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1、实验三实验三 骨髓法制备小白鼠骨髓法制备小白鼠 染色体标本染色体标本第二部分第二部分 细胞遗传学细胞遗传学一、实验目的一、实验目的 1 1 1 1、掌握动物骨髓细胞染色体标本制备的方、掌握动物骨髓细胞染色体标本制备的方、掌握动物骨髓细胞染色体标本制备的方、掌握动物骨髓细胞染色体标本制备的方 法及操作技术。法及操作技术。法及操作技术。法及操作技术。 2 2 2 2、进一步观察了解畜禽染色体的形态学及、进一步观察了解畜禽染色体的形态学及、进一步观察了解畜禽染色体的形态学及、进一步观察了解畜禽染色体的形态学及 遗传学特征。遗传学特征。遗传学特征。遗传学特征。 在骨髓细胞中，有丝分裂的指数是相当高的，
2、在骨髓细胞中，有丝分裂的指数是相当高的，通过注射秋水仙素使正在分裂的细胞停止在有丝通过注射秋水仙素使正在分裂的细胞停止在有丝分裂中期，再经过低渗、固定、滴片就可以获得分裂中期，再经过低渗、固定、滴片就可以获得大量的骨髓细胞染色体分裂相。大量的骨髓细胞染色体分裂相。二、二、实验原理实验原理 1、研究染色体的材料研究染色体的材料处于分裂旺盛期的组织：处于分裂旺盛期的组织：处于分裂旺盛期的组织：处于分裂旺盛期的组织：（1 1 1 1）动物的骨髓、外周血淋巴细胞、睾丸等。）动物的骨髓、外周血淋巴细胞、睾丸等。）动物的骨髓、外周血淋巴细胞、睾丸等。）动物的骨髓、外周血淋巴细胞、睾丸等。（2 2 2 2）
3、果蝇三龄幼虫的唾腺）果蝇三龄幼虫的唾腺）果蝇三龄幼虫的唾腺）果蝇三龄幼虫的唾腺（3 3 3 3）植物的根尖（如洋葱）植物的根尖（如洋葱）植物的根尖（如洋葱）植物的根尖（如洋葱） 2、研究染色体的方法研究染色体的方法1 1 1 1、材料获取、材料获取、材料获取、材料获取 直接获取细胞（骨髓、唾腺）直接获取细胞（骨髓、唾腺）直接获取细胞（骨髓、唾腺）直接获取细胞（骨髓、唾腺） 细胞培养（猪淋巴细胞培养法）细胞培养（猪淋巴细胞培养法）细胞培养（猪淋巴细胞培养法）细胞培养（猪淋巴细胞培养法）2 2 2 2、非切片法、非切片法、非切片法、非切片法 滴片法细胞培养材料、骨髓滴片法细胞培养材料、骨髓滴片法细
4、胞培养材料、骨髓滴片法细胞培养材料、骨髓 压片法果蝇唾腺，植物的根尖压片法果蝇唾腺，植物的根尖压片法果蝇唾腺，植物的根尖压片法果蝇唾腺，植物的根尖三、实验材料、仪器和试剂三、实验材料、仪器和试剂材料：材料：小白鼠（小白鼠（222225g 25g ）。）。仪器：仪器：显微镜、注射器、显微镜、注射器、10ml10ml离心管、吸管、离心管、吸管、 试管架、载玻片、恒温水浴锅、离心机、试管架、载玻片、恒温水浴锅、离心机、 剪刀、磁盘、镊子等。剪刀、磁盘、镊子等。试剂：试剂：秋水仙素、秋水仙素、KClKCl、磷酸缓冲液、冰醋、磷酸缓冲液、冰醋 酸、甲醇、酸、甲醇、GiemsaGiemsa液等。液等。1、
5、秋水仙素处理：、秋水仙素处理：取骨髓前取骨髓前23h，给小白鼠腹，给小白鼠腹腔注射秋水仙素液（注射剂量为腔注射秋水仙素液（注射剂量为2g/g小白鼠体重）小白鼠体重）四、制四、制备备步步骤骤2 2、杀鼠取髓：、杀鼠取髓： 采用脱颈椎法处死小白鼠。用采用脱颈椎法处死小白鼠。用剪刀剪开后腿上的皮肤和肌肉，取出股骨，剔剪刀剪开后腿上的皮肤和肌肉，取出股骨，剔净皮肉，再用剪刀剪掉股骨两端，用注射器分净皮肉，再用剪刀剪掉股骨两端，用注射器分两次吸取两次吸取0.075MKCl0.075MKCl溶液（共溶液（共5ml5ml）通过针头）通过针头注入骨髓腔缓慢将细胞冲入离心管，反复冲洗注入骨髓腔缓慢将细胞冲入离心
6、管，反复冲洗直到骨髓腔发白为止。直到骨髓腔发白为止。注意事项：注意事项：注射器注射器注射器注射器剪掉剪掉剪掉剪掉剪掉剪掉剪掉剪掉3 3、低渗：、低渗：将获得的骨髓悬液用吸管立即将细胞团将获得的骨髓悬液用吸管立即将细胞团吹散打匀，两组同时放入吹散打匀，两组同时放入3737恒温水浴锅内低渗恒温水浴锅内低渗30min30min。低渗结束时，向试管中加入加预固定液。低渗结束时，向试管中加入加预固定液（甲醇：冰乙酸（甲醇：冰乙酸3:13:1，现配现用），现配现用）8 81010滴滴 ，混，混合均匀（以防细胞结团），平衡合均匀（以防细胞结团），平衡（注意（注意2 2管同时离管同时离心）心）后后1000r/
7、min1000r/min离心离心10min10min，弃上清。，弃上清。4 4、第一次固定：、第一次固定：在弃去上清液的试管中。在弃去上清液的试管中。 加入加入新配的新配的3:13:1甲醇冰醋酸固定液甲醇冰醋酸固定液56ml56ml，用吸管轻轻，用吸管轻轻吸打均匀，室温静置吸打均匀，室温静置30min30min进行第一次固定。平进行第一次固定。平衡后衡后1000r / min1000r / min离心离心10min10min，弃上清（可留，弃上清（可留0.5ml0.5ml） 。5 5第二次固定：第二次固定：在弃去上清液的试管中。加入新在弃去上清液的试管中。加入新配的配的3:13:1甲醇甲醇-
8、-冰醋酸固定液冰醋酸固定液56ml56ml，用吸管轻轻，用吸管轻轻吸打均匀，室温静置吸打均匀，室温静置30min30min进行第二次固定。平进行第二次固定。平衡后衡后 1000r / min1000r / min离心离心10min 10min ，弃上清（留，弃上清（留0.2ml0.2ml左右）左右） 。6 6、滴片：、滴片：在弃去上清液的试管中加入适量（在弃去上清液的试管中加入适量（2 21010滴，在老师辅导下加）新配固定液，用吸管吹滴，在老师辅导下加）新配固定液，用吸管吹打均匀制成细胞悬液，滴打均匀制成细胞悬液，滴2 23 3滴于冰冻的载玻片滴于冰冻的载玻片上，立即用嘴吹气使细胞迅速分散，
9、在载玻片后上，立即用嘴吹气使细胞迅速分散，在载玻片后面一角写上学号，空气干燥。面一角写上学号，空气干燥。7 7、染色：、染色：将染色体制片细胞面朝下反扣于染色板将染色体制片细胞面朝下反扣于染色板上，用上，用1 1：9Giemsa9Giemsa稀释液染色稀释液染色30min30min，小水流，小水流自来水冲洗浮色，空气干燥后，显微镜下观察。自来水冲洗浮色，空气干燥后，显微镜下观察。小白鼠睾丸细胞分裂小白鼠睾丸细胞分裂1010倍物镜下倍物镜下小白鼠的染色体分裂相（小白鼠的染色体分裂相（2n2n4040）五、骨髓法需要注意的问题五、骨髓法需要注意的问题1 1 1 1、秋水仙素的量一定要合适，太少分裂
10、相少，太多染色体、秋水仙素的量一定要合适，太少分裂相少，太多染色体、秋水仙素的量一定要合适，太少分裂相少，太多染色体、秋水仙素的量一定要合适，太少分裂相少，太多染色体短粗。短粗。短粗。短粗。2 2 2 2、为了节省时间，可直接用低渗液（约、为了节省时间，可直接用低渗液（约、为了节省时间，可直接用低渗液（约、为了节省时间，可直接用低渗液（约5ml5ml5ml5ml）冲骨髓入离）冲骨髓入离）冲骨髓入离）冲骨髓入离心管。心管。心管。心管。3 3 3 3、注意将两组离心管同时放入水浴锅中，由、注意将两组离心管同时放入水浴锅中，由、注意将两组离心管同时放入水浴锅中，由、注意将两组离心管同时放入水浴锅中，
11、由1 1 1 1人记录时间，人记录时间，人记录时间，人记录时间，同时进行预固定，然后离心。同时进行预固定，然后离心。同时进行预固定，然后离心。同时进行预固定，然后离心。4 4 4 4、低渗时间一定要严格、低渗时间一定要严格、低渗时间一定要严格、低渗时间一定要严格时间时间时间时间, , , ,加预固定液加预固定液加预固定液加预固定液8 8 8 8滴，混合均匀平滴，混合均匀平滴，混合均匀平滴，混合均匀平衡离心衡离心衡离心衡离心（注意（注意（注意（注意2 2 2 2人一组同时离心）人一组同时离心）人一组同时离心）人一组同时离心）低渗的作用？低渗的作用？ 目的是使低渗液在一定温度、一定时间内渗目的是使
12、低渗液在一定温度、一定时间内渗目的是使低渗液在一定温度、一定时间内渗目的是使低渗液在一定温度、一定时间内渗入细胞内，使细胞涨大，细胞膜变薄，在滴片时入细胞内，使细胞涨大，细胞膜变薄，在滴片时入细胞内，使细胞涨大，细胞膜变薄，在滴片时入细胞内，使细胞涨大，细胞膜变薄，在滴片时细胞才能破裂，染色体才能平铺在载玻片上。细胞才能破裂，染色体才能平铺在载玻片上。细胞才能破裂，染色体才能平铺在载玻片上。细胞才能破裂，染色体才能平铺在载玻片上。 实验证明小鼠和雏鸡都用实验证明小鼠和雏鸡都用实验证明小鼠和雏鸡都用实验证明小鼠和雏鸡都用37 2037 2037 2037 2021212121分钟最好。分钟最好。
13、分钟最好。分钟最好。预固定的作用？预固定的作用？ 在低渗结束后，往细胞悬液中加入甲醇：在低渗结束后，往细胞悬液中加入甲醇：在低渗结束后，往细胞悬液中加入甲醇：在低渗结束后，往细胞悬液中加入甲醇：冰醋酸（冰醋酸（冰醋酸（冰醋酸（3 3 3 3：1 1 1 1）约）约）约）约1ml1ml1ml1ml，可以使细胞表面轻微，可以使细胞表面轻微，可以使细胞表面轻微，可以使细胞表面轻微固定，以防止细胞结团。固定，以防止细胞结团。固定，以防止细胞结团。固定，以防止细胞结团。固定的作用？固定的作用？ 为了除去染色体中的蛋白质，使得染色体为了除去染色体中的蛋白质，使得染色体为了除去染色体中的蛋白质，使得染色体为
14、了除去染色体中的蛋白质，使得染色体分散良好清晰可见，在实验中如果发现分散不分散良好清晰可见，在实验中如果发现分散不分散良好清晰可见，在实验中如果发现分散不分散良好清晰可见，在实验中如果发现分散不够好，可采取延长固定时间或用甲醇：冰醋酸够好，可采取延长固定时间或用甲醇：冰醋酸够好，可采取延长固定时间或用甲醇：冰醋酸够好，可采取延长固定时间或用甲醇：冰醋酸=3:1=3:1=3:1=3:1再固定一次可以改善染色体分散情况。再固定一次可以改善染色体分散情况。再固定一次可以改善染色体分散情况。再固定一次可以改善染色体分散情况。 六、作业六、作业1 1 1 1、 每个人完成一份实验报告，写明实验目的、原理
15、、每个人完成一份实验报告，写明实验目的、原理、每个人完成一份实验报告，写明实验目的、原理、每个人完成一份实验报告，写明实验目的、原理、材料器具试剂、步骤、绘出你所做的染色体标本图材料器具试剂、步骤、绘出你所做的染色体标本图材料器具试剂、步骤、绘出你所做的染色体标本图材料器具试剂、步骤、绘出你所做的染色体标本图形。形。形。形。2 2 2 2、如失败，请分析失败的可能原因。、如失败，请分析失败的可能原因。、如失败，请分析失败的可能原因。、如失败，请分析失败的可能原因。3 3 3 3、请对本次实验提出改进意见，并写出实验体会、请对本次实验提出改进意见，并写出实验体会、请对本次实验提出改进意见，并写出实验体会、请对本次实验提出改进意见，并写出实验体会。
