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1、血清蛋白的分离血清蛋白的分离- 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳法法一、实验目的一、实验目的1)1)学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理2) 2) 掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的操作技术的操作技术二二. . 基本原理基本原理( (一一) ) 电泳电泳 电泳电泳: : 带电颗粒在电场的作用下带电颗粒在电场的作用下, ,向着与其电性相向着与其电性相反的电极移动的现象反的电极移动的现象. .( (二二) ) 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 用丙烯酰胺用丙烯酰胺( (AcrAcr) )单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺( (Bis
2、Bis) )在催化剂作用下聚合成的多孔介质在催化剂作用下聚合成的多孔介质. .以此凝胶为支以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳( (简称简称PAGEPAGE) )。 1. 1. 聚丙烯酰胺凝胶有下列特性聚丙烯酰胺凝胶有下列特性(1) (1) 凝胶有弹性，机械性能好；几乎无吸附和电渗凝胶有弹性，机械性能好；几乎无吸附和电渗作用，样品分离重复性好；作用，样品分离重复性好；(2)(2)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度较高。样品不易扩散，且用量少，其灵敏度较高。(3)(3)凝胶孔径可调节，通过改变单体及交联剂的浓凝胶孔径可调节，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶
3、的孔径；度调节凝胶的孔径；(4)(4)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。 分子量范围分子量范围 适用的凝胶浓度适用的凝胶浓度/(%)/(%) 10104 4 20-30 20-30 1-410 1-4104 4 15-20 15-20 1-510 1-5104 4-110-1105 5 10-15 10-15 110 1105 5 5-10 5-10 5105105 5 2-5 2-5蛋白分子量
4、范围与凝胶浓度的关系蛋白分子量范围与凝胶浓度的关系2. 凝胶浓度的选择与被分离物质分子量密切相关凝胶浓度的选择与被分离物质分子量密切相关3 3 凝胶聚合催化体系凝胶聚合催化体系（1 1）光催化：核黄素）光催化：核黄素（2 2）化学催化：）化学催化：AP-TEMED AP-TEMED 催化体系催化体系BisBis将单体长链间连成网状结构将单体长链间连成网状结构 化学聚合的凝胶孔径较小，常用于制备分离胶，化学聚合的凝胶孔径较小，常用于制备分离胶，重复性好。聚合反应受各种因素的影响：重复性好。聚合反应受各种因素的影响： 催化剂和加速剂的浓度催化剂和加速剂的浓度 pH pH 碱性条件碱性条件 温度温度
5、 分子氧分子氧 杂质杂质4.4.聚丙烯酰胺凝胶种类聚丙烯酰胺凝胶种类(1) 连续系统与不连续系统两大类 不连续系统不连续系统: :是指使用不同孔径的凝胶和不同缓冲是指使用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系的电泳方式，在电泳分离过程中，由于浓缩胶体系的电泳方式，在电泳分离过程中，由于浓缩胶的堆积作用，可使样品在浓缩胶和分离胶的界面上的堆积作用，可使样品在浓缩胶和分离胶的界面上先浓缩成一窄带，对样品进行浓缩，然后在一定浓先浓缩成一窄带，对样品进行浓缩，然后在一定浓度或浓度梯度的凝胶上进行分离，既存在电荷效应，度或浓度梯度的凝胶上进行分离，既存在电荷效应，也有分子筛效应。虽然制胶操作难度较大，但是它也有分
6、子筛效应。虽然制胶操作难度较大，但是它具有连续系统不可比拟的优越性，分辨率高。具有连续系统不可比拟的优越性，分辨率高。 (2)(2)不连续体系不连续体系: :电极缓冲液、浓缩胶及分离胶电极缓冲液、浓缩胶及分离胶浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH 6.7的Tris-HC1。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH 8.9 Tris-HC1。电极缓冲液是pH 8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。 1) 1) 样品浓缩效应样品浓缩效应 A. A. 凝胶孔径不连续性凝胶孔径不连续性 B. B. 缓冲体系离子成分及缓冲体系离子成分及pHpH值的不连续性值的不连续性 C. C.
7、电位梯度的不连续性电位梯度的不连续性 2) 2) 分子筛效应分子筛效应 3) 3) 电荷效应电荷效应(3) (3) 不连续体系凝胶对蛋白的分离作用不连续体系凝胶对蛋白的分离作用三三. . 实验器材实验器材1 1、电泳仪、电泳仪, ,电泳槽及其附件电泳槽及其附件2 2、培养皿、培养皿3 3、摇床、摇床4 4、烧杯、烧杯5 5、移液管、移液管6 6、微量进样器、微量进样器7 7、针管、针管电电 泳泳 装装 置置电泳仪：电泳仪：提供直流电在电泳槽中产生电场，驱动带电分子的迁移提供直流电在电泳槽中产生电场，驱动带电分子的迁移垂直平板电泳槽垂直平板电泳槽每组（每组（3 3人）做一板胶，前后可安置两副板，
8、人）做一板胶，前后可安置两副板，两组共用一套电泳装置。两组共用一套电泳装置。四四. . 实验试剂实验试剂1.1.人血清；人血清；2.2.分离胶缓冲液：分离胶缓冲液：Tris-HClTris-HCl缓冲液缓冲液 PH8.9PH8.9；3.3.浓缩胶缓冲液浓缩胶缓冲液: : Tris-HClTris-HCl缓冲液缓冲液 PH6.7PH6.7；4.4.分离胶贮液分离胶贮液: :AcrAcr 28.0g,Bis 0.735g, 28.0g,Bis 0.735g,无离子水溶解定容至无离子水溶解定容至100ml100ml； 5.5.浓缩胶贮液浓缩胶贮液: Acr10.0g,Bis2.5g,: Acr10.
9、0g,Bis2.5g,无离子水溶解定容至无离子水溶解定容至100ml100ml；6.6.过硫酸铵溶液（过硫酸铵溶液（APAP） 7.7.电泳缓冲液电泳缓冲液: : TrisTris- -甘氨酸缓冲液甘氨酸缓冲液PH8.3PH8.3；8.8.固定染色液固定染色液9.9.脱色液脱色液( (一一) ) 垂直平板电泳槽的安装垂直平板电泳槽的安装( (二二) ) 凝胶的制备凝胶的制备( (三三) ) 加样加样( (四四) ) 电泳电泳( (五五) ) 固定和染色固定和染色( (六六) ) 脱色脱色五五. . 操作步骤操作步骤五五. . 操作步骤操作步骤 ( (一一). ). 垂直平板电泳槽的安装垂直平板
10、电泳槽的安装注意短玻璃板是向内侧的。注意短玻璃板是向内侧的。要将玻板底边平齐地压要将玻板底边平齐地压紧在红色橡胶条上，否紧在红色橡胶条上，否则容易漏胶则容易漏胶。 ( (二二). ). 凝胶的制备凝胶的制备1 分离胶的制备分离胶的制备 (7%) 配配8 mL (按如下顺序加入）按如下顺序加入）1.分离胶缓冲液分离胶缓冲液 1 mL2.分离胶贮液分离胶贮液 2 mL3.去离子水去离子水 4 mL4.TEMED 2 uL5.过硫酸胺（过硫酸胺（AP) 1 mL将上述试剂迅速混匀后，用滴管沿壁迅速加样至将上述试剂迅速混匀后，用滴管沿壁迅速加样至2/3处，处，再取大约再取大约3 mL的水加在上面直至凝
11、胶凝固为止。的水加在上面直至凝胶凝固为止。加入此物后请迅速混加入此物后请迅速混匀加样，否则易凝固匀加样，否则易凝固无法加样无法加样凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面. 水封的目的是为了使分离胶上缘平直，并排除气泡水封的目的是为了使分离胶上缘平直，并排除气泡2.凝聚后倒出上层的高纯水，可用滤纸在边缘吸水。凝聚后倒出上层的高纯水，可用滤纸在边缘吸水。3.3.浓缩胶的制备浓缩胶的制备 (2.5%) (2.5%) 配配 4 mL( 4 mL(按如下顺序加入）按如下顺序加入）1.浓缩胶缓冲液浓缩胶缓冲液 0.5 mL2.浓缩胶贮液浓缩胶贮液 1 mL
12、3.去离子水去离子水 2 mL4.过硫酸胺（过硫酸胺（AP) 0.5 mL迅速混匀迅速混匀, ,用胶头滴管沿壁连续平稳加样到分离胶上面用胶头滴管沿壁连续平稳加样到分离胶上面, ,直直至上边缘至上边缘, , 迅速插入加样梳迅速插入加样梳, , 室温静置一段时间室温静置一段时间. .加样梳需一次平稳插入加样梳需一次平稳插入, ,梳口处不得有气泡梳口处不得有气泡, ,梳底需水平，梳底需水平，注意梳子的朝向，平的一面贴长玻板注意梳子的朝向，平的一面贴长玻板. .凝胶凝聚后，垂直小心拔出加样梳，用窄条滤纸吸凝胶凝聚后，垂直小心拔出加样梳，用窄条滤纸吸在玻板边缘吸去多余的液体。在玻板边缘吸去多余的液体。(
13、 (三三). ). 进进 样样除去底板，将制胶装置放在电泳槽内，除去底板，将制胶装置放在电泳槽内， 加入稀释加入稀释1010倍的倍的TrisTris甘氨酸电极缓冲液（注意：加缓冲液先甘氨酸电极缓冲液（注意：加缓冲液先从内槽加入，上面没过短玻璃板，外槽液面没过最从内槽加入，上面没过短玻璃板，外槽液面没过最下一个螺丝处下一个螺丝处, , 加样前要使凝胶凹形样品槽内的气加样前要使凝胶凹形样品槽内的气泡全部排出泡全部排出, ,否则会影响加样效果否则会影响加样效果. .（用针筒将凹洞（用针筒将凹洞中的气泡抽出）中的气泡抽出）用微量进样器取已经混合好的样品用微量进样器取已经混合好的样品 15l 15l ，
14、在距凝胶，在距凝胶凹形槽底三分之一处缓缓进样凹形槽底三分之一处缓缓进样, , 每人加每人加2 2个样，两边各个样，两边各留留2 2 孔不加样，避免边缘效应。孔不加样，避免边缘效应。 加样时不可过低加样时不可过低, ,以防刺破胶体以防刺破胶体( (三三). ). 进进 样样( (四四). ). 电电 泳泳将电泳仪的正极负极与电泳槽连接（将电泳仪的正极负极与电泳槽连接（方向切勿接错方向切勿接错），），打开电泳仪开关，开始时将电压调至打开电泳仪开关，开始时将电压调至150150V V，待样品进入，待样品进入分离胶时，将电压调至分离胶时，将电压调至250250V V。当蓝色染料迁移至。当蓝色染料迁移至
15、距离凝距离凝胶下端胶下端2cm2cm时，将电流调回到零，时，将电流调回到零，关闭电源关闭电源。电泳结束后，卸下胶框，用凝胶铲小心撬开短玻电泳结束后，卸下胶框，用凝胶铲小心撬开短玻璃板，（不要撬两边耳朵处，易断裂）璃板，（不要撬两边耳朵处，易断裂）在胶板一在胶板一端切除一角作为标记端切除一角作为标记，用缓冲液冲洗胶板，将其，用缓冲液冲洗胶板，将其移至大培养皿中染色。移至大培养皿中染色。 剥胶时要小心剥胶时要小心, ,保持胶完好无损保持胶完好无损, ,染色要充分染色要充分. .( (五五). ). 固定和染色固定和染色 将凝胶放入固定染色液中，使染色液刚好没过胶板，将凝胶放入固定染色液中，使染色液
16、刚好没过胶板，放到摇床上，缓慢摇动，染色放到摇床上，缓慢摇动，染色7 min7 min。( (注意染色液要用注意染色液要用漏斗回收）漏斗回收）( (六六). ). 脱脱 色色放置摇床上，用脱色液漂洗数次，直至背景蓝色褪放置摇床上，用脱色液漂洗数次，直至背景蓝色褪去。去。 六六. . 实实 验验 结结 果果可在培养皿下衬一白纸，便于观察，用手机拍下凝可在培养皿下衬一白纸，便于观察，用手机拍下凝胶图，打印出来附在实验报告后。胶图，打印出来附在实验报告后。1 1、AcrAcr和和BisBis为神经毒剂，对皮肤有刺激作用，操作应戴手套。为神经毒剂，对皮肤有刺激作用，操作应戴手套。2 2、玻璃板表面应光
17、滑洁净，否则在电泳时会造成凝胶板与、玻璃板表面应光滑洁净，否则在电泳时会造成凝胶板与 玻璃板或硅橡胶条剥离，产生气泡或滑胶；拨胶时凝胶板易断玻璃板或硅橡胶条剥离，产生气泡或滑胶；拨胶时凝胶板易断 裂，为防止此现象，所用器材均应严格的清洗。裂，为防止此现象，所用器材均应严格的清洗。 3 3、安装电泳槽和镶有长、短玻璃板的硅橡胶框时，位置要端正，、安装电泳槽和镶有长、短玻璃板的硅橡胶框时，位置要端正， 均匀用力旋紧固定螺丝，以免缓冲液渗漏，但亦不可太用力均匀用力旋紧固定螺丝，以免缓冲液渗漏，但亦不可太用力 旋，易将玻板边缘压破。旋，易将玻板边缘压破。 4 4、制备浓缩胶时，注意梳齿边缘不能有气泡、制备浓缩胶时，注意梳齿边缘不能有气泡, ,胶凝聚后，注意拔梳胶凝聚后，注意拔梳 子要垂直小心拔出。子要垂直小心拔出。5 5、电泳时，电泳仪与电泳槽间正、负极不能接错，以免样品反方、电泳时，电泳仪与电泳槽间正、负极不能接错，以免样品反方 向泳动。向泳动。 注注 意意 事事 项项
