法来研究生命系统与环境系统
20、相互作用的机理及其分子机制的科学它是生态学与分子生物学相互渗透而形成的一门新兴交叉学科，其特点是强调生态学研究中宏观与微观的紧密结合，用分子生物学的方法来解决种群水平的生物学问题 。6.3厌氧消化微生物分子生态学研究厌氧消化是一个极其复杂的混合微生物作用的结果。针对目前传统微生物分析方法存在的问题,国际上诸多国家在环境微生物领域先后开展了分子生物学研究方法的建立和生物学评价工作, 更精确地揭示了微生物种类和遗传的多样性。随着近代分子生物学技术的发展,不依靠纯培养的微生物群落结构的分析方法已得到广泛发展和应用。目前在微生物生态学研究中常用的方法有:PCR技术、核酸探针杂交技术、荧光原位杂交技术、
21、DNA 直接测序、rRNA 序列同源性分析方法和变形梯度凝胶电泳方法等,使微生物生态学研究有了重大突破。荧光原为杂交技术（FISH）荧光原位杂交(简称FISH)技术是一种应用非放射性荧光物质依靠核酸探针杂交原理在核中或染色体上显示DNA序列位置的方法。 其原理是利用一小段(通常15-30 个碱基)用荧光物质标记过的DNA 或RNA 序列作为探针,将其直接投加到环境样品中,利用其与样品中同源性微生物细胞内核酸分子的碱基互补配对特性,在荧光显微镜下,直接观察和探测特定微生物的分布与数量。荧光原为杂交技术（FISH）的发展与应用1969年Gall和Pardue利用放射性同位素标记的DNA探针检测细胞
22、制片上非洲爪蟾细胞核内的rDNA获得成功。之后,Pardue等同年又以小鼠卫星DNA为模板,利用体外合成的含3H的RNA为探针成功地与中期染色体标本进行了原位杂交,从而开创了RNA-DNA的原位杂交技术。1974年Evans第一次将染色体显带技术和原位杂交技术结合起来,提高了基因定位的准确性。1981年,Roumam 首次报道了荧光素标记的cDNA作原位杂交。同年,Langer等用生物素标记核苷酸制备探针。荧光原为杂交技术（FISH）的发展与应用1986年,Cremer与Licher 等分别证实了荧光原位杂交(FISH)技术应用于间期核检测染色体非整倍体的可行性,从而开辟了间期细胞遗传学研究。
23、1988年,Giovannoni将原位杂交技术引入了细菌学的研究中,他首先用放射性标记rRNA寡核苷酸探针显微探测细菌。随着安全性较强的荧光技术的发展,1989年,DeLong首先用荧光标记的寡核苷酸探针来探测独立的微生物细胞，此项技术即荧光原位杂交(FISH)技术。随后Amann ,Stahl等人利用该技术对多种环境样品进行了研究,使该技术在环境领域内的应用日趋广泛和成熟。 荧光原为杂交技术（FISH）的发展与应用通过利用FISH技术在环境样品上直接原位杂交,不仅可测定不可培养微生物的形态特征及丰度,而且可原位分析它们的空间及数量分布。德国慕尼黑大学的Amann教授在环境微生物FISH技术研
24、究中,进行了大量深入详尽的工作。Wagner、Manz及Luxmy,在此方面，特别是在污水处理中对微生物的种群原位监测投入了大量的精力，对不同城市污水处理厂混合液样品的微生物种群进行荧光探针原位检测,。荧光原为杂交技术（FISH）的发展与应用进入20世纪90年代以后,FISH技术在方法上逐步形成了从单色向多色-FISH的发展趋势,灵敏度和分辨率也有了大幅度的提高。 Cremer等用生物素和汞或氨基乙酰荧光素(AFA)标记探针建立了双色FISH技术。1990年，Nederlof 等提出用 3 种荧光素探测 3 种以上的靶位 DNA 序列,创建了多色 FISH 方法。 Perry-Okeefe等3
25、5应用4种PNA探针的M-FISH对铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌进行了检测。 荧光原为杂交技术（FISH）的发展与应用厌氧颗粒污泥是由多种具有互营共生关系的厌氧微生物形成的复杂聚集体,由于其中微生物组成及其相互关系的复杂性、以及某些厌氧细菌(如产氢产乙酸细菌和产甲烷细菌)的生长特异性等,使得对厌氧颗粒污泥的认识至今仍未取得共识。 FISH技术的出现,可以在很大程度上弥补传统方法的不足 。国内外一些学者利用此技术对厌氧颗粒进行了研究。荧光原为杂交技术（FISH）的发展与应用Harmsen等人利用 EUB338 ,ARC915 ,MX825 和 MG1200 等探针的不同组合,
26、研究发现蔗糖为基质的颗粒污泥分为三层:外层为真细菌,中间层为产氢产乙酸细菌与产甲烷丝菌的共生体,内层存在着较大空洞,有少量产甲烷细菌和无机物;而以混合挥发酸为基质的颗粒污泥只分为较明显的两层:外层是真细菌,内层则以产甲烷丝菌为主。荧光原为杂交技术（FISH）的发展与应用Sekiguchi等人利用 EUB338 和 ARC915 探针确定了真细菌和古细菌在中温和高温厌氧颗粒污泥中的分布情况,然后利用MX825 ,MG1200 ,MB1174MS1414 和D660 等探针的不同组合对不同种类产甲烷细菌与真细菌的空间分布进行研究。结果表明：中温和高温颗粒污泥具有相似的微生物分布结构,外层主要是真细
27、菌,内层主要是古细菌;颗粒中心均不能被染色,可能是无机物或死亡细菌;古细菌中以索氏产甲烷丝菌为主,在高温颗粒污泥中还存在少量的产甲烷八叠球菌;真细菌则种类较多,主要有脱硫叶菌、互营杆菌、和绿色非硫细菌等。 荧光原为杂交技术（FISH）的发展与应用Tagawa 等人利用ARC915 ,MB1174 和MT757等探针,采用计数法描述了颗粒污泥中古细菌、产甲烷丝菌和产甲烷八叠球菌的丰度。结果表明:古细菌是颗粒污泥中的优势菌群, 占细菌总数的28%-53%；古细菌中产甲烷丝菌和产甲烷八叠球菌是主要代表,分别占细菌总数的13%- 38%和4%-27%。 我国清华大学主要就污水处理中厌氧颗粒污泥进行了分
28、子生物学水平的研究 变性梯度凝胶电泳（变性梯度凝胶电泳（DGGEDGGE） 变性梯度凝胶电泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）最初是 Lerman 等人于20 世纪 80 年代初期发明的，起初主要用来检测 DNA 片段中的点突变。Muyzer 等人在 1993 年首次将其应用于微生物群落结构研究。后来又发展出其衍生技术，温度梯度凝胶电泳（temperature gradient gel electrophoresis，TGGE）。此后十年间，该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域，目前已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学
29、方法之一。变性梯度凝胶电泳（变性梯度凝胶电泳（DGGEDGGE）的原理）的原理双链 DNA 分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为决定于其分子大小和电荷。不同长度的 DNA 片段能够被区分开，但同样长度的 DNA 片段在胶中的迁移行为一样，因此不能被区分。DGGE/TGGE 技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度或是温度梯度，从而能够把同样长度但序列不同的 DNA 片段区分开来。一个特定的 DNA 片段有其特有的序列组成，其序列组成决定了其解链区域(melting domain, MD)和解链行为(melting behavior) 。 变性梯度凝胶电泳（变性
30、梯度凝胶电泳（DGGEDGGE）的应用）的应用PCR-DGGE/TGGE 技术在微生物生态学中的一个主要用途是分析微生物群落结构组成Muyzer 等人于 1993 年首次将该技术用于研究微生物菌苔和生物膜系统的群落多样性。此后，该技术被广泛应用于各微生物生态系统，包括土壤 ，活性污泥，人体和动物肠道，温泉，植物根系，海洋，淡水湖，油藏等。绝大部分研究都是通过扩增细菌或古细菌的 16S rRNA 基因来研究各生态系统中的细菌或古细菌群落多样性。我国哈尔滨工业大学用此项技术对生物产清发酵细菌的种群和群落演替进行了研究。 6.4 厌氧消化微生物分离与培养研究1950年，美国R.E Hungate教授
31、建立了厌氧技术，解决了产甲烷菌的分离培养技术问题，为以后对甲烷菌的研究提供了条件。1967年，M P Bryant采用改良的Hungate技术分离纯化了奥式甲烷菌，证明它是产甲烷杆菌MOH菌株（Atethanobactervium）和“s” 有机体的共生体，近年来，许多学者运用厌氧培养技术对一些产甲烷菌、产氢菌、产乙酸菌、高温纤维素分解菌、丁酸菌等等进行了分离和培养，使用的多为改良亨盖特滚管技术。关于高效优势产甲烷菌群的培养、开发与应用研究未见报道。 6.5国内外厌氧消化工程应用于发展概况 厌氧产沼技术的应用也已有100多年的历史： 1896年，英国小城市Exeter建起了一座处理生活污水污泥
32、的厌氧消化池，所产沼气用作一条街道的照明燃料；1906年印度Matunga建造了利用人粪生产沼气的沼气池。随着工艺的进步与发展，厌氧消化被应用于畜牧业和农产品加工废料的处理，并逐渐在高浓度有机废水的处理上得到广泛应用，但将其应用于固体废物的处理，尤其是有机生活垃圾的处理，则只有十几年的历史。6.5国内外厌氧消化工程应用于发展概况近十年来，有机垃圾厌氧消化系统在德国、瑞士、奥地利、芬兰、瑞典等国家发展尤其迅速。我国的沼气工程始建于1936年，最近二十多年才开始有较大发展，截至2000年，我国已建成了400-500个不同类型工艺处理工业废水的沼气工程。600多个处理畜禽废水、废渣的沼气工程.随着新
33、农村建设进程的不断推进，沼气工程技术正在逐步被大力推广应用。6.5国内外厌氧消化工程应用于发展概况目前，我国在固废垃圾处理行业中应用厌氧产气并回收利用则还处于起步阶段。与国外相比，我国厌氧发酵技术还有很大差距。主要表现在：厌氧发酵产气率低；系统运行和管理自动化程度不高；与沼气发酵和综合利用配套的设备和技术不成熟；厌氧发酵产业化、工业化发展进程缓慢等多方面。不同的反应器，不同的反应底物，其微生物的种类、生长规律、群落演替，菌群关系等还有待深入研究。 6.6发酵底物生物预处理研究根据现有的研究发现，固体厌氧消化的速度较慢，特别是植物性原料，富含木质素、纤维素和半纤维素，不易被微生物降解，因而影响沼
34、气转化率，是很多厌氧消化过程中的限制性因素。一些研究和试验表明，对固体废物采用物理法、化学法、生物法等预处理可以提高甲烷产气量。目前对固态厌氧消化底物的物理和化学预处理方法研究较多，对生物预处理的研究则较少。 6.6发酵底物生物预处理研究Peter等从高温反应器中分离到能分解有机固体废物的嗜温微生物,用该微生物对污水污泥进行预处理,在1-2d内近40%的有机物被分解,而且与没有经过该预处理相比，厌氧消化过程中沼气产量提高50%；Ejlertsson研究表明，在消化开始阶段进行间歇曝气能有效去除易降解的固废，克服高浓度VFA带来的抑制问题。Mshandete等研究了纸浆厌氧发酵系统中，启动阶段进
35、行9h堆肥预处理后甲烷产量提高26%；Katsura和Hasegawa进行了类似的预处理研究，对污泥进行微好氧热处理后甲烷产量提高50%。 6.6发酵底物生物预处理研究堆肥处理是在有氧的条件下，借助好氧微生物(主要是好氧菌)的作用而进行的。微生物在堆肥过程中 起着十分重要的作用，而在堆肥过程中堆肥微生物的数量和种群不断发生变化。变化过程通常表现为：细菌、真菌 纤维素分解菌 放线菌 木质素分解菌。6.6发酵底物生物预处理研究有机固体废物中含有大量的木质纤维素，其成分复杂，主要由纤维素、半纤维素和木质素构成，纤维素分子本身的结构致密，由木质素和半纤维素形成的保护层造成木质纤维素不容易降解，因此，难
36、以被充分利用或被大多数微生物直接作为碳源物质而转化利用。所以，木质纤维素的生物降解成为生物技术处理有机固体废物的关键，也是近年来研究的重点。应用堆肥微生物的分解作用对纤维素、木质素等大分子进行讲解预处理，可以提高其厌氧发酵的生物转化率二、预计需达到的要求、技术指标，预计的技术关键、技术方案和主要试验研究情况。 1 研究内容 2 技术方案3 技术关键 4 检测指标 5 预期研究成果1 研究内容（1）暗河式厌氧发酵系统中各阶段微生物代谢生化机理与微生物形态学研究（2）暗河式厌氧发酵系统中各阶段微生物群落分子生态学研究（3）厌氧发酵底物堆肥预处理对厌氧发酵的影响研究（4）高效产甲烷菌种的分离培养与筛
37、选（5）暗河式厌氧发酵技术高效产气工艺优化与控制研究2 技术方案2.1实验中各项指标的测定方法：（1）固含量的测定（TS）: 常规（2）有机碳（TOC）值的测定：采用Aopplo 9000测定仪测定。（3）气体成分及含量的测定：气相色谱（4）挥发性脂肪酸（VFA）的测定：NaOH滴定法测定。（5）氨氮的测定：钠氏试剂分光光度法 （6）COD的测定：COD的测定采用重铬酸钾法 （7）酶活性测定：滤纸怦匮法测定纤维素酶活性； 茚三酮比色法测定蛋白酶活性；（8）丙酮酸的测定：2，4-二硝基苯肼分光光度法 （9）微生物检测：光学显微镜和电子扫描显微镜 2 技术方案2.2 分子生物学技术应用FISH技术
38、结合DGGE技术 检测暗河各个阶段微生物群落结构，探索各阶段优势菌群。 2.3堆肥预处理对厌氧发酵的影响实验设计不同堆肥时间梯度，用发酵瓶研究堆肥预处理原料对厌氧发酵的影响，检测各项指标探索出最适合的堆肥时间和温度，进行暗河系统试验。2 技术方案2.4菌种分离与培养实验在暗河系统运行至产气高峰时，取其发酵液为接种，在实验室中人工合成培养基中进行液体厌氧培养，然后采用改良亨盖特滚管法进行分离培养，优化筛选优势菌种，进行投放试验研究。2.5暗河产气工艺优化与控制研究在以上基础研究数据的基础上，优化厌氧反应器工艺，设计出反应器监控最佳指标体系。进行反应器试验。 3 技术关键（1）实验中酶活性、丙酮酸
39、、VFA等代谢物的含量测定（2）微生物形态观察、 制片、照相（3）应用改良亨盖特滚管法分离培养菌种，进行菌种鉴定。（4）FISH技术中探针的合成。4 检测指标（1）沼气检测指标：沼气产气率，产气量，气体成分（甲烷含量）（2）沼液分析指标：化学需氧量，TS，VS,总氮，总磷，氨氮。（3）菌种鉴定：镜检结果为单纯产甲烷菌5 预期研究成果（1）厌氧发酵生物学基础研究报告 （博士毕业论文）（2）高效产甲烷菌种（3）在中文核心刊物上发表论文2-3篇，在外文期刊发表论文1-2篇三、课题研究进展计划 2005年9月-2005年12月：查阅国内外相关文献，并写出文献综述。 2006年1月-2006年5月：堆肥
40、保温可行性和预处理研究 2006年6月-2006年12月： 暗河发酵系统微生物学形态学研究和发酵生化机理以及控制参数研究 2007年1月-2007年5月：进行菌种培养与筛选 2007年6月-2007年12月：进行暗河系统微生分子生态学研究，同时进行菌种投放发酵试验。 2008年1月-2008年4月：准备毕业论文，论文写作。 2008年5月：进行论文答辩。四、现有的条件、主要设备情况及人员1 现有条件及主要设备2参与人员1 现有条件及主要设备 （1）沼气发酵装置：暗河厌氧消化反应器一套（2）微生物观察仪器：光学显微镜一台（3）分析仪器：电子天平、紫外-可见分光光度计、离心机、PH计等（4）微生物培养仪器：超静工作台、高压灭菌锅、 恒温干燥箱、生化培养箱、恒温水浴箱等2 参与人员 5 需要增添的主要设备、仪器和材料6 经费概算和来源7 承担单位和主要协作单位承担单位：华中科技大学环境科学与工程学院感谢 谢谢各位 老师！ 同学！
