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1、分子生物学研究法分子生物学n基因操作基因操作nDNA分子的切割与连接n核酸分子杂交n凝胶电泳n细胞转化n核酸序列分析以及基因的人工合成n定点突变和PCR扩增等n基因工程基因工程n是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其他载体分子中，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。 是分子生物学研究的核心技术基因操作基因操作重组DNA技术史上的主要事件重组DNA实验中常见的主要工具酶 限制性核酸内切酶DNA连接酶DNA聚合酶I(大肠杆菌)反转录酶多核苷酸激酶末端转移酶DNA外切酶噬菌体DNA外切酶碱性磷酸酯酶n识别并在特定位点切开DNAn通过磷酸二酯键把两个或
2、多个DNA片段连接成一个DNA分子n按5到3方向加入新的按苷酸，补平DNA双链中的缺口n按照RNA分子中的碱基序列，根据碱基互补原则合成DNA链n把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5OH末端(进行末端标记实验或用来进行DNA的连接) n在双链核酸的3末端加上多聚单核苷酸n从DNA链的3末端逐个切除单核苷酸n从DNA链的5末端逐个切除单核苷酸n切除位于DNA链5或3末端的磷酸基团 DNA连接酶DNA的粘性末端 DNA的平末端 化学合成的具有Eco R I粘性末端的DNA片段 重组DNA 操作过程外源DNA导入的实验证明 (1)像pSCl01这样的质粒DNA分子可以作为基因克隆的载体，从而把外源DNA导
3、人寄主细胞；(2)像非洲爪蟾这样的高等生物的基因也可以被成功地转移到原核细胞中并实现其功能表达；(3)质粒DNA大肠杆菌细胞作为一种成功的基因克隆体系，有可能在重组DNA或基因工程研究中发挥重要作用。主要DNA操作技术 n核酸的凝胶电泳n核酸的分子杂交n细菌转化n核苷酸序列分析n基因扩增nDNA与蛋白质相互作用研究核酸的凝胶电泳n原理n一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向适当的电极。n这种电泳分子在电场作用下的迁移速度电泳的迁移率。 n电泳的迁移率影响因素n净电荷n分子大小 n分子构型 核酸的凝胶电泳核酸的分子杂交细菌转化核苷酸序列分析基因扩增DNA与蛋白质相互作用研究核酸的凝胶电泳
4、n核酸主要电泳方法n琼脂糖凝胶电泳n分辨率 分辨范围0.250kbn聚丙烯酰胺凝胶 n分辨率 分辨范围11000bpn脉冲电场凝胶电泳n分辨率 分辨范围107bp核酸的凝胶电泳核酸的分子杂交细菌转化核苷酸序列分析基因扩增DNA与蛋白质相互作用研究核酸的凝胶电泳核酸的分子杂交细菌转化核苷酸序列分析基因扩增DNA与蛋白质相互作用研究EB 溴乙锭检测核酸原理核酸的凝胶电泳核酸的分子杂交细菌转化核苷酸序列分析基因扩增DNA与蛋白质相互作用研究DNA脉冲电场凝胶电泳示意图 核酸的凝胶电泳核酸的分子杂交细菌转化核苷酸序列分析基因扩增DNA与蛋白质相互作用研究核酸的分子杂交n将带有互补的特定核苷酸序列的单链
5、DNA或RNA混合在一起，其相应的同源区段就会退火形成双链结构。n如果退火的核酸来自不同的生物有机体，所形成的双链分子就被称为杂种核酸分子。 核酸的凝胶电泳核酸的分子杂交细菌转化核苷酸序列分析基因扩增DNA与蛋白质相互作用研究Southern Blotting核酸的凝胶电泳核酸的分子杂交细菌转化核苷酸序列分析基因扩增DNA与蛋白质相互作用研究核酸的分子杂交核酸的凝胶电泳核酸的分子杂交细菌转化核苷酸序列分析基因扩增DNA与蛋白质相互作用研究基因芯片核酸的凝胶电泳核酸的分子杂交细菌转化核苷酸序列分析基因扩增DNA与蛋白质相互作用研究细菌转化n一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA而导致性
6、状特征发生遗传改变的生命过程n提供转化DNA的菌株叫作供体菌株n接受转化DNA的细菌菌株则被称为受体菌株核酸的凝胶电泳核酸的分子杂交细菌转化核苷酸序列分析基因扩增DNA与蛋白质相互作用研究核苷酸序列分析nSanger双脱氧链终止法 nMaxamGilbert化学修饰法 nDNA序列分析的自动化nDNA杂交测序法(SBH) 核酸的凝胶电泳核酸的分子杂交细菌转化核苷酸序列分析基因扩增DNA与蛋白质相互作用研究Sanger双脱氧链终止法DNA序列分析的自动化 DNA杂交测序法(SBH)DNA杂交测序法(SBH) 基因扩增nPCR flashn反向PCR 核酸的凝胶电泳核酸的分子杂交细菌转化核苷酸序列
7、分析基因扩增DNA与蛋白质相互作用研究反向PCR(a)用一种在靶序列上没有切点的限制性核酸内切酶消化大相对分子质量DNA(b)产生大小不同的线性DNA片段群体，其中靶DNA区段的DNA分子长度不超过2-3kb，经连接后重新环化；(c)按靶序列设计的一对引物与互补序列退火结合，其延伸方向如箭头所指；(d)经PCB扩增产生的主要是线性双链DNA分子，它是由左侧序列和右侧序列首尾连接而成，其接点是(a)中所用的限制性内切酶的识别位点DNA与蛋白质相互作用研究n凝胶阻滞试验nDNase I足迹试验 n基因芯片技术 核酸的凝胶电泳核酸的分子杂交细菌转化核苷酸序列分析基因扩增DNA与蛋白质相互作用研究基因
8、芯片半位点法基因工程基因工程载体基因克隆的主要载体系统 n质粒DNA分离纯化n载体系统n常用Vectors pUC18 DNA pUC19 DNA pUC118 DNA pUC119 DNA pUC118 EcoR I / BAP pUC118 BamH I / BAP pUC118 Hinc II / BAP pUC118 Pst I / BAP pUC118 Hind III / BAP pBR322 DNA n SiRNA表达用载体 pSINsi Vector Series pSINsi Primer Set pBAsi Vector Series n PCR产物克隆用载体 pMD18-
9、T Vector pMD19-T Vector pMD18-T Simple Vector pMD19-T Simple Vector pSIMPLE-18 EcoR V/BAP Vector pSIMPLE-19 EcoR V/BAP Vector n Sequencing Primers M13 Primers BcaBESTTM Sequencing Primers gt10/11 Primers SP6 Promoter Primer n Oligo dT Primers Oligo d(T)15 Oligo d(T)18 n Random Primers Hexadeoxyribon
10、ucleotide mixture; pd (N)6 Nonadeoxyribonucleotide mixture; pd (N)9 n Linkers Phosphorylated Linkers Nonphosphorylated Linkers n Adaptors Adaptors EcoR I - Not I - BamH I Adaptor 氯化铯密度梯度离心法 基因的分离与鉴定基因克隆n四个基本步骤：(1)用于基因克隆的DNA材料的选择以及DNA分子的片段化；(2)外源DNA片段与载体分子的体外连接反应；(3)将人工重组的DNA分子导人它们能够进行正常复制的寄主细胞；(4)重组
11、体分子的转化子克隆的选择或筛选。DNA片段的产生与分离 n鸟枪法(shotgun approach) n局部双酶消化法 重组体DNA分子的构建 n外源DNA片段定向定向插入载体分子 重组体分子导入受体细胞的途径n将外源重组体分子导入受体细胞的主要途径包括:n转化(或转染)n转导n显微注射n电穿孔等。 cDNA基因克隆 高等生物一般具有35万种左右不同的基因 在一定时间阶段的单个细胞或组织中，仅有15左右的基因得以表达 ?分离到目的基因片段?如何实现高质量mRNA的制备 ?克隆基因的分离 n应用核酸探针分离n应用mRNA差别显示技术分离n应用cDNA差示分析法(representational difference analysis，RDA) n应用酵母双杂交体系(twohybrid system) n基因的图位克隆法(mapbasedcloning) n用DNA微列阵技术(DNA microarray)n应用mRNA差别显示技术分离n应用cDNA差示分析法(representational difference analysis，RDA) n应用酵母双杂交体系(twohybrid system) n基因的图位克隆法map-based cloning用用DNA微列阵技术微列阵技术
