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1、第第2讲讲 微生物的培养与应用微生物的培养与应用 一、微生物的培养 【答案】营养物质生长繁殖水碳源氮源无机盐特殊营养物质氧气温和微生物芽孢孢子煮沸消毒法巴氏消毒法所有的微生物灼烧干热高压蒸汽 【答案】接种环、涂布器平板划线21.稀释涂布平板22.酒精灯火焰 二、微生物的利用 【答案】23.固体斜面24.菌落25.4 26.不长27.污染28.甘油管藏29.20 【答案】30.选择培养基31.尿素32.稀释涂布平板法33.显微镜直接计数34. M35.被测试的条件36.非测试因素 【答案】37.纤维素38.纤维素粉39.微生物40.倒平板41.发酵产纤维素酶42.葡萄糖 一、微生物的培养与应用
2、1.微生物的实验室培养 (1)培养基 概念:人们按照微生物对营养物质的不同需求,配制出供其生长繁殖的营养基质。 分类和应用 培养基配方及营养要素 基本营养要素：各种培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐。此外还要满足不同微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的需求。 【友情提醒】微生物最常用的碳源是糖类，尤其是葡萄糖；最常利用的氮源是铵盐、硝酸盐。 对异养微生物来说，含C、H、O、N的有机化合物既是碳源，又是氮源、能源。 有些培养基不需要添加特殊营养物质，生物自己能合成，如大肠杆菌能合成某些维生素，作为特殊营养物质。 制备：计算称量溶化灭菌倒平板。 (2)无菌技术 消毒和灭菌的区别条件条件结果
3、结果常用的方法常用的方法消消毒毒较较为为温温和和的的物物理或化学方法理或化学方法仅仅杀杀死死物物体体表表面面或或内内部部的的部部分分微微生生物物(不不包包括括芽芽孢孢和和孢孢子子)煮煮沸沸消消毒毒法法、巴巴氏氏消消毒毒法法、化化学学药药剂剂消消毒毒法法灭灭菌菌强强烈烈的的理理化化因因素素杀杀死死物物体体内内外外所所有有的的微微生生物物，包包括括芽芽孢孢和和孢孢子子灼灼烧烧灭灭菌菌、干干热热灭灭菌菌、高高压压蒸汽灭菌蒸汽灭菌 【友情提醒】用酒精消毒时，70%的酒精杀菌效果最好，原因是：浓度过高，使菌体表面蛋白质凝固成一层保护膜，乙醇分子不能渗入其中；浓度过低，杀菌力减弱。 无菌技术主要操作要求
4、a实验前应对操作空间、操作人员消毒，对所用器具和培养基灭菌。 b实验进行时需在酒精灯火焰周围无菌区操作，另外要避免已灭菌处理材料再次污染。 2纯化大肠杆菌以及菌种的保藏 (1)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基：计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。 (2)纯化大肠杆菌 原理：在培养基上将细菌稀释或分散成单个细胞，使其长成单个的菌落，这个菌落就是一个纯化的细菌菌落。 方法：平板划线法、稀释涂布平板法。 平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面；稀释涂布平板法则是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。
5、 (3)菌种的保藏 短期保存：固体斜面培养基上4 保存，菌种易被污染或产生变异。 长期保存：20 甘油管在冷冻箱中保藏。 【友情提醒】平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的温度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发；又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。 【 例 1】 分 析 下 面 培 养 基 的 配 方 ： KH2PO4、Na2HPO4、MgSO47H2O、葡萄糖、尿素、琼脂。请回答： (1)在该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是_和_。 (2)想一想这种培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，又是如何进行选择的？_。 (3)培养基、
6、培养皿、接种环、实验操作者的双手、空气、牛奶所采用的灭菌及消毒方法依次是() 化学消毒灼烧灭菌干热灭菌紫外线灭菌高压蒸汽灭菌巴氏消毒法 A B C D 【解析】碳源是提供碳元素的物质，氮源是提供氮元素的物质。所以碳源是葡萄糖，氮源是尿素。绝大多数生物都能利用葡萄糖，但是，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，所以这种培养基对微生物有选择作用。选择的原则是只有能够利用尿素的微生物才能够生长。培养基用高压蒸汽灭菌；培养皿能耐高温，可用干热灭菌；接种环可用灼烧灭菌达到迅速彻底的灭菌效果；实验操作者的双手可用化学药剂进行消毒，如用酒精擦拭双手；空气可用紫外线消毒；牛奶为不破坏其营养成分可采用巴氏消毒法。
7、 【答案】(1)葡萄糖尿素 (2)有选择作用。因为此配方中尿素是惟一氮源，因此，只有能够利用尿素的微生物才能够生长 (3)A 二、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 1分离的原理 (1)土壤中的细菌之所以能够分解尿素，是因为它们体内能合成脲酶。这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起催化作用。 (2)实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。 2分离分解尿素的细菌所使用的特定培养基 分离分解尿素的细菌的培养基应为选择培养基，培养基中的氮源只有尿素，理论上只有能合成脲酶的微生物才能在上面生长。其配方如下： KH2PO4 1.4
8、 g Na2HPO4 2.1 g MgSO47H2O 0.2 g 葡萄糖 10.0 g 尿素(惟一氮源) 1.0 g 琼脂 15.0 g 将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000 mL。 3统计菌落数目的方法 (1)显微镜直接计数法 原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。 方法：用计数板计数。 缺点：不能区分死菌与活菌。 (2)间接计数法(活菌计数法) 原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。 操作 a设置重复组，增强实验的说服力与准确性。 b为
9、了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板进行计数。 计算公式：每克样品中的菌株数 M，其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。 4细菌分离与计数的实验流程 土壤取样样品稀释取样涂布微生物培养观察并记录结果细菌计数。 【例2】可以鉴定出分解尿素的细菌的方法是() A以尿素为惟一氮源的培养基中加入酚红指示剂 B以尿素为惟一氮源的培养基中加入二苯胺试剂 C以尿素为惟一氮源的培养基中加入苏丹试剂 D以尿素为惟一氮源的培养基中加入双缩脲试剂 【解析】在以尿素为惟一氮源的培养基中，不能分解尿素获得氮源的细菌不能生长，而分解尿素的细菌
10、能利用尿素作氮源，将尿素分解为氨，使pH升高。若培养基中加入酚红指示剂，指示剂将变红。此培养基既属于选择培养基，又属于鉴别培养基。 【答案】A 三、分解纤维素的微生物的分离 1分解纤维素的微生物的分离 (1)实验原理即：可根据是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。 (2)实验流程 土壤取样：富含纤维素的环境。 选择培养：用选择培养基培养，以增加纤维素分解菌的数量。 梯度稀释 涂布平板：将样品涂布于鉴别含CR的纤维素分解菌的培养基(固体)。 挑选产生透明圈的菌落：产生纤维素酶的菌落周围出现透明圈。 2两种刚果红染色法的比较方法方法方方法法一一：先先培培养养微微生生物物，再再加加入入刚刚果果红红进进行
11、行颜颜色色反反应应，过过程程如如下下：培培养养基基经经涂涂布布培培养养长长出出菌菌落落覆覆盖盖质质量量浓浓度度为为1 mg/mL的的CR溶液溶液 倒倒去去CR溶溶液液加加入入物物质质的的量量浓浓 度度 为为 1 mol/L的的 NaCl溶溶 液液 倒掉倒掉NaCl溶液溶液出现透明圈出现透明圈方方法法二二：倒倒平平板板时时就就加加入入刚刚果果红红，过过程程如如下下：配配制制质质量量浓浓度度为为10 mg/mL的的CR溶溶液液灭灭菌菌按按照照每每200 mL培培养养基基加加入入1 mL的的比比例例加加入入CR溶溶液液混混匀匀倒倒平平板板接种后培养接种后培养出现透明圈出现透明圈优点优点显显示示出出的
12、的颜颜色色反反应应基基本本上上是是纤维素分解菌的作用纤维素分解菌的作用操操作作简简便便，不不存存在在菌菌落落的的混混杂杂问问题题方法方法方方法法一一：先先培培养养微微生生物物，再再加加入入刚刚果果红红进进行行颜颜色色反反应应，过过程程如如下下：培培养养基基经经涂涂布布培培养养长长出出菌菌落落覆覆盖盖质质量量浓浓度度为为1 mg/mL的的CR溶溶液液 倒去倒去CR溶液溶液加入物质的量浓度为加入物质的量浓度为1 mol/L的的NaCl溶液溶液 倒掉倒掉NaCl溶液溶液出现透明圈出现透明圈方方法法二二：倒倒平平板板时时就就加加入入刚刚果果红红，过过程程如如下下：配配制制质质量量浓浓度度为为10 mg
13、/mL的的CR溶溶液液灭灭菌菌按按照照每每200 mL培培养养基基加加入入1 mL的的比比例例加加入入CR溶溶液液混混匀匀倒倒平平板板接接种种后后培养培养出现透明圈出现透明圈缺点缺点操操作作繁繁琐琐，加加入入刚刚果果红红溶溶液液会会使使菌菌落之间发生混杂落之间发生混杂(1)由由于于纤纤维维素素、琼琼脂脂和和土土豆豆汁汁中中都都含含有有淀淀粉粉类类物物质质，可可以以使使能能够够产产生生淀淀粉粉酶酶的的微微生生物出现假阳性反应；物出现假阳性反应；(2)有有些些微微生生物物具具有有降降解解色色素素的的能能力力，长长时时间间培培养养会会降降解解刚刚果果红红，从从而而形形成成明明显显的的透透明明圈圈，这
14、这些些微微生生物物与与纤纤维维素素分分解解菌菌不不易易区区分分 【友情提醒】选择培养的目的是增加纤维素分解菌的浓度，确保能够从样品中分离到所需要的微生物。 涉及的微生物技术主要有：培养基的配制、无菌操作技术、稀释涂布平板法、选择培养基的作用、土壤取样等。 【例3】下图为分离并统计分解纤维素的微生物的实验流程，据此回答有关问题： (1)要从富含纤维素的环境中分离纤维素分解菌，从高温热泉中寻找耐热菌，这说明_。 (2)某同学根据需要，配制了纤维素分解菌的培养基如下，整个实验过程严格执行无菌操作。 如 果 将 其 中 的 纤 维 素 粉 换 成 _， 菌 落 数_，即可说明选择培养基的作用。纤维素粉
15、纤维素粉NaNO3Na2HPO4KH2PO45 g1 g1.2 g0.9 gMgSO47H2OKCl酵母膏酵母膏0.5 g0.5 g适量适量 【解析】(1)因为纤维素分解菌与耐热菌有不同的生活习性，生活在不同的环境中，故要根据目的菌株对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。 (2)因为葡萄糖是纤维素水解产生的、能被微生物直接利用的有机小分子，所以如果将其中的纤维素粉换成葡萄糖，纤维素分解菌及其他细菌会生长繁殖得更快，故菌落数明显多于选择培养基。 (3)因为稀释涂布平板法要将菌液进行一系列的梯度稀释，故该法可根据稀释体积计算每克样品中的细菌数，而平板划线法则不能这样，所以本实验宜采用稀释涂布平板
16、法。 【答案】(1)不同的菌株生活在不同的环境中，根据目的菌株对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找 (2)葡萄糖明显多于选择培养基上的菌落数 (3)稀释涂布平板平板划线法难以根据稀释体积计算每克样品中的细菌数1.(2009安徽)下列是关于“检测土壤中细菌总数”实验操作的叙述，其中错误的是( ) A用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板 B取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL，分别涂布于各组平板上 C将实验组和对照组平板倒置，37 恒温培养2448小时 D确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的实验组平板进行计数D 【解析】应选择菌落数在30300的
17、一组平板为代表进行计数。 2.(2010全国)下列是与微生物培养有关的问题，请回答： 某细菌固体培养基的组成成分是KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4、葡萄糖、尿素、琼脂和蒸馏水，其中凝固剂是_，碳源是_，氮源是_。已知只有能合成脲酶的细菌才能在该培养基上生长，故该培养基属于_培养基。按照化学成分分类，该培养基属于_培养基。从同化作用类型上看，用该培养基培养的细菌属于_。琼脂葡萄糖尿素选择合成异养型 【解析】本题主要考查学生的理解能力及微生物的营养。该培养基中，琼脂为凝固剂，葡萄糖为碳源，尿素为氮源；由于只有能合成脲酶的细菌才能在该培养基上生长，可以用来选择出能够合成脲酶的细菌，在功能上称为选择培养基；由于其化学成分明确，故又称为合成培养基；由于该培养基中存在着有机碳源即葡萄糖，故从同化作用类型上推测，用该培养基培养的细菌属于异养型。
