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1、实验四实验四细菌的生理生化试验及肠杆菌科细菌的生理生化试验及肠杆菌科的鉴别、理化因素及生物因素对的鉴别、理化因素及生物因素对微生物的影响微生物的影响一、目的要求一、目的要求掌握细菌鉴定中常用生理生化反应的原理、掌握细菌鉴定中常用生理生化反应的原理、方法、结果判定以及在诊断中的运用方法、结果判定以及在诊断中的运用 熟悉大肠杆菌和沙门菌主要培养特性和常熟悉大肠杆菌和沙门菌主要培养特性和常 规微生物学诊断方法规微生物学诊断方法通过本实验加深理化因素及生物因素对微通过本实验加深理化因素及生物因素对微生物的影响的概念生物的影响的概念二、实验材料二、实验材料 菌种：大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌种：大
2、肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、巴氏杆菌菌、枯草杆菌、巴氏杆菌 培养基：葡萄糖高层琼脂、普通琼脂斜面、培养基：葡萄糖高层琼脂、普通琼脂斜面、水琼脂斜面、氧化水琼脂斜面、氧化-发酵培养基（小生化管）、发酵培养基（小生化管）、普通平板、麦康凯平板、淀粉平板、三糖铁斜普通平板、麦康凯平板、淀粉平板、三糖铁斜面、各类生化反应管等面、各类生化反应管等 器械：砂轮、试管架、接种环、接种针、灭器械：砂轮、试管架、接种环、接种针、灭菌吸管、灭菌刻度移液管、灭菌棉签、胶头、菌吸管、灭菌刻度移液管、灭菌棉签、胶头、灭菌液体石蜡、酒精灯、废报纸等灭菌液体石蜡、酒精灯、废报纸等三、实验内容三、实验内容1、
3、细菌对、细菌对空气（氧气）空气（氧气）的需要的需要菌种：大肠杆菌、枯草杆菌菌种：大肠杆菌、枯草杆菌方法：用吸管将两种菌各加入两支己溶化的葡萄糖方法：用吸管将两种菌各加入两支己溶化的葡萄糖深层琼脂管中，深层琼脂管中，培养基：葡萄糖深层琼脂（己溶化）培养基：葡萄糖深层琼脂（己溶化）2、细菌对、细菌对营养营养的要求的要求菌种：大肠杆菌、巴氏杆菌菌种：大肠杆菌、巴氏杆菌培养基：斜面（水琼脂、普通琼脂）培养基：斜面（水琼脂、普通琼脂）方法：划线的方法方法：划线的方法（一）细菌的生理生化试验（一）细菌的生理生化试验3、细菌、细菌氧化型与发酵型（氧化型与发酵型（O/F）的测定的测定菌种：大肠杆菌、枯草杆菌菌
4、种：大肠杆菌、枯草杆菌培养基：加有葡萄糖和指示剂（培养基：加有葡萄糖和指示剂（1%溴麝香草溴麝香草酚蓝）的微型发酵管酚蓝）的微型发酵管方法：用接种针将两种菌各加入两支发酵管方法：用接种针将两种菌各加入两支发酵管中，从不同菌里各取一管加入灭菌的液体中，从不同菌里各取一管加入灭菌的液体石蜡，石蜡，37 正置培养。正置培养。产酸（产酸（浅绿色浅绿色 黄色黄色 ）4、淀粉水解淀粉水解试验试验菌种：大肠杆菌、枯草杆菌菌种：大肠杆菌、枯草杆菌培养基：普通营养琼脂平板培养基：普通营养琼脂平板方法：一块平板上，一边划大肠杆菌，一边划枯草杆方法：一块平板上，一边划大肠杆菌，一边划枯草杆菌，第二天长出菌后，在菌落
5、上滴加碘液。菌，第二天长出菌后，在菌落上滴加碘液。5、触酶触酶（过氧化氢酶）试验（过氧化氢酶）试验菌种：大肠杆菌、枯草杆菌菌种：大肠杆菌、枯草杆菌培养基：普通营养琼脂平板培养基：普通营养琼脂平板方法：一块平板上，一边划大肠杆菌，一边划枯草杆方法：一块平板上，一边划大肠杆菌，一边划枯草杆菌，第二天长出菌后，在菌落上滴加菌，第二天长出菌后，在菌落上滴加H2O2（二）肠杆菌科的鉴别（大肠杆菌二）肠杆菌科的鉴别（大肠杆菌&沙门菌）沙门菌）肠杆菌科的生化试验肠杆菌科的生化试验1、麦康凯琼脂平板、麦康凯琼脂平板（乳糖、胆盐、指示剂：（乳糖、胆盐、指示剂：1%中性红）中性红）方法：划线，分解乳糖方法：划线，
6、分解乳糖 菌落变菌落变红红2、三糖铁琼脂斜面、三糖铁琼脂斜面（葡萄糖、蔗糖、乳糖、硫酸亚铁铵、指示（葡萄糖、蔗糖、乳糖、硫酸亚铁铵、指示剂：剂：0.5%酚红）酚红）方法：先划斜面再穿刺方法：先划斜面再穿刺3、糖分解试验、糖分解试验微量发酵管：葡萄糖、乳糖、甘露醇、蔗糖微量发酵管：葡萄糖、乳糖、甘露醇、蔗糖方法：用接种针挑取菌种后接入发酵管内，用报纸包好方法：用接种针挑取菌种后接入发酵管内，用报纸包好口，置培养箱培养。发酵糖产酸：指示剂溴甲酚蓝由口，置培养箱培养。发酵糖产酸：指示剂溴甲酚蓝由紫色紫色 黄色黄色4、吲哚（靛基质）试验、吲哚（靛基质）试验培养基：蛋白胨水微量管培养基：蛋白胨水微量管原
7、理：细菌分解蛋白质中的色氨酸产生吲哚，吲哚与对原理：细菌分解蛋白质中的色氨酸产生吲哚，吲哚与对位二甲基氨基苯甲醛作用形成玫瑰吲哚而成位二甲基氨基苯甲醛作用形成玫瑰吲哚而成红色红色。方法：接种针接种，培养方法：接种针接种，培养12-24 h后，加入试剂显色后，加入试剂显色5、甲基红（、甲基红（MR）试验）试验培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基：葡萄糖蛋白胨水原理：甲基红试验：原理：甲基红试验： 分解葡萄糖产生丙酮酸，进分解葡萄糖产生丙酮酸，进一步分解为甲酸、乙酸、乳酸等使一步分解为甲酸、乙酸、乳酸等使pH下降，含下降，含甲基红指示剂的培养基变甲基红指示剂的培养基变红红 6、VP试验：葡萄糖蛋白胨水试验
8、：葡萄糖蛋白胨水原理：某些菌发酵葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸经原理：某些菌发酵葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸经多脱羧、氧化等反应生成二乙酰，其与蛋白胨多脱羧、氧化等反应生成二乙酰，其与蛋白胨中精氨酸胍基作用产生粉中精氨酸胍基作用产生粉红色红色化合物化合物7、枸橼酸盐（柠檬酸盐）利用试验、枸橼酸盐（柠檬酸盐）利用试验培养基：培养基：Simmon氏枸橼酸钠微量发酵管氏枸橼酸钠微量发酵管原理：细菌若能以枸橼酸钠为唯一碳源，磷酸铵原理：细菌若能以枸橼酸钠为唯一碳源，磷酸铵为唯一氮源，则可利用枸橼酸钠产生碳酸盐，为唯一氮源，则可利用枸橼酸钠产生碳酸盐，与利用铵盐产生的与利用铵盐产生的NH3反应，形成反应，形成NH
9、4OH，使，使培养基变碱，培养基变碱，pH升高，指示剂溴麝香草芬蓝由升高，指示剂溴麝香草芬蓝由草绿色草绿色变为变为深蓝色深蓝色。8、脲酶、脲酶培养基：尿素微量发酵管（指示剂：酚红）培养基：尿素微量发酵管（指示剂：酚红）原理：细菌分解尿素产生原理：细菌分解尿素产生2分子分子NH4，使，使pH升高，升高，指示剂变指示剂变红红。9、硫化氢试验、硫化氢试验培养基：营养琼脂中含培养基：营养琼脂中含FeSO4的的微量反应管微量反应管原理：凡细菌能分解含硫氨基酸，产生原理：凡细菌能分解含硫氨基酸，产生H2S者，者，其所产生的其所产生的H2S会使培养基中的醋酸铅或会使培养基中的醋酸铅或FeCl3形成形成黑色黑
10、色的硫化铅或硫化铁。的硫化铅或硫化铁。10、运动力试验、运动力试验培养基：半固体琼脂微量反应管培养基：半固体琼脂微量反应管方法：穿刺接种方法：穿刺接种（三）理化因素及生物因素对微生物的影响（三）理化因素及生物因素对微生物的影响1.紫外线与杀菌试验紫外线与杀菌试验菌种：菌种： 大肠杆菌、枯草杆菌大肠杆菌、枯草杆菌方法：取营养琼脂平板方法：取营养琼脂平板2个，一个涂大肠杆菌，另一个，一个涂大肠杆菌，另一个涂枯草杆菌。在其涂有细菌的表面贴上以剪出不个涂枯草杆菌。在其涂有细菌的表面贴上以剪出不同图案的硬纸片，然后在紫外灯下距离同图案的硬纸片，然后在紫外灯下距离30厘米照射厘米照射20分钟，照射完毕将硬
11、纸片取走盖回原来平皿盖，分钟，照射完毕将硬纸片取走盖回原来平皿盖，于于37培养培养24小时观察结果。小时观察结果。2.药敏试验：圆纸片扩散法药敏试验：圆纸片扩散法菌种：菌种： 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌培养基：营养琼脂平板培养基：营养琼脂平板方法：方法：3.消毒剂抑菌和杀菌试验消毒剂抑菌和杀菌试验菌种：大肠杆菌、枯草杆菌菌种：大肠杆菌、枯草杆菌方法：与药敏试验方法是一样的（纸片扩散法）方法：与药敏试验方法是一样的（纸片扩散法）将以上接好细菌的培养基置将以上接好细菌的培养基置37培养培养箱培养。箱培养。经经1824h培养观察细菌生长情况。培养观察细菌生长情况。有一些生化管有一些生化管则则需要加试剂后观察其需要加试剂后观察其颜色变化，做好实验结果记录并记录颜色变化，做好实验结果记录并记录抑菌圈大小抑菌圈大小。肠杆菌科细菌的鉴别肠杆菌科细菌的鉴别三糖铁琼脂斜面三糖铁琼脂斜面斜面斜面/底层底层产气；产气；H2S糖发酵糖发酵葡葡萄萄糖糖乳乳糖糖蔗蔗糖糖甘甘露露醇醇MR VP靛靛基基质质枸枸橼橼酸酸盐盐脲脲酶酶麦麦康康凯凯H2S运运动动力力试验试验结果结果菌种菌种大肠杆菌大肠杆菌沙门菌沙门菌K / A+(-) ; - A=产酸（黄） K=产碱（红）+ - +
