中国药典无菌及微生物限度检查法发展与修订

《中国药典无菌及微生物限度检查法发展与修订》由会员分享，可在线阅读，更多相关《中国药典无菌及微生物限度检查法发展与修订（62页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、LOGO中国药典中国药典中国药典中国药典无菌及微生物无菌及微生物无菌及微生物无菌及微生物限度检查法发展与修订限度检查法发展与修订限度检查法发展与修订限度检查法发展与修订重庆市食品药品检验所 1医药产品的发展与挑战医药产品的发展与挑战v医药产品的发明与发展进步极大地改变了人类的命运医药产品的发明与发展进步极大地改变了人类的命运v独具特色的中药注射液独具特色的中药注射液v特殊的医药环境使我国成为规模庞大的特殊的医药环境使我国成为规模庞大的“吊瓶大国吊瓶大国”v注射用药品成为注射用药品成为“高风险产品高风险产品”2医药产品的发展与挑战医药产品的发展与挑战v微生物控制及检验成为高难度工作微生物控制及检

2、验成为高难度工作 一百多年来人们努力提高在一百多年来人们努力提高在“有菌的环境有菌的环境”生产生产“无菌的产品无菌的产品”的能力，事实证明这一努的能力，事实证明这一努力至今充满挑战。力至今充满挑战。 20062006年年7 78 8月发生了震惊月发生了震惊 全国的全国的“欣弗事件欣弗事件” 直接死亡直接死亡1111人人 企业倒闭企业倒闭 至今余震不断至今余震不断3医药产品的发展与挑战医药产品的发展与挑战v“欣弗事件欣弗事件”对我国的药品生产监管产生了深远的影响，对我国的药品生产监管产生了深远的影响，直接推动了新的药典方案和新版直接推动了新的药典方案和新版GMPGMP规定的出台。规定的出台。 “

3、欣弗事件欣弗事件”将永远成为无菌药品生产典型反面教材将永远成为无菌药品生产典型反面教材有人借此诋毁中国医药产品是在厕所生产的，理由是从未开封的欣弗中分离出了污水常见菌肺炎克雷伯菌 显微图显微图像像单菌落单菌落4医药产品的发展与挑战医药产品的发展与挑战v20122012年年1010月，美国新英格兰合成制药中心月，美国新英格兰合成制药中心生产的注射用类固醇霉菌污染，造成数百生产的注射用类固醇霉菌污染，造成数百人感染真菌脑炎，至年底统计死亡人感染真菌脑炎，至年底统计死亡3939人。人。 v在50支密封药瓶中检测出曲霉菌和突脐乳孢菌两种类型 5药品微生物污染的反思药品微生物污染的反思v在医药产品的发展

4、过程中，尽管世界在医药产品的发展过程中，尽管世界各国付出过惨重代价，实际上稍有不各国付出过惨重代价，实际上稍有不慎悲剧仍然可能重演。慎悲剧仍然可能重演。 悲剧的避免悲剧的避免!尊重规律，科学监管，全程无缝监控，严格落实各项管理、验证、检查和分析调查措施，切实降低无菌药品的微生物污染风险。6历版药典微生物检测方面所取得的进展历版药典微生物检测方面所取得的进展v74年、年、84年、年、90年卫生部年卫生部药品卫生学检查法药品卫生学检查法；86年卫生部颁布年卫生部颁布药品卫生标准药品卫生标准v1995年版药典首次收载微生物限度检查法年版药典首次收载微生物限度检查法v2000年版药典首次收载微生物限度

5、标准年版药典首次收载微生物限度标准v2005版版 将按剂型制定限度修订为按给药途径制定限度将按剂型制定限度修订为按给药途径制定限度 首次收载方法验证要求首次收载方法验证要求 无菌检查培养时间与国外接轨无菌检查培养时间与国外接轨v2010版版 首次收载培养基适用性检查要求首次收载培养基适用性检查要求 强调对微生物检验过程的验证及过程控制强调对微生物检验过程的验证及过程控制 部分品种特别是抗生素品种的无菌检查法由附录走入了各论部分品种特别是抗生素品种的无菌检查法由附录走入了各论7中国药典中国药典2010年版的框架组成年版的框架组成v无菌检查法无菌检查法v微生物限度检查法微生物限度检查法v灭菌法灭菌

6、法 抑菌效力检查法指导原则药品微生物检验替代方法验证指导原则药品微生物限度检查法应用指导原则药品微生物实验室规范指导原则8修订背景修订背景v欧、美、日等主要药典均收载了协调一致欧、美、日等主要药典均收载了协调一致的微生物检查法和限度标准，由于历史原的微生物检查法和限度标准，由于历史原因，我国目前的微生物限度检查体系与国因，我国目前的微生物限度检查体系与国际相比存在差距，这一差距对于目前我国际相比存在差距，这一差距对于目前我国企业产品出口造成很大的障碍，也对我国企业产品出口造成很大的障碍，也对我国的微生物质量控制造成很大困惑。的微生物质量控制造成很大困惑。9修订背景修订背景v虽然中国目前不是虽然

7、中国目前不是ICH的成员国，而的成员国，而是以观察员的身份进入，但中国与国是以观察员的身份进入，但中国与国外制药行业交往日益增多，中国药品外制药行业交往日益增多，中国药品要想进入国际市场，药品的检验方法要想进入国际市场，药品的检验方法和标准与和标准与ICH保持一致，势在必行。保持一致，势在必行。 102015版药典修订的具体原则版药典修订的具体原则v检验方法与国外药典进一步协调；检验方法与国外药典进一步协调；v已有的指导原则实用化，通过科研解决指导原则已有的指导原则实用化，通过科研解决指导原则实用化问题；实用化问题；v增加新的指导原则，特别是对与企业过程控制相增加新的指导原则，特别是对与企业过

8、程控制相关的指导原则。关的指导原则。112015版药典无菌及微生物限度检查法目标版药典无菌及微生物限度检查法目标v建立统一的质量技术要求，保持各方药典科技水建立统一的质量技术要求，保持各方药典科技水平一致，保证用药安全、有效。平一致，保证用药安全、有效。质量控制、检验技术、检验标准等v减少国际贸易的障碍。减少国际贸易的障碍。v统一医药产品进入国际市场的技术门槛，促进国统一医药产品进入国际市场的技术门槛，促进国际间药品在同一技术平台的公平竞争。际间药品在同一技术平台的公平竞争。 122015版药典无菌及微生物限度检查法版药典无菌及微生物限度检查法化学药品与生物化学药品与生物制品：制品：与协调案统

9、一与国际先进水平同步发展具体目标具体目标中药：中药： 加大科研投入，在方法上与协调案统一，在项目、限度等方面制定与中药相适应的目标。 以我为主，引领国际发展。132015版药典无菌及微生物限度检查法修订内容版药典无菌及微生物限度检查法修订内容v修订后的中国药典微生物检验系统成为一个较完修订后的中国药典微生物检验系统成为一个较完备的标准体系，将收载备的标准体系，将收载15个左右的微生物检查个左右的微生物检查法和指导原则。法和指导原则。v 修订后的中国药典微生物检测系统与国外完全修订后的中国药典微生物检测系统与国外完全一致。一致。v对实验环境进行了重大修订。对实验环境进行了重大修订。14无菌检查实

10、验室环境规定的修订无菌检查实验室环境规定的修订修订依据及意义：修订依据及意义： 2010年版年版GMP中附录一中附录一无菌药品无菌药品和附录三和附录三生物制生物制品品中均规定，非最终灭菌产品各工序关键操作环境应为中均规定，非最终灭菌产品各工序关键操作环境应为B级级背景下的背景下的A级；无菌检查的洁净环境不得低于生产关键区的洁级；无菌检查的洁净环境不得低于生产关键区的洁净环境要求。净环境要求。2010年版2015年版应在洁净度10000级背景下的局部100级单向流空气区域内或隔离系统进行应在洁净度B级背景下的局部A级单向流空气区域内或隔离系统中进行15无菌检查法的培养基系统无菌检查法的培养基系统

11、培养体系的差异是导致中国药典无菌检查与国外药典无菌检查的系统性差异，从而带来结果之间的不确定性及不可比性。这是我国药典无菌检查法必须关注的问题！ 药典USP/EP/JP中国药典2010及之前版本分类依据按营养和培养条件分按微生物类别分质控分类需气、厌气菌细菌、真菌检验体系与广谱的培养条件对应人为地选择培养评价严谨易误导结果判断或造成漏检16无菌检查培养基及其有关内容的修订无菌检查培养基及其有关内容的修订v无菌检查是一个定性试验，根据检查方法，要求所用培养基具有广无菌检查是一个定性试验，根据检查方法，要求所用培养基具有广谱的促菌生长能力，而不是也不可能一开始就对可能污染的微生物谱的促菌生长能力，

12、而不是也不可能一开始就对可能污染的微生物分类进行培养。为此，各国药典无菌检查用培养基都有一个不断改分类进行培养。为此，各国药典无菌检查用培养基都有一个不断改进至基本确定的发展过程。进至基本确定的发展过程。1950年美国药典第十六章已确定使用硫乙醇酸盐流体培养基(FTG)和胰酪大豆胨液体培养基(TSB)现USP、BP、EP、JP及ICH均规定使用硫乙醇酸盐流体培养基(FTG)和胰酪大豆胨液体培养基(TSB)但在我国长期的微生物分类培养观念下，认为改良马丁培养基(MM)更适用于真菌检查。17v2011年药典会微生物专业委员会立题对无年药典会微生物专业委员会立题对无菌检查用培养基进行了研究菌检查用培

13、养基进行了研究国产胰国产胰酪大豆胨培养基和改良马丁培养基的微生酪大豆胨培养基和改良马丁培养基的微生物促生长能力考察物促生长能力考察对国产的3个厂家的MM培养基和3 个厂家的TSB培养基与BD公司的TSB培养基进行了系统对比实验。18实实 验验 菌菌 株株v细菌：细菌：藤黄微球菌CMCC(B)28001枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501克氏库克菌（北京所参加国际微生物鉴定所得）v真菌：真菌：黑曲霉CMCC(F)98003腊叶芽枝霉CMCC(F)7702一株从样品或环境中分离的霉菌 197个实验室的实验结论个实验室的实验结论v经统计分析表明：国产胰酪大豆胨液体培养基经统计分析表明：国产胰酪大豆胨

14、液体培养基(TSB)和改良马丁培养基和改良马丁培养基(MM)的促菌生长能力无的促菌生长能力无显著性差异。显著性差异。v国产胰酪大豆胨液体培养基国产胰酪大豆胨液体培养基(TSB)和改良马丁培和改良马丁培养基养基(MM)适宜生长的微生物种群（广谱性）无显适宜生长的微生物种群（广谱性）无显著性差异。著性差异。v国产的两种培养基不比国产的两种培养基不比BD公司生产的胰酪大豆胨公司生产的胰酪大豆胨液体培养基液体培养基(TSB)质量差。质量差。202015版无菌检验用培养基的修订版无菌检验用培养基的修订2010年版2015年版硫乙醇酸盐流体培养基3035；2025 （三部）改良马丁培养基置2328 培养硫

15、乙醇酸盐流体培养基3035；2025 （生物制品两种温度）胰酪大豆胨肉汤培养基（TSB)置2025 培养选择性培养基0.5%葡萄糖肉汤培养基营养肉汤培养基营养琼脂培养基改良马丁琼脂培养基选择性培养基0.5%葡萄糖肉汤培养基胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）沙氏葡萄糖肉汤培养基沙氏葡萄糖琼脂培养基212015版无菌检查法修订版无菌检查法修订v增订了无菌检查法所用培养基的性能定义增订了无菌检查法所用培养基的性能定义“硫乙醇酸盐流体培养基（FTG）是厌氧菌检查的首选培养基，同时也可用于需气菌检查。”“胰酪大豆胨液体培养基（TSB）适用于真菌和需气菌的检查。”即某种污染了需气菌的供试品，无论被接种在硫乙醇

16、酸盐流体培养基（FTG）中还是被 接种在胰酪大豆胨液体培养基（TSB）中均可被检出。意义：纠正了微生物学检查中长期存在的对微生物分类培养的概念，提高污染微生物的检出率，与先进国家药典保持一致。22根据培养基的调整所做的相关调整根据培养基的调整所做的相关调整由由由由TSBTSBTSBTSB替代替代替代替代MMMMMMMM两种培养基两种培养基两种培养基两种培养基接入试验菌的调整接入试验菌的调整接入试验菌的调整接入试验菌的调整各菌接种的各菌接种的各菌接种的各菌接种的培养基调整培养基调整培养基调整培养基调整培养基修订培养基修订培养基灵敏培养基灵敏度检查及方度检查及方法适用性试法适用性试验中的修订验中的

17、修订菌液制备用培菌液制备用培养基的修订养基的修订硫乙醇酸盐流体培养基：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌（大肠埃希菌）、生孢梭菌硫乙醇酸盐流体培养基：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌（大肠埃希菌）、生孢梭菌胰酪大豆胨液体培养基：枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉胰酪大豆胨液体培养基：枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉23三部药典无菌检查方法的整合修订三部药典无菌检查方法的整合修订v整合中的焦点：整合中的焦点：三部无菌检查法中规定样品接种硫乙醇酸盐流体培养三部无菌检查法中规定样品接种硫乙醇酸盐流体培养基必须分成双份，分别置基必须分成双份，分别置3035、2025 两个温度两个温度下培养。以致在下培养。以致在取

18、样量取样量、检验量检验量、接种方式接种方式、培养温培养温度度、阳性对照试验阳性对照试验等方面存在与二部不一致的规定。等方面存在与二部不一致的规定。24国际上生物制品无菌检查法的情况国际上生物制品无菌检查法的情况v美国美国FDA（May2001）和欧盟（）和欧盟（March1999）均早已接受药典无菌检查法适用于生物技术产品均早已接受药典无菌检查法适用于生物技术产品及生物制品（见及生物制品（见ICH Q6B生物技术产品生物技术产品/生物制生物制品检定规程及标准）。品检定规程及标准）。vUSP、EP、BP、JP及ICH的无菌检查法中均没有对生物制品作出特殊的规定。25v分歧出现在我国对分歧出现在我

19、国对WHO 6号规程的引用上。号规程的引用上。从可以查到的从可以查到的中国生物制品规程中国生物制品规程1979年版开始，规定样品接种硫乙醇酸盐流体年版开始，规定样品接种硫乙醇酸盐流体培养基双份置双温度下分别培养。培养基双份置双温度下分别培养。v 这一规定一直被延续到这一规定一直被延续到2010年版三部的年版三部的无菌检查法，成为长达无菌检查法，成为长达35年的我国生物制年的我国生物制品无菌检查法的特殊规定。品无菌检查法的特殊规定。 26整合调查整合调查v据反映，历史上个别地区在生物制品无菌检查中曾经发据反映，历史上个别地区在生物制品无菌检查中曾经发现个别品种在现个别品种在2025 培养的硫乙醇

20、酸盐流体培养基中培养的硫乙醇酸盐流体培养基中有菌生长的情况（但未作鉴定和溯源明确是什么菌）。有菌生长的情况（但未作鉴定和溯源明确是什么菌）。v从微生物适宜培养条件分析从微生物适宜培养条件分析嗜热型需氧菌适宜生长温度为4558；嗜温型需氧菌适宜生长温度为2044；嗜冷型需氧菌适宜生长温度为1018；疑点和疑问：疑点和疑问：阳性产品实验操作中是否有确保无污染的证明？阳性产品实验操作中是否有确保无污染的证明？是否存在未知的是否存在未知的厌氧菌厌氧菌必须在必须在2025 培养才能生长？培养才能生长？在胰酪大豆胨液体培养基在胰酪大豆胨液体培养基2025 下培养能不能被检出？下培养能不能被检出？27v修订

21、原则修订原则 以国际发展趋势为主导，遵照以国际发展趋势为主导，遵照2015年版药典编制大年版药典编制大纲三部药典必须整合的要求进行，以二部为基础，在纲三部药典必须整合的要求进行，以二部为基础，在检验数量、检验量、阳性对照样品量、阳性对照试验检验数量、检验量、阳性对照样品量、阳性对照试验方法、培养温度等方面互相兼顾，作原则性要求而不方法、培养温度等方面互相兼顾，作原则性要求而不作具体细则规定。作具体细则规定。致力于今后逐步统一完善。致力于今后逐步统一完善。 28无菌检查法其他主要的修订无菌检查法其他主要的修订2010年版2015年版薄膜过滤法应优先采用封闭式薄薄膜过滤法应优先采用封闭式薄膜过滤器

22、，也可使用一般过滤器。膜过滤器，也可使用一般过滤器。薄膜过滤法应采用封闭式薄膜过滤器。薄膜过滤法应采用封闭式薄膜过滤器。直接接种法即取规定量供试品分直接接种法即取规定量供试品分别等量接种至硫乙醇酸盐流体培别等量接种至硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基中养基和改良马丁培养基中直接接种法适用于无法用薄膜过滤法直接接种法适用于无法用薄膜过滤法进行无菌检查的供试品。进行无菌检查的供试品。即取即取;除除生物制品外，一般样品两种培养基接生物制品外，一般样品两种培养基接种的支种的支/ /瓶数相等；生物制品硫乙醇酸瓶数相等；生物制品硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基接

23、种的支基接种的支/ /瓶数为瓶数为2:12:1不能从外观上判断有无微生物生不能从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液适量接种至同长，可取该培养液适量接种至同种新鲜培养基中，种新鲜培养基中，细菌培养细菌培养2天、天、真菌培养真菌培养3天。天。不能从外观上判断有无微生物生长，不能从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液适量接种至同种新鲜培可取该培养液适量接种至同种新鲜培养基中，养基中，培养培养3天天。29302015年版中国药典微生物限度检查法修订年版中国药典微生物限度检查法修订非无菌药品微生物限度检查：非无菌药品微生物限度检查：微生物计数法微生物计数法非无菌药品微生物限度检查：非无菌药品微生物

24、限度检查：控制菌检查法控制菌检查法非无菌药品微生物限度标准非无菌药品微生物限度标准参照参照USP35版和版和版对版对微生物限度微生物限度检查法检查法收载形式收载形式进行了修订，将进行了修订，将其分为三个附录：其分为三个附录：31微生物限度检查法实验环境的变化微生物限度检查法实验环境的变化2010年版2015年版应在洁净度10000级背景下的局部100级单向流空气区域内进行。应在受控洁净环境下（不低于D级）的局部不低于B级单向流空气区域内进行。总的原则：总的原则： 无外源性微生物污染样品无外源性微生物污染样品 样品的微生物检测环境不低于样品的生产环境样品的微生物检测环境不低于样品的生产环境32微

25、生物限度检查法技术方法适用范围变化微生物限度检查法技术方法适用范围变化2010年版2015年版系检查非灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数明确规定本检查法不适用于活菌制剂的检查明确规定本检查法可采用替代检查方法，包括自动化检测方法，但必须证明其替代方法等效于药典规定的检查方法。嗜温型微生物最适生长温度为嗜温型微生物最适生长温度为20 44（ 2543）金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌最适生长温度为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌最适生长温度为37白色念珠菌、黑曲霉最适生长温度为白色念珠菌、黑曲霉最适生长温度为

26、2833微生物限度检查法试剂和试药的修订微生物限度检查法试剂和试药的修订v试剂和试药试剂和试药中和剂、灭活剂和表面活性剂均应对微生物无毒性，其相互间具有相容性，有利于样品中微生物均匀分布。 v稀释液稀释液无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液； pH7.2 无菌磷酸盐缓冲液； 无菌磷酸盐缓冲液（肠溶制剂）；无菌磷酸盐缓冲液（结肠溶制剂）；胰酪大豆胨液体培养基不限于上述稀释液（如0.9%无菌氯化钠溶液）34微生物限度检查计数法微生物限度检查计数法修订前修订前大肠埃希菌大肠埃希菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌白色念珠菌黑曲霉黑曲霉试验菌株试验菌株修订后修订后铜绿假单胞菌铜绿假单胞

27、菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌白色念珠菌黑曲霉黑曲霉35微生物限度检查计数法培养基和试验菌的修订微生物限度检查计数法培养基和试验菌的修订2010年版2015年版营养琼脂：营养琼脂： 大肠埃希菌大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌玫瑰红钠琼脂：玫瑰红钠琼脂： 白色念珠菌白色念珠菌 黑曲霉黑曲霉胰酪胨大豆琼脂：胰酪胨大豆琼脂： 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌 铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌 白色念珠菌白色念珠菌 黑曲霉黑曲霉沙氏葡萄糖琼脂：沙氏葡萄糖琼脂： 白色念珠菌白色念珠菌 黑曲霉黑曲霉36微生物限度检查计数法培

28、养温度和时间的修订微生物限度检查计数法培养温度和时间的修订2010年版2015年版细菌数 营养琼脂 3035 3天 霉菌及酵母菌数 玫瑰红钠琼脂 2328 5天需氧菌总数 胰酪胨大豆琼脂 3035 35天霉菌及酵母菌数 沙氏葡萄糖琼脂 2025 57天37微生物限度检查计数法接种方法的修订微生物限度检查计数法接种方法的修订2010年版2015年版1、平皿倾注法2、薄膜过滤法1、平皿法（包括倾注法和涂布法），平皿法（包括倾注法和涂布法），明确可使用直径较大的平皿，且培养基的用量应相应增加。2、薄膜过滤法薄膜过滤法3、最可能数最可能数（Most-Probable-Number,简称MPN）。MPN

29、法用于微生物计数时精密度较差，但对于某些微生物污染量很小的供试品可能是更适合的方法。MPN法仅在供试品需氧菌总数没有适宜计数方法的情况下使用，且不适用于霉菌计数。38微生物限度检查计数法方法的修订微生物限度检查计数法方法的修订2010年版2015年版术语变化术语变化：计数方法验证细菌计数法细菌计数法用三种菌种进行验证菌液加入方式菌液加入方式：平皿计数验证时菌液和供试液同时加入平皿，加菌量10100cfu术语变化术语变化：计数方法适用性试验总需氧菌计数法总需氧菌计数法用五种菌种试验菌液加入方式菌液加入方式：菌液加入供试液中，使每ml供试液或每张滤膜所滤过的供试液中含菌量不大于100cfu,且所加

30、菌液的体积不超过供试液体积的1%。39适用性试验加入方式举例：适用性试验加入方式举例：各试验组溶液各试验组溶液分装分装5份份每份每份金黄色葡萄球菌液金黄色葡萄球菌液铜绿假单胞菌液铜绿假单胞菌液枯草芽孢杆菌液枯草芽孢杆菌液白色念珠菌液白色念珠菌液黑曲霉菌液黑曲霉菌液40微生物限度检查计数法检测项目及结果判断的修订微生物限度检查计数法检测项目及结果判断的修订2010年版2015年版细菌数细菌数营养琼脂培养基霉菌和酵母菌数霉菌和酵母菌数玫瑰红钠琼脂培养基酵母菌数酵母菌数酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基需氧菌总数需氧菌总数生长在胰酪胨大豆琼脂培养基上所有菌落（包括霉菌和酵母菌）霉菌和酵母菌总数霉菌和酵母菌

31、总数指生长在沙氏葡萄糖琼脂培养基上的所有菌落（包括细菌菌落数）。回收率回收率：70%以上回收率回收率：0.5-2（50%-200%）41微生物限度检查计数法结果判断有计数干扰情况时的修订微生物限度检查计数法结果判断有计数干扰情况时的修订2010年版2015年版若营养琼脂上生长霉菌与酵母菌、玫瑰红钠上生长细菌，则分别点计霉菌和酵母菌、细菌数。然后将营养琼脂上霉菌和酵母菌数或玫瑰红钠上细菌数与玫瑰红钠上霉菌和酵母菌数或营养琼脂上细菌数进行比较，以菌落数高的培养基中菌数为计数结果。若因沙氏葡萄糖琼脂上生长的细菌使霉菌及酵母菌的计数结果不符合微生物限度要求，可使用含抗生素（如氯霉素、庆大霉素)的沙氏葡

32、萄糖琼脂或选择性培养基（如玫瑰红钠琼脂）。42微生物限度检查计数法结果判断的修订微生物限度检查计数法结果判断的修订2010年版2015年版供试品的细菌数、霉菌数和酵母菌数其中任何一项不符合该品种项下的规定，应从同一批样品中随机抽样，独立复试两次，以三次结果的平均值报告菌数。无相关内容描述，因微生物试验的特殊性，在实际操作过程中应依据附录药品微生物实验室质量管理指导原则对实验结果进行充分和全面的评价。43微生物限度检查计数法结果判断增订内容微生物限度检查计数法结果判断增订内容2010年版2015年版无各品种项下要求执行的微生物限度标准如下：101cfu 可接受的最大限度为20；102cfu 可接

33、受的最大限度为200；103cfu 可接受的最大限度为2000；依次类推.若供试品的需氧菌总数、霉菌及酵母菌总数的检查结果均符合该品种项下的规定，判供试品符合规定；若其中任何一项不符合该品种项下的规定，判供试品不符合规定。44微生物限度检查控制菌检查的修订微生物限度检查控制菌检查的修订2010年版2015年版大肠埃希菌大肠菌群大肠菌群沙门菌铜绿假单胞菌金黄色葡萄球菌梭菌白色念珠菌大肠埃希菌耐胆盐革兰氏阴性杆菌耐胆盐革兰氏阴性杆菌沙门菌铜绿假单胞菌金黄色葡萄球菌梭菌白色念珠菌45微生物限度检查控制菌检查的修订微生物限度检查控制菌检查的修订2010年版2015年版大肠菌群方法验证用大肠埃大肠菌群方

34、法验证用大肠埃希菌进行验证希菌进行验证耐胆盐革兰氏阴性杆菌用大肠耐胆盐革兰氏阴性杆菌用大肠埃希菌和铜绿假单胞菌进行方埃希菌和铜绿假单胞菌进行方法适用性试验法适用性试验加菌量：加菌量：1010100cfu100cfu加菌量：不大于加菌量：不大于100cfu100cfu46微生物限度检查控制菌检查的修订微生物限度检查控制菌检查的修订2010年版2015年版传统的鉴别试验为主个体形态、菌体形态生理生化反应生态学特征血清学反应对噬菌体及抗生素的敏感性用传统的鉴别试验或采用其它适宜的方法进行鉴别分子生物学技术应用（溯源分析）472015版微生物限度标准的修订版微生物限度标准的修订将2010版中国药典一、

35、二、三部微生物限度标准项目进行对比、整合。采用一部的限度标准项目作为合并后限度标准的基础。修订思路修订思路与美、欧、日药与美、欧、日药典比较，修订中国典比较，修订中国药典的微生物限度药典的微生物限度标准。标准。采用清晰直观的表格形式，按给药途径，分液体、固体性质，列出各类药品的限度标准。48修订后限度标准的总体结构及规定（共修订后限度标准的总体结构及规定（共9项，项，4个表）个表）1、制剂通则、品种项下要求无菌的制剂及标示无菌的制剂和原辅料应符合无菌检查法规定。、制剂通则、品种项下要求无菌的制剂及标示无菌的制剂和原辅料应符合无菌检查法规定。2、用于手术、烧伤或严重创伤的局部给药制剂应符合无菌检

36、查规定、用于手术、烧伤或严重创伤的局部给药制剂应符合无菌检查规定3、非无菌化学药品及生物制品制剂的微生物限度标准（见表、非无菌化学药品及生物制品制剂的微生物限度标准（见表1）4、非无菌不含药材原粉的中药制剂微生物限度标准（见表、非无菌不含药材原粉的中药制剂微生物限度标准（见表1）5、非无菌含药材原粉的中药制剂微生物限度标准（见表、非无菌含药材原粉的中药制剂微生物限度标准（见表2）6、非无菌的药用原料及辅料微生物限度标准（见表、非无菌的药用原料及辅料微生物限度标准（见表3）7、中药提取物及中药饮片的微生物限度标准（见表、中药提取物及中药饮片的微生物限度标准（见表4）8、有兼用途径的制剂应符合各给

37、药途径的标准、有兼用途径的制剂应符合各给药途径的标准9、霉变、长螨者以不合格论、霉变、长螨者以不合格论限限度度标标准准49v表表1、非无菌化学药品及生物制品制剂的微生物限度标准及非无菌不含药材原粉的、非无菌化学药品及生物制品制剂的微生物限度标准及非无菌不含药材原粉的中药制剂微生物限度标准中药制剂微生物限度标准v表表2、非无菌含药材原粉的中药制剂微生物限度标准、非无菌含药材原粉的中药制剂微生物限度标准v表表3、非无菌的药用原料及辅料微生物限度标准、非无菌的药用原料及辅料微生物限度标准v表表4、中药提取物及中药饮片的微生物限度标准、中药提取物及中药饮片的微生物限度标准需氧微生物总数（cfu/g或c

38、fu/ml)霉菌和酵母菌总数（cfu/g或cfu/ml)控制菌药用原料、辅料103102未作统一规定需氧微生物总数（cfu/g或cfu/ml)霉菌和酵母菌总数（cfu/g或cfu/ml)控制菌中药提取物103102未作统一规定中药饮片未作统一规定未作统一规定不得检出沙门菌（10g)耐胆盐革兰阴性菌应小于104（1g)50微生物检测体系及药品微生物检验的关键点微生物检测体系及药品微生物检验的关键点环境保证环境保证培养基保证培养基保证药品微生物药品微生物实验室规范实验室规范指导原则指导原则洁净实验室微生物洁净实验室微生物控制和监测指导原则控制和监测指导原则无菌检查隔离无菌检查隔离系统指导原则系统指

39、导原则SOP操作操作有效的方法有效的方法方法适用性（验证）方法适用性（验证）有效的结果有效的结果可靠的结论可靠的结论结果判断结果判断无菌性检查无菌性检查灵敏度检查灵敏度检查对照培养基对照培养基药品微生物检验药品微生物检验替代方法验证替代方法验证指导原则指导原则微生物检查微生物检查法指导原则法指导原则512015版药典修订的基本目标版药典修订的基本目标v2015年版中国药典微生物检验标准体系将推动年版中国药典微生物检验标准体系将推动药品微生物实验室从一个简单的药品微生物实验室从一个简单的终产品检验终产品检验实验实验室向室向微生物风险调查分析型微生物风险调查分析型实验室方向发展。实验室方向发展。

40、案例介绍52v氟康唑注射液生物负荷偏差调查及处理氟康唑注射液生物负荷偏差调查及处理v2011年7月，在进行趋势分析时，发现有5批 氟康唑注射液灌装后生物负荷监测有超限趋势，经过初步评估后，负责污染问题的委员会决定启动偏差调查，查明导致产生污染的根本原因、确定和实施相关预防措施，并监测其有效性。53v（1）确定调查范围：根据产品发生情况和调查时间，调）确定调查范围：根据产品发生情况和调查时间，调查相关批号查相关批号206个。个。v（2）鉴定：根据细菌鉴定，氟康唑注射液瓶中的微生物）鉴定：根据细菌鉴定，氟康唑注射液瓶中的微生物有两种：一种为水里存在的微生物，一种为环境存在的有两种：一种为水里存在的

41、微生物，一种为环境存在的微生物。微生物。v（3）调查发生原因：一是注射用水连接管路在技术夹层）调查发生原因：一是注射用水连接管路在技术夹层中有一个低点，有存水；二是洗瓶间的一个空气过滤器中有一个低点，有存水；二是洗瓶间的一个空气过滤器检漏有问题。检漏有问题。制定改正措施54v改正措施改正措施1-管路坡度修正：管路用管路坡度修正：管路用5%NaOH进行钝化、进行钝化、灭菌；灌装前增加一个过滤器；增加灌装前后取样检测灭菌；灌装前增加一个过滤器；增加灌装前后取样检测频次；注射用水循环管路每周灭菌一次。频次；注射用水循环管路每周灭菌一次。v改正措施改正措施2-更换过滤器：用更换过滤器：用m m的过滤器

42、取代的过滤器取代m m的过滤的过滤器。器。v改正措施改正措施3 3-注射剂产品在生产过程中的各个阶段进行微注射剂产品在生产过程中的各个阶段进行微生物检测，以核实产品在生产全过程中是否受微生物污生物检测，以核实产品在生产全过程中是否受微生物污染。最终灭菌产品在终端灭菌前进行。染。最终灭菌产品在终端灭菌前进行。 改进措施的效果跟踪：通过检查，水及氟康唑注射液中均不再发现有上述两种微生物。55v质量审查小组的最后决定质量审查小组的最后决定 连续3批合格后（趋于平稳），停止增加微生物灌装前的微生物监测，保留灌装后的检测；保留每周对系统进行一次灭菌。对有问题产品的质量评估：206批中有5批不被放行，其余

43、放行。56新的微生物检验理念新的微生物检验理念 药品因素药品因素方法验证方法验证 环境影响环境影响培养观察培养观察抽样检查抽样检查破坏试验破坏试验过程控制过程控制 结果判断结果判断OOS/OOT调查调查溯源调查溯源调查微生物鉴别微生物鉴别-初步确定污染源初步确定污染源原始数据以及阴性阳性对照回顾原始数据以及阴性阳性对照回顾培养基及所用的其他耗材是否满足质量标准要求培养基及所用的其他耗材是否满足质量标准要求实验室环境是否符合要求实验室环境是否符合要求取样环境是否满足要求取样环境是否满足要求样品本身是否具有使微生物存活或繁殖的特性样品本身是否具有使微生物存活或繁殖的特性同期进行检验的其他结果是否正

44、常同期进行检验的其他结果是否正常消毒剂是否在有效期内，且消毒是否正确消毒剂是否在有效期内，且消毒是否正确溯源调查溯源调查57革兰氏染色镜鉴革兰氏染色镜鉴按照标准进行按照标准进行传统的生化反应鉴定传统的生化反应鉴定API试剂条试剂条菌鉴定国际金标准菌鉴定国际金标准 全自动细菌鉴定仪全自动细菌鉴定仪（VITEK 2）微生物鉴定微生物鉴定荧光免疫筛选系统荧光免疫筛选系统免疫凝集免疫凝集/免疫沉淀实验免疫沉淀实验微生物检测微生物检测 实时荧光定量实时荧光定量PCR色谱、光谱分析技术色谱、光谱分析技术分子生物分子生物学技术学技术理念变化理念变化 实验者由按严格按照标准检验向依据统一的原则选择适宜的方法检

45、验转变实验者由按严格按照标准检验向依据统一的原则选择适宜的方法检验转变 传统筛选系统传统筛选系统 BioLumixTM实时快速实时快速微生物荧光光电检测系微生物荧光光电检测系统统 BD FACSMicroCountTM全自动微生物分析仪全自动微生物分析仪 半自动细菌鉴定仪半自动细菌鉴定仪（ATB Expression）58 基于基于DNA的分子分型技术的分子分型技术16S rDNA分型分型指纹图谱技术指纹图谱技术重复序列聚合酶链式反应重复序列聚合酶链式反应 (Rep-PCR)脉冲场电泳技术（脉冲场电泳技术（PFGE）多位点序列分析多位点序列分析 (MLST)多位点重复序列分析多位点重复序列分析 (MLVA)随机扩增的多态性随机扩增的多态性DNA(RAPD )59无菌无菌/微生物限度微生物限度符合规定符合规定微生物实验微生物实验室技术能力室技术能力分析分析评估评估 ChpUSPEPJP减少人员误差减少人员误差增加准确性增加准确性60药品微生物质控体系药品微生物质控体系结果判定科学化结果判定科学化l传统检查与分子生物学技术相结合传统检查与分子生物学技术相结合l考虑基本国情与国际标准接轨考虑基本国情与国际标准接轨理念转变理念转变趋势分析趋势分析偏差调查偏差调查61LOGO62