实训五培养基制备和灭菌 一、实验目的一、实验目的 1.1.学会一般培养基的制备原理、方法学会一般培养基的制备原理、方法 2.2.掌握培养基及器皿的灭菌方法掌握培养基及器皿的灭菌方法实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌 培养基是根据微生物生长繁殖的营养需要，培养基是根据微生物生长繁殖的营养需要，用人工方法配制而成的基质用人工方法配制而成的基质, ,其中含有水、碳源、其中含有水、碳源、氮源、无机盐及各种生长因子培养基可为微生氮源、无机盐及各种生长因子培养基可为微生物的生长提供能源、组成菌体的原料，调节代谢物的生长提供能源、组成菌体的原料，调节代谢活动 二、实验原理二、实验原理实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌 不同微生物对营养物质的要求各不相同不同微生物对营养物质的要求各不相同因此，配制培养基要根据微生物的营养特点因此，配制培养基要根据微生物的营养特点一般，培养细菌常用牛肉膏蛋白胨培养基，一般，培养细菌常用牛肉膏蛋白胨培养基，培养放线菌常用淀粉培养基，培养霉菌常用培养放线菌常用淀粉培养基，培养霉菌常用马铃薯培养基，培养酵母菌常用麦芽汁培养马铃薯培养基，培养酵母菌常用麦芽汁培养基基( (或麦芽糖、蛋白胨培养基或麦芽糖、蛋白胨培养基) )。
二、实验原理二、实验原理实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌 培养基除了要满足微生物生长所要求的培养基除了要满足微生物生长所要求的各种营养物质外，还应保证微生物所需要的各种营养物质外，还应保证微生物所需要的其他生活条件，如适宜的酸碱度，渗透压等，其他生活条件，如适宜的酸碱度，渗透压等，因此，根据不同种类微生物的要求，应将培因此，根据不同种类微生物的要求，应将培养基调节到一定的养基调节到一定的pHpH范围，如细菌培养基中范围，如细菌培养基中性偏碱，放线菌培养基偏碱，霉菌、酵母菌性偏碱，放线菌培养基偏碱，霉菌、酵母菌培养基偏酸培养基偏酸二、实验原理二、实验原理实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌 根据研究的不同，可以将培养基制成固体、根据研究的不同，可以将培养基制成固体、半固体和液体三种形式，固体培养基的成分半固体和液体三种形式，固体培养基的成分与液体培养基相同，仅在液体培养基中加入与液体培养基相同，仅在液体培养基中加入凝固剂作支持物，通常加入～％的琼脂，半凝固剂作支持物，通常加入～％的琼脂，半固体培养基加入～％琼脂作支持物，有时也固体培养基加入～％琼脂作支持物，有时也可用明胶或硅胶作为凝固剂。
可用明胶或硅胶作为凝固剂二、实验原理二、实验原理实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌 1.1.材料材料 马铃薯、蔗糖、牛肉膏、蛋白胨、马铃薯、蔗糖、牛肉膏、蛋白胨、可溶性淀粉、琼脂、可溶性淀粉、琼脂、K K2 2HP0HP04 4、、MgS0MgS04 4·7H7H2 2O O、、FeS0FeS04 4·7H7H2 20 0、、NaOHNaOH、、HClHCl 2.2.用具用具 试管、三角烧瓶、漏斗、量筒、吸试管、三角烧瓶、漏斗、量筒、吸管、烧杯、纱布、棉花、玻璃棒、管、烧杯、纱布、棉花、玻璃棒、pHpH试纸、铁试纸、铁架台、漏斗架、止水夹、电炉、台秤、硫酸纸、架台、漏斗架、止水夹、电炉、台秤、硫酸纸、药匙、牛皮纸、线绳、标签纸、剪刀、解剖刀、药匙、牛皮纸、线绳、标签纸、剪刀、解剖刀、镊子、白瓷盘、镊子、白瓷盘、( (比色盘比色盘) )铁丝筐 三、实验材料和用具三、实验材料和用具实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌 1.1.培养基的制作方法培养基的制作方法 (1)(1)称量称量 按照培养基的配方，准确称取各成分按照培养基的配方，准确称取各成分于烧杯中。
于烧杯中 (2)(2)溶解、加热溶解、加热 向上述烧杯中加入所需要水量，向上述烧杯中加入所需要水量，搅动，然后加热使其溶解用马铃薯、豆芽等配制搅动，然后加热使其溶解用马铃薯、豆芽等配制的培养基，须先将马铃薯或豆芽按其配方的浓度加的培养基，须先将马铃薯或豆芽按其配方的浓度加热煮沸热煮沸0.5h (0.5h (马铃薯须先削皮马铃薯须先削皮) )并用纱布过滤，然并用纱布过滤，然后加入其他成分继续加热使其溶化，补足水量，如后加入其他成分继续加热使其溶化，补足水量，如果配方中含有淀粉，则需先将淀粉加热煮融，再加果配方中含有淀粉，则需先将淀粉加热煮融，再加人其他药品，并补足水量人其他药品，并补足水量 四、实验方法四、实验方法实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌 (3)(3)(3)(3)调节调节调节调节pHpHpHpH值值值值 初制备好的培养基往往不能符合所初制备好的培养基往往不能符合所初制备好的培养基往往不能符合所初制备好的培养基往往不能符合所要求的要求的要求的要求的pHpHpHpH值，故需用酸度计，值，故需用酸度计，值，故需用酸度计，值，故需用酸度计，pHpHpHpH试纸或用氢离子浓试纸或用氢离子浓试纸或用氢离子浓试纸或用氢离子浓度比色计来矫正，用或度比色计来矫正，用或度比色计来矫正，用或度比色计来矫正，用或lmol/L HCllmol/L HCllmol/L HCllmol/L HCl调至合适的范围。
调至合适的范围调至合适的范围调至合适的范围 (4)(4)(4)(4)过滤过滤过滤过滤 用滤纸或双层纱布用滤纸或双层纱布用滤纸或双层纱布用滤纸或双层纱布( ( ( (中间夹一层脱脂棉花中间夹一层脱脂棉花中间夹一层脱脂棉花中间夹一层脱脂棉花) ) ) )趁热过滤趁热过滤趁热过滤趁热过滤 (5)(5)(5)(5)分装分装分装分装 根据不同的需要，可将制好的培养基分根据不同的需要，可将制好的培养基分根据不同的需要，可将制好的培养基分根据不同的需要，可将制好的培养基分装入试管或三角烧瓶内，管装入试管或三角烧瓶内，管装入试管或三角烧瓶内，管装入试管或三角烧瓶内，管( ( ( (瓶瓶瓶瓶) ) ) )口塞上棉塞口塞上棉塞口塞上棉塞口塞上棉塞( ( ( (或硅胶或硅胶或硅胶或硅胶泡沫塞泡沫塞泡沫塞泡沫塞) ) ) )，用牛皮纸包扎管，用牛皮纸包扎管，用牛皮纸包扎管，用牛皮纸包扎管( ( ( (瓶瓶瓶瓶) ) ) )口 四、实验方法四、实验方法实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌 培养基的分装培养基的分装 实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌 ①①①①液体培养基：分装高度以试管高度的液体培养基：分装高度以试管高度的液体培养基：分装高度以试管高度的液体培养基：分装高度以试管高度的1/41/41/41/4左右为左右为左右为左右为宜。
宜 ② ② ② ②固体培养基：分装试管，每管装液量为管高的固体培养基：分装试管，每管装液量为管高的固体培养基：分装试管，每管装液量为管高的固体培养基：分装试管，每管装液量为管高的1/51/51/51/5，灭菌后制成斜面分装三角烧瓶的量以不超过，灭菌后制成斜面分装三角烧瓶的量以不超过，灭菌后制成斜面分装三角烧瓶的量以不超过，灭菌后制成斜面分装三角烧瓶的量以不超过1/21/21/21/2为宜；倒平板的培养基每管装为宜；倒平板的培养基每管装为宜；倒平板的培养基每管装为宜；倒平板的培养基每管装15151515～～～～20mL20mL20mL20mL ③ ③ ③ ③半固体培养基：分装试管一般以管高度半固体培养基：分装试管一般以管高度半固体培养基：分装试管一般以管高度半固体培养基：分装试管一般以管高度1/31/31/31/3为宜，为宜，为宜，为宜，灭菌后制成斜面或垂直待凝成半固体深层琼脂灭菌后制成斜面或垂直待凝成半固体深层琼脂灭菌后制成斜面或垂直待凝成半固体深层琼脂灭菌后制成斜面或垂直待凝成半固体深层琼脂四、实验方法四、实验方法实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌 斜面的摆法斜面的摆法实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌 (6)(6)灭菌高压蒸汽灭菌，一般培养基，灭菌高压蒸汽灭菌，一般培养基，灭菌高压蒸汽灭菌，一般培养基，灭菌高压蒸汽灭菌，一般培养基，20-20-30min30min，含糖培养基为，，含糖培养基为，，含糖培养基为，，含糖培养基为，30min30min。
四、实验方法四、实验方法实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌 （一）根据配制培养基的步骤（一）根据配制培养基的步骤, ,按下列培按下列培养基配方配制培养基养基配方配制培养基 1.1.肉膏蛋白培养基肉膏蛋白培养基(W/V)((W/V)(培养细菌用培养细菌用) ) 牛肉膏牛肉膏 0.3g 0.3g 琼脂琼脂 蛋白胨蛋白胨 1.0g 1.0g 蒸馏水蒸馏水 100ML100ML五、实验内容五、实验内容实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌 2.2.马铃薯马铃薯(PDA)(PDA)培养基培养基(W/V)((W/V)(培养霉菌用培养霉菌用) ) 马铃薯马铃薯 20g 20g 蒸馏水蒸馏水 100mL100mL 蔗糖蔗糖 2.0g pH 2.0g pH 自然自然 琼脂琼脂 马铃薯汁制备：将马铃薯去皮，称量所需重马铃薯汁制备：将马铃薯去皮，称量所需重量，切成小块量，切成小块, ,加水煮沸加水煮沸30min,30min,纱布过滤，补足纱布过滤，补足水量。
水量 五、实验内容五、实验内容实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌 3 3 3 3. . . .高氏高氏高氏高氏1 1 1 1号号号号(W/V)((W/V)((W/V)((W/V)(培养放线菌用培养放线菌用培养放线菌用培养放线菌用) ) ) ) 可溶性淀粉可溶性淀粉可溶性淀粉可溶性淀粉 2.0g FeSO2.0g FeSO2.0g FeSO2.0g FeSO4 4 4 4 K K K K2 2 2 2HP0HP0HP0HP04 4 4 4 0.05g 0.05g 0.05g 0.05g 琼脂琼脂琼脂琼脂 MgS0 MgS0 MgS0 MgS04 4 4 4· ·7H7H7H7H2 2 2 20 0.05g 0 0.05g 0 0.05g 0 0.05g 蒸馏水蒸馏水蒸馏水蒸馏水 100mL100mL100mL100mL KNO KNO KNO KNO3 3 3 3 NaCl 0.05g NaCl 0.05g NaCl 0.05g NaCl 0.05g 五、实验内容五、实验内容 配制时，先用少量蒸馏水将可溶性淀粉调成配制时，先用少量蒸馏水将可溶性淀粉调成配制时，先用少量蒸馏水将可溶性淀粉调成配制时，先用少量蒸馏水将可溶性淀粉调成糊状，在沸水浴中搅拌，煮融，再加入其他成分，糊状，在沸水浴中搅拌，煮融，再加入其他成分，糊状，在沸水浴中搅拌，煮融，再加入其他成分，糊状，在沸水浴中搅拌，煮融，再加入其他成分，补足水量，压力，灭菌补足水量，压力，灭菌补足水量，压力，灭菌补足水量，压力，灭菌20min.20min.20min.20min.实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌 1.1.1.1.加热溶化过程中，要不断搅拌，以免琼脂或其加热溶化过程中，要不断搅拌，以免琼脂或其加热溶化过程中，要不断搅拌，以免琼脂或其加热溶化过程中，要不断搅拌，以免琼脂或其他固体物质粘在烧杯底上烧焦，造成烧杯破裂，加他固体物质粘在烧杯底上烧焦，造成烧杯破裂，加他固体物质粘在烧杯底上烧焦，造成烧杯破裂，加他固体物质粘在烧杯底上烧焦，造成烧杯破裂，加热过程中所蒸发的水分应补足。
热过程中所蒸发的水分应补足热过程中所蒸发的水分应补足热过程中所蒸发的水分应补足 值必须按各种不同培养基的要求准确测定值必须按各种不同培养基的要求准确测定值必须按各种不同培养基的要求准确测定值必须按各种不同培养基的要求准确测定 3.3.3.3.所用器皿要洁净，勿用铜质和铁质器皿保证所用器皿要洁净，勿用铜质和铁质器皿保证所用器皿要洁净，勿用铜质和铁质器皿保证所用器皿要洁净，勿用铜质和铁质器皿保证容器外壁无水容器外壁无水容器外壁无水容器外壁无水 （二）培养基制作注意事项（二）培养基制作注意事项五、实验内容五、实验内容实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌 4.4.分装培养塞时，注意不得使培养基在瓶分装培养塞时，注意不得使培养基在瓶口或管壁上端沾染，以免引起杂菌污染口或管壁上端沾染，以免引起杂菌污染5.5.培养基的灭菌时间和温度，需按照各种培养基的灭菌时间和温度，需按照各种培养基的规定进行，以保证杀菌效果和培养基的规定进行，以保证杀菌效果和不损失培养基的必要成分，培养基灭菌不损失培养基的必要成分，培养基灭菌后，必须放在后，必须放在3737ºC C温箱培育温箱培育24h24h．无菌生．无菌生长方可使用。
长方可使用五、实验内容五、实验内容实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌 棉塞可过滤空气，防止杂菌侵入并可减缓培养基棉塞可过滤空气，防止杂菌侵入并可减缓培养基棉塞可过滤空气，防止杂菌侵入并可减缓培养基棉塞可过滤空气，防止杂菌侵入并可减缓培养基水分的蒸发，所以正确地制备棉塞是培养基制备中重水分的蒸发，所以正确地制备棉塞是培养基制备中重水分的蒸发，所以正确地制备棉塞是培养基制备中重水分的蒸发，所以正确地制备棉塞是培养基制备中重要的一环正确的棉塞是形状大小，松紧应与试管要的一环正确的棉塞是形状大小，松紧应与试管要的一环正确的棉塞是形状大小，松紧应与试管要的一环正确的棉塞是形状大小，松紧应与试管( ( ( (或三角烧瓶或三角烧瓶或三角烧瓶或三角烧瓶) ) ) )完全适合过紧时妨碍空气流通，操作完全适合过紧时妨碍空气流通，操作完全适合过紧时妨碍空气流通，操作完全适合过紧时妨碍空气流通，操作不便；过松时，空气会毫无障碍地进入试管不便；过松时，空气会毫无障碍地进入试管不便；过松时，空气会毫无障碍地进入试管不便；过松时，空气会毫无障碍地进入试管( ( ( (或三角或三角或三角或三角烧瓶烧瓶烧瓶烧瓶) ) ) )中，达不到过滤杂菌的目的。
棉塞过小往往易中，达不到过滤杂菌的目的棉塞过小往往易中，达不到过滤杂菌的目的棉塞过小往往易中，达不到过滤杂菌的目的棉塞过小往往易掉进试管内正确的棉塞头较大，约有掉进试管内正确的棉塞头较大，约有掉进试管内正确的棉塞头较大，约有掉进试管内正确的棉塞头较大，约有1/31/31/31/3在外，在外，在外，在外，2/32/32/32/3在试管内在试管内在试管内在试管内三）（三）棉塞制作棉塞制作五、实验内容五、实验内容实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌 棉塞制作棉塞制作实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌 目前，有条件的实验室已使用目前，有条件的实验室已使用目前，有条件的实验室已使用目前，有条件的实验室已使用. . . .塑料试塑料试塑料试塑料试管帽、金属试管帽、硅胶泡沫塞替代棉塞，管帽、金属试管帽、硅胶泡沫塞替代棉塞，管帽、金属试管帽、硅胶泡沫塞替代棉塞，管帽、金属试管帽、硅胶泡沫塞替代棉塞，此处介绍棉塞的制作，以备不时之需此处介绍棉塞的制作，以备不时之需。
此处介绍棉塞的制作，以备不时之需此处介绍棉塞的制作，以备不时之需五、实验内容五、实验内容实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌 1.1.培养基的高压蒸汽灭菌培养基的高压蒸汽灭菌 ① ①需灭菌的物品需灭菌的物品( (分装在试管、三角烧瓶中的分装在试管、三角烧瓶中的固、液体培养基固、液体培养基) )，棉塞、硅胶泡沫塞等用防潮，棉塞、硅胶泡沫塞等用防潮纸包好纸包好( (防止锅内水汽把棉塞淋湿防止锅内水汽把棉塞淋湿) )，放人灭菌锅，放人灭菌锅内的套筒中摆放要疏松，不可太挤，否则阻碍内的套筒中摆放要疏松，不可太挤，否则阻碍蒸汽流通，影响灭菌效果蒸汽流通，影响灭菌效果 （四）灭菌四）灭菌五、实验内容五、实验内容实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌 ②②将灭菌锅盖的排气管插入套筒侧壁的凹槽内，将灭菌锅盖的排气管插入套筒侧壁的凹槽内，关闭灭菌锅盖旋紧螺栓，切勿漏气关闭灭菌锅盖旋紧螺栓，切勿漏气 ③③打开放气阀，加热，热蒸汽上升，以排除锅打开放气阀，加热，热蒸汽上升，以排除锅内冷空气，排气约内冷空气，排气约5 5～～10min10min，关闭放气阀。
关闭放气阀五、实验内容五、实验内容实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌 ④④④④关闭放气阀后，整个灭菌锅成为密闭状态，而蒸关闭放气阀后，整个灭菌锅成为密闭状态，而蒸关闭放气阀后，整个灭菌锅成为密闭状态，而蒸关闭放气阀后，整个灭菌锅成为密闭状态，而蒸汽又不断增多，这时压力和温度都上升，当温度升至汽又不断增多，这时压力和温度都上升，当温度升至汽又不断增多，这时压力和温度都上升，当温度升至汽又不断增多，这时压力和温度都上升，当温度升至121121121121º ºC C C C，压力达时，保持，压力达时，保持，压力达时，保持，压力达时，保持20202020～～～～ 30min30min30min30min，即达到灭菌目的即达到灭菌目的即达到灭菌目的即达到灭菌目的 ⑤ ⑤ ⑤ ⑤灭菌完毕，待压力自然降至灭菌完毕，待压力自然降至灭菌完毕，待压力自然降至灭菌完毕，待压力自然降至“ “0 0 0 0” ”时，打开放气阀，时，打开放气阀，时，打开放气阀，时，打开放气阀，注意不能打开过早，否则突然降压致使培养基冲腾，注意不能打开过早，否则突然降压致使培养基冲腾，注意不能打开过早，否则突然降压致使培养基冲腾，注意不能打开过早，否则突然降压致使培养基冲腾，使棉塞、硅胶泡沫塞沾污，甚至冲出容器以外。
使棉塞、硅胶泡沫塞沾污，甚至冲出容器以外使棉塞、硅胶泡沫塞沾污，甚至冲出容器以外使棉塞、硅胶泡沫塞沾污，甚至冲出容器以外 ⑥ ⑥ ⑥ ⑥打开灭菌锅盖，取出已灭菌的器皿及培养基打开灭菌锅盖，取出已灭菌的器皿及培养基打开灭菌锅盖，取出已灭菌的器皿及培养基打开灭菌锅盖，取出已灭菌的器皿及培养基 五、实验内容五、实验内容实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌 2.2.干热灭菌法干热灭菌法 常用于空玻璃器皿的灭菌，但凡带有橡胶或塑常用于空玻璃器皿的灭菌，但凡带有橡胶或塑常用于空玻璃器皿的灭菌，但凡带有橡胶或塑常用于空玻璃器皿的灭菌，但凡带有橡胶或塑料的物品、液体及固体培养基等，都不能用于干料的物品、液体及固体培养基等，都不能用于干料的物品、液体及固体培养基等，都不能用于干料的物品、液体及固体培养基等，都不能用于干热法灭菌进行灭菌时，先将要灭菌器皿热法灭菌进行灭菌时，先将要灭菌器皿热法灭菌进行灭菌时，先将要灭菌器皿热法灭菌进行灭菌时，先将要灭菌器皿( ( ( (培养皿、培养皿、培养皿、培养皿、吸管的包装方法见示范吸管的包装方法见示范吸管的包装方法见示范吸管的包装方法见示范) ) ) )包好，放入电热烘箱内，包好，放入电热烘箱内，包好，放入电热烘箱内，包好，放入电热烘箱内，调节温度至调节温度至调节温度至调节温度至160160160160～～～～170170170170º ºC C C C，维持，维持，维持，维持1 1 1 1～～～～2h(2h(2h(2h(当温度升至当温度升至当温度升至当温度升至80808080º ºC C C C以上切勿打开烤箱，以免引起玻璃器皿破裂以上切勿打开烤箱，以免引起玻璃器皿破裂以上切勿打开烤箱，以免引起玻璃器皿破裂以上切勿打开烤箱，以免引起玻璃器皿破裂和火灾和火灾和火灾和火灾) ) ) )。
灭菌后，当温度降至灭菌后，当温度降至灭菌后，当温度降至灭菌后，当温度降至30303030～～～～40404040º ºC C C C时，打开时，打开时，打开时，打开箱门，取出灭菌器皿箱门，取出灭菌器皿箱门，取出灭菌器皿箱门，取出灭菌器皿 五、实验内容五、实验内容实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌 写出你所制备的培养基的配方，并写出你所制备的培养基的配方，并分析其中所含物质对微生物生命活动所分析其中所含物质对微生物生命活动所起的作用起的作用 六、实验报告六、实验报告实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌实训五培养基制备和灭菌 。