整理ppt 目的基因：目的基因：准准备备要分离、改造、要分离、改造、扩扩增或表达的基因增或表达的基因整理ppt 第一第一节节 基因基因组组DNA片段化片段化一、限制性内切一、限制性内切酶酶法法用限制性内切用限制性内切酶酶把基因把基因组组DNA切成不同切成不同大小的片段大小的片段酶酶切切整理ppt 由于由于带带有粘性末端，有粘性末端，产产物可以直接与物可以直接与载载体体连连接1. 优优点点2. 缺点缺点目的基因目的基因内部内部也可能有也可能有该该内切内切酶酶的切点目的基因也被切成碎片！目的基因也被切成碎片！BamH IBamH IBamH Igene整理ppt 二、随机片段化二、随机片段化1. 限制性内切限制性内切酶酶局部消化法局部消化法控制内切控制内切酶酶的用量和消化的用量和消化时间时间，使基，使基因因组组中的中的酶酶切位点只有一部分被随机切位点只有一部分被随机切开① ① 内切内切酶酶识别识别位点的碱基数位点的碱基数影响所切出的影响所切出的产产物的物的长长度和随机程度度和随机程度1）限制性内切）限制性内切酶酶的的选选用原用原则则整理ppt 1））4bp的内切的内切酶酶平均每平均每46（（4096））bp一个切点。
一个切点2））6bp的内切的内切酶酶平均每平均每44（（256））bp一个切点一个切点随机程度高如随机程度高如HaeⅢ、、AluI、、Sau3A② ② 内切内切酶酶粘性末端粘性末端能与常用克隆位点相能与常用克隆位点相连连Sau3A—BamH I））5’-G5’-GGATCGATCC-3’ C-3’ 3’-3’-CCTAGCCTAGG-5’ G-5’ BamH IBamH I5’-5’-GATCGATC----3’ ----3’ 3’----3’----CTAGCTAG-5’-5’ Sau 3A(同尾同尾酶酶)整理ppt 2. 机械切割法机械切割法（（1）超声波）超声波超声波超声波强强烈作用于烈作用于DNA，可使其断，可使其断裂成裂成约约300bp的随机片段的随机片段2）高速）高速搅搅拌拌1500转转/分下分下搅搅拌拌30min，可，可产产生生约约8kb的随机片段的随机片段整理ppt 1976年年H.G. Khorana提出了用化学方法提出了用化学方法合成基因的合成基因的设设想，并于想，并于1979年在年在science上上发发表了率先成功地合成大表了率先成功地合成大肠肠杆菌酪氨杆菌酪氨酸酸tRNA基因的基因的论论文。
文第二第二节节 化学合成目的基因化学合成目的基因一、目前常用的方法一、目前常用的方法磷酸二磷酸二酯酯法、法、磷酸三磷酸三酯酯法、法、亚亚磷酸三磷酸三酯酯法法、、固相合成法固相合成法自自动动化合成法化合成法整理ppt ①① 保保护护dNTP的的3’端端P和和5’端端–OH（（1）原理）原理1. 磷酸二磷酸二酯酯法法加入的脱氧加入的脱氧单单核苷酸核苷酸起始脱氧起始脱氧单单核苷酸核苷酸 整理ppt ②② 带带保保护护的的单单核苷酸核苷酸连连接接带带5’保保护护的的单单核苷酸与核苷酸与带带3’保保护护的另一个的另一个单单核苷酸以核苷酸以磷磷酸二酸二酯键酯键连连接接起来起来整理ppt ③③ 用酸或碱的脱保用酸或碱的脱保护护80%乙酸乙酸整理ppt （（2）合成）合成过过程程下一个下一个5’端保端保护护的的单单核苷酸又可以同核苷酸又可以同3’端保端保护护的二核苷酸聚合的二核苷酸聚合整理ppt 原理与磷酸二原理与磷酸二酯酯法一法一样样只是参加反只是参加反应应的的单单核苷酸都是在核苷酸都是在3’端磷酸和端磷酸和5’-OH上都先上都先连连接了一个保接了一个保护护基基团团2. 磷酸三磷酸三酯酯法法整理ppt 将第一个核苷酸的将第一个核苷酸的3’-OH端固定在端固定在固相支持物固相支持物上。
上 固相磷酸三固相磷酸三酯酯合成法合成法是目前通用的合成方法是目前通用的合成方法合成的二核苷酸合成的二核苷酸连连接接处处有三个有三个酯键酯键！！整理ppt 固相磷酸三固相磷酸三酯酯合成合成过过程程固相支持物固相支持物结结果是全保果是全保护护的的DNA：：5’ DMT(4，，4-二二对对甲氧基三苯甲甲氧基三苯甲基基 ), 3’固相支持物固相支持物, 核苷酸之核苷酸之间对氯间对氯苯最后脱保苯最后脱保护护固相固相 支持物支持物固相固相 支持物支持物C整理ppt 目前化学合成寡核苷酸大多数是在合成仪上自动进行的，DNA自动合成已采用的是固相磷酸二酯法和亚磷酸三酯法，由于亚磷酸三酯法具有反应速度快，合成效率高和副反应极少等优点，已经在自动合成仪被广泛采用 整理ppt 3 3、、、、亚亚亚亚磷酸三磷酸三磷酸三磷酸三酯酯酯酯法法法法(1)脱二苯甲基保护基 加入ZnBr2或二氯乙酸，脱去4，4—二对甲氧基三苯甲基，释放出与载体相连的寡聚核苷酸单体1上的5’—OH2)活化新的碱基 核苷酸单体2 的3’端的二异丙基亚磷酸酰上的磷酸的OH用β-氰乙基或甲基保护，准备和前一个碱基进行反应 整理ppt (3)缩合反应 在弱强——四唑的存在下，新加入带保护基的核苷酸单体2与单体1发生缩合反应，形成3’，5’—磷酸二酯键，其中，磷为3价，即形成了亚磷酸三酯中间产物。
4)盖帽反应 加入乙酸酐，使极少数尚未参加缩合反应的核苷酸单体1 中的5’—OH乙酰化，从而达到封闭的作用，终止其以后参加缩台反应的可能性，以减少发生合成错误的机会5)氧化反应 形成的3’一5’磷酸二酯键由于磷为3价，即亚磷酸酯，不稳定，能被酸或碱解离加入I2将其氧化，使之转化为磷酸三酯，其中磷为5价整理ppt 三价三价五价五价整理ppt 如此如此经过经过多次循多次循环环，直到合成所需，直到合成所需长长度度为为止，再用止，再用浓浓NH4OH将将DNA从固相上洗从固相上洗脱下来，最后除去脱下来，最后除去NH4OH ，在真空中，在真空中抽干，抽干，样样品即可溶于适量的水中品即可溶于适量的水中进进行行纯纯化分析 要注意的要注意的问题问题:合成方向合成方向3’ → 5’核苷酸核苷酸单单体的磷酸基体的磷酸基团团在在3’端端亚亚磷酸磷酸三三酯酯法的磷法的磷为为3价磷，需要氧化价磷，需要氧化整理ppt 化学合成的化学合成的DNA片段一般在片段一般在200bp以内 二、二、 化学合成化学合成DNA片段的片段的组组装装用用T4多核苷酸激多核苷酸激酶酶使各个片段的使各个片段的5’端端带带上磷酸1. 互互补连补连接法接法预预先先设计设计合成的片段之合成的片段之间间都有都有互互补补区域区域，不同片段之，不同片段之间间的互的互补补区域能区域能形成有形成有断点断点的完整双的完整双链链。
2 2））5’端磷酸化端磷酸化（（1 1）互）互补补配配对对（合成的（合成的DNADNA单链单链的的5’5’端是端是-OH-OH））整理ppt T4 DNA连连接接酶酶T4多核苷酸激多核苷酸激酶酶使使5’-OH磷酸化磷酸化完整的完整的DNA双双链链（（3 3））连连接接酶酶连连成完整双成完整双链链整理ppt 2. 互互补补延伸延伸连连接法接法预预先先设计设计的片段之的片段之间间有有局部互局部互补补区区，可以，可以相互作相互作为为另一个片段延另一个片段延长长的引物，用的引物，用DNA聚合聚合酶酶延伸成完整的双延伸成完整的双链链3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ T4DNA连连接接酶酶Klenow片段片段引物引物整理ppt 1. 直接合成基因直接合成基因三、三、 寡聚核苷酸化学合成的寡聚核苷酸化学合成的优优点点2. 合成引物（合成引物（20mer左右）左右）（（1 1））mRNA的含量很低，很的含量很低，很难难作作cDNA 3. 合成探合成探针针序列序列4. 定点突定点突变变合成合成合成合成带带有有定点突定点突变变的基因片段的基因片段2）有些基因比）有些基因比较较短，化学合成短，化学合成费费用用较较低低整理ppt DNA合成合成仪仪5. 合成人工接合成人工接头头或或衔衔接物接物含有各种含有各种酶酶切位点切位点人工接人工接头头（（Adaptor）或）或衔衔接物接物（（Linker）序列。
序列EcoRIEcoRI LinkerAdaptor衔衔接物接物用化学合成法合成的一段用化学合成法合成的一段10-12bp的特定的特定限制性内切限制性内切酶酶识别识别位点序列的位点序列的平端双平端双链链人工接人工接头头用化学合成法合成的一段用化学合成法合成的一段不等不等长长双双链链DNA序列，一序列，一头头平末端、另一平末端、另一头头粘性末端，粘性末端，粘性粘性末端末端某种某种酶酶切所切所产产生的粘性末端）生的粘性末端）AATTCG GAATTC CTTAAG整理ppt 将某种生物将某种生物细细胞的胞的整个基因整个基因组组DNA切割切割成大小合适的片段，并将成大小合适的片段，并将所有所有这这些片段些片段都与适当的都与适当的载载体体连连接，引入相接，引入相应应的宿主的宿主细细胞中胞中保存和保存和扩扩增增 理理论论上上讲讲，，这这些重些重组载组载体上体上带带有了有了该该生生物体的物体的全部基因全部基因，称，称为为基因文基因文库库一、基因文一、基因文库库的构建的构建1. 基因文基因文库库（（gene library））第三第三节节 目的基因的保存和目的基因的保存和扩扩增增整理ppt （（2 2））目前常用的目前常用的载载体体 2. 构建基因文构建基因文库库的的载载体体选选用用载载体能体能够够容容载载的的DNA片段大小直接影响到构片段大小直接影响到构建完整的基因文建完整的基因文库库所需要的所需要的重重组组子子的数目。
的数目载载体容量越大，所要求的体容量越大，所要求的DNA片段数目片段数目越少，所需的越少，所需的重重组组子子越少1 1））对载对载体的要求体的要求 载载体系列：体系列： 容量容量为为 24 kp cosmid载载体：体： 容量容量为为 50 kb YAC：： 容量容量为为 1 Mb BAC: 容量容量为为 300 kb整理ppt 断点完全随机，片段断点完全随机，片段长长度合适于度合适于载载体体连连接不能用一般的限制性内切不能用一般的限制性内切酶酶消化法1）染色体）染色体DNA大片段的制大片段的制备备3. 基因文基因文库库构建的一般步构建的一般步骤骤超声波（超声波（300bp）或机械）或机械搅搅拌（拌（8kb） ①① 物理切割法：物理切割法：内切内切酶酶Sau3A进进行局部消化可得到行局部消化可得到10-30kb的随机片段的随机片段②② 酶酶切法：切法：整理ppt （（2））载载体与基因体与基因组组DNA大片段的大片段的连连接接①① 粘性末端直接粘性末端直接连连接接载载体与外源体与外源DNA大片段的两个末端大片段的两个末端都有相同的粘性末端。
都有相同的粘性末端如：如：Sau3A与与BamHI的的酶酶切末端直接直接连连接、人工接接、人工接头头或同聚物加尾或同聚物加尾②②人工接人工接头头法法（（adapter））人工合成的限制性内切人工合成的限制性内切酶酶粘性末端片段粘性末端片段整理ppt 各种各种酶酶的接的接头头可以向公司定做或可以向公司定做或购买购买接上人工接接上人工接头头粘性末端粘性末端CCCCCC末端末端转转移移酶酶粘性末端粘性末端③ ③ 同聚物加尾同聚物加尾整理ppt 整理ppt 4. 基因基因组组文文库库的大小的大小一个文一个文库库要包含要包含99%的基因的基因组组DNA时时所所需要的克隆数目需要的克隆数目N=ln (1-p)ln (1-f)p: 文文库库包含了整个基因包含了整个基因组组DNA的概率（的概率（99%））f: 插入插入载载体的体的DNA片段的平均片段的平均长长度占整个基因度占整个基因 组组DNA的的百分数百分数N：所需的重：所需的重组载组载体数（克隆数）体数（克隆数）ln以以e为为底底 的的对对数数整理ppt 例如：人的基因例如：人的基因组组是是 3×109 bp，插入，插入DNA片段的平均片段的平均长长度如果是度如果是1.7×104 bpN=ln (1-p)ln (1-f)=ln (1-99%)ln (1-f)=4.61×GfN=4.61×GfG：：Genome大小；大小；f：：fragment大小大小N=4.61×Gf=4.61×3×1091.7×104= 8.1×105整理ppt 1. cDNA以以mRNA为为模板模板逆逆转录转录出的出的DNA称称cDNA。
2. cDNA library二、二、 cDNA文文库库的构建的构建mRNAcDNA3’ 3’ 5’ 5’ 反反转录转录酶酶引物引物利用某种生物的利用某种生物的总总mRNA合成合成cDNA，再将，再将这这些些cDNA与与载载体体连连接，接，转转入入细细菌菌细细胞中胞中进进行保存和行保存和扩扩增，称增，称cDNA文文库库整理ppt （（1））不含内含子序列不含内含子序列 （（2）可以在）可以在细细菌中直接表达菌中直接表达 （（3）包含了所有）包含了所有编码编码蛋白蛋白质质的基因的基因 （（4）比）比DNA文文库库小小的多，容易构建的多，容易构建4. 构建构建cDNA文文库库的一般步的一般步骤骤（（1））总总RNA（（total RNA）提取）提取3. cDNA文文库库的特点的特点提取提取总总RNA有商有商业业化的化的试剂试剂盒（盒（kit）整理ppt 分离分离mRNA用商用商业业化的化的Oligo dT纤维纤维柱 利用利用mRNA都含有一段都含有一段polyA尾巴，尾巴，将将mRNA从从总总RNA（（rRNA、、tRNA等）中分离等）中分离纯纯化 mRNA只占只占总总RNA的的1%-2%。
2））mRNA的分离的分离纯纯化化① ① 原理原理②② mRNA的分离的分离纯纯化化Column（柱）（柱）整理ppt 整理ppt 反反转录转录酶酶（（3））cDNA的合成的合成①① cDNA第一第一链链合成合成逆逆转录转录酶酶能以能以RNA为为模板合成模板合成DNA 用用Oligo dT（或随机引物）作引物，合（或随机引物）作引物，合成成cDNA的第一的第一链链 mRNAcDNA3’ 5’ 5’ AAAAAAATTTTTTTOligo dT引物引物整理ppt 用用碱碱处处理或用理或用RNaseH降解降解mRNA-DNA杂杂交分子中的交分子中的mRNAmRNAcDNA3’ 3’ 5’ 5’ 反反转录转录酶酶引物引物mRNAcDNA第一第一链链3’ 3’ 5’ 5’ 引物引物cDNA第一第一链链3’ 5’ 引物引物②② 降解降解mRNA模板模板或或RNaseH碱碱整理ppt 剩下的剩下的cDNA单链单链的的3’末端一般形成一个末端一般形成一个弯弯回来的双回来的双链发链发卡卡结结构构（机理不明），可成（机理不明），可成为为合成第二条合成第二条cDNA链链的引物用的引物用DNA聚聚合合酶酶合成第二合成第二链链DNA.。
cDNA第一第一链链5’ cDNA第二第二链链合成合成DNA聚合聚合酶酶cDNA第一第一链链cDNA第二第二链链5’ 3’ ③ cDNA第二第二链链合成合成整理ppt ④④去掉去掉发发卡卡结结构构核酸核酸酶酶S1用用核酸核酸酶酶S1可以切掉可以切掉发发卡卡结结构（但构（但这这会会导导致致cDNA中有用的序列被切掉！）中有用的序列被切掉！）cDNA第一第一链链cDNA第二第二链链5’ 3’ cDNA第一第一链链cDNA第二第二链链5’ 3’ 5’ 3’ 整理ppt 整理ppt 这这种种酶酶能能识别识别mRNA-cDNA杂杂交分子中的交分子中的mRNA，并将其降解成，并将其降解成许许多小多小片段片段妙用妙用RNaseH小片段正好成小片段正好成为为DNA聚合聚合酶酶的引物，的引物，用来合成用来合成冈冈崎片段崎片段DNA Pol I除去引物并修除去引物并修补补后再使用后再使用DNA连连接接酶酶连连成一整条成一整条DNA链链整理ppt mRNAcDNA3’ 5’ 反反转录转录酶酶引物引物mRNAcDNA第一第一链链3’ 5’ 引物引物mRNAcDNA第一第一链链3’ 5’ mRNAmRNADNA 聚合聚合酶酶DNA 聚合聚合酶酶cDNA第二第二链链cDNA第一第一链链3’ 5’ RNaseHDNA ligase去引物去引物整理ppt 整理ppt 在双在双链链cDNA末端接上末端接上人工接人工接头头，即可与，即可与载载体体连连接，接，转转入受体菌。
入受体菌 或借助或借助末端末端转转移移酶酶给载给载体和双体和双链链cDNA的的3’端分端分别别加上几个加上几个C或或G，成，成为为粘性末端粘性末端5.5.cDNA与与载载体体连连接：接：接上人工接接上人工接头头粘性末端粘性末端CCCCCC末端末端转转移移酶酶整理ppt 整理ppt 6. cDNA文文库库的大小的大小一个一个cDNA文文库库要包含要包含99%的的mRNA时时所需要的克隆数目所需要的克隆数目N=ln (1-p)ln (1- )p: 文文库库包含了完整包含了完整mRNA的概率（的概率（99%））: 某一种低丰度（不足某一种低丰度（不足14份拷份拷贝贝））mRNA占占细细胞整个胞整个mRNA的比例的比例N：所需的重：所需的重组载组载体数（克隆数）体数（克隆数）1n1n整理ppt 三、文三、文库库的的查询查询（（screening））用目的基因探用目的基因探针针与文与文库库中的重中的重组组载载体体进进行行Southern blot杂杂交文文库库载载体体探探针针电电泳后泳后杂杂交交放射自放射自显显影影测测序分析序分析整理ppt 第四第四节节 目的基因的分离和目的基因的分离和扩扩增增一、从一、从mRNA分离目的基因分离目的基因1. 探探针针柱分离特异柱分离特异mRNA根据已知的基因序列合成探根据已知的基因序列合成探针针，，结结合合到到纤维纤维素柱素柱上，用来分离上，用来分离纯纯化化该该基因基因的的mRNA。
富集富集特定基因的特定基因的mRNA或或cDNA模板整理ppt 纤纤 维维 柱柱探探针针DNA探探针针DNA探探针针DNA探探针针DNATotal mRNA纤纤 维维 柱柱探探针针DNA探探针针DNA探探针针DNA探探针针DNA过过柱柱与探与探针针碱基互碱基互补补的的mRNA结结合合到柱上，其它到柱上，其它mRNA流走特异特异mRNA洗脱洗脱RT-PCR整理ppt 2. mRNA消解消解杂杂交交原理：原理：羟羟基磷灰石柱基磷灰石柱结结合合DNA-RNA或或DNA-DNA双双链链，，不不结结合合单链单链DNAHydroxylapatite column））整理ppt 从表达从表达A蛋白蛋白和不表达和不表达A蛋白的蛋白的组织细组织细胞中胞中分分别别提取和分离提取和分离总总mRNA 将表达将表达A蛋白的蛋白的mRNA合成合成cDNA第一第一链链再同不表达再同不表达A蛋白的蛋白的总总mRNA杂杂交成交成cDNA-mRNA双双链链 不能不能杂杂交的交的cDNA就包括特异表达的就包括特异表达的A基因基因的的cDNA单链单链 用用羟羟基磷灰石柱基磷灰石柱收集收集单链单链cDNA，合成，合成为为双双链链DNA进进行行扩扩增、克隆、增、克隆、测测序。
序整理ppt AAA组织组织B组织组织总总mRNA（（A））总总mRNA（（B））含蛋白含蛋白A的的mRNA不含蛋白不含蛋白A的的mRNA总总cDNA第一第一链链A杂杂交交内含蛋白内含蛋白A 的的cDNA羟羟基磷灰石柱基磷灰石柱过过柱柱吸收吸收RNA-DNA单链滤过单链滤过羟羟基磷灰石柱基磷灰石柱BAcDNA文文库库整理ppt 3. mRNA差异差异显显示示PCR（（DD RT-PCR））mRNA differential display RT-PCR（（1））3’端的端的锚锚定引物定引物Oligo(dT)引物的引物的3’端加两个核苷酸端加两个核苷酸（倒数第二个不再是（倒数第二个不再是T） AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA3’ 5’ NMTTTTTTTTM：：A、、G or C N: A、、G、、T or C5’ 3’ 整理ppt （（2））12种种锚锚定引物定引物AGTTTTTTTT5’ 3’ CGTTTTTTTT5’ 3’ GGTTTTTTTT5’ 3’ TGTTTTTTTT5’ 3’ AATTTTTTTT5’ 3’ CATTTTTTTT5’ 3’ GATTTTTTTT5’ 3’ TA TTTTTTTT5’ 3’ ACTTTTTTTT5’ 3’ CCTTTTTTTT5’ 3’ GCTTTTTTTT5’ 3’ TCTTTTTTTT5’ 3’ 整理ppt （（3））5’端的随机引端的随机引物物10 mer AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA3’ 5’ NMTTTTTTTT5’ 3’ 扩扩增增cDNA。
RTNMTTTTTTTT5’ cDNA 3’ NNNNNNNNNN5’ 3’ NNNNNNNNNN5’ 3’ cDNA第二第二链链，并，并PCR整理ppt （（4）随机引物与）随机引物与锚锚定引物成定引物成对扩对扩增增12种种锚锚定引物，若与定引物，若与20种随机引物，可种随机引物，可组组成成240组组引物引物引物组组合：合：240组组在能分出在能分出20000多条多条带带！！实验结实验结果：果：如果每条如果每条带带相当于一种相当于一种mRNA，，20000 mRNA基本上反映了一种特定基本上反映了一种特定细细胞中胞中全部的全部的mRNA在在测测序胶上，每序胶上，每组扩组扩出出50-100条条长长度度为为100-500bp的的带带整理ppt （（5）随机）随机-锚锚定引物定引物PCR的的产产物物电电泳比泳比较较不同不同组织组织的的240组组引物引物组组合合PCR产产物在物在测测序胶中序胶中电电泳选择选择有差异的有差异的带带，，进进一步一步PCR作探作探针针筛选筛选文文库库，找到差，找到差别别基因的全基因的全长长序列整理ppt 二、二、PCR技技术获术获得目的基因得目的基因1. 直接从基因直接从基因组组中中扩扩增增（（1）提取基因）提取基因组组DNA作模板作模板（（2）根据）根据已知已知目的基因序列目的基因序列设计设计引物引物（（3））PCR扩扩增增真核生物基因真核生物基因组组含有内含子！含有内含子！适合适合扩扩增原核生物基因。
增原核生物基因一一)已知目的基因序列已知目的基因序列整理ppt 原核基因原核基因组组部分部分原核原核细细胞胞提取基因提取基因组组DNAPCR扩扩增增整理ppt （（1）提取基因）提取基因组组 total RNA（（2）反）反转录转录合成合成总总cDNA作模板作模板（（4））PCR扩扩增增（（3）根据）根据已知已知目的基因序列目的基因序列设计设计引物引物2. 从从mRNA中中扩扩增增: RT-PCR原核生物不易得到原核生物不易得到mRNA，也不含有，也不含有polyA尾适合适合扩扩增真核生物基因增真核生物基因整理ppt 目的基因目的基因 的引物的引物1反反转录转录成目的基因成目的基因cDNA第一第一链链目的基因目的基因 的引物的引物2目的目的 基因基因cDNA第二第二链链PCRmRNA整理ppt (二二)未知目的基因序列未知目的基因序列（（1）反向）反向PCR 扩扩增两个增两个引物外引物外侧侧的未知序列的未知序列把把线线性性DNA模板模板转变转变成成环环形分子templatetemplate3’ 5’ 5’ 3’ （（传统传统PCRPCR只只扩扩增两个引物增两个引物质质之之间间的已知序列）。
的已知序列）技技术术关关键键：：整理ppt 使引物的外使引物的外侧侧序列序列 “转变转变” 成内成内侧侧序列整理ppt (2)盒式盒式PCR盒式PCR （Cassette PCR） 是利用Cassette(人工合成的带有适当限制性内切酶粘末端较长的双链DNA分子)和Cassette 上的引物，特异性扩增目的基因组DNA未知区域的一种有效的方法 整理ppt 原理原理首先用适当的在已知DNA区没有识别位点的酶切割，产生含上下游未知区域DNA分子，然后与含有对应限制酶切位点的Cassette进行连接，接着用Cassette 引物1（C1）和根据已知区域设计的特异引物1（S1）进行第一次扩增，最后用 Cassette 引物2（C1）和根据已知区域设计的特异引物2（S2）进行第二次扩增在设计上Cassette的5`端为-OH，所以目的DNA的3`末`端和Cassette的5`末端连接部位形成缺口因此第一次PCR反应从引物C1开始延伸反应在连接部位终止，控制了非特异性扩增只有从引物S1延伸合成的DNA链，才能成为引物C1的模板，进行扩增反应再用内侧引物（C2，S2）进一步进行巢式PCR，高效特异地扩增目的DNA未知区域。
整理ppt (3)RACE技技术术 RACE（Rapid Amplification of cDNA ends）是一种通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术，是以mRNA为模板反转录成cDNA 第一条链后用PCR技术扩增出某个特异位点到3`或5`之间的未知序列的方法,分别称为3`-RACE或 5`-RACE 锚定(Anchored PCR)和反向PCR都可以用于RACE技术，经典RACE就是基于锚定PCR技术原理设计的，而高特异性的RACE是借助于反向PCR技术整理ppt 3`-RACE原理原理 TTTTT-Q1-Q05`AAAAA3` QTTTTTT-Q1-Q0第一第一链链cDNAQT第一次扩增 GSP1Q0第二次扩增Q1 GSP2反转录图图 经经典典3`-RACE整理ppt 5`-RACE原理原理第一第一链链cDNA5`3` ORF GSP-RTGSP-RT 逆逆转录转录 cDNA 加尾加尾 第一第一链链cDNAGSP-RTAAAA 第一次扩增 Q1-TTTT AAAA第二次扩增Q1图图 经经典典5`-RACEGSP1GSP2整理ppt 高特异性的5’-RACE原理原理高特异性的RACE基于反向PCR扩增技术,它利用已知序列内部高特异性的嵌套引物进行扩增的原理，故具有较高的特异性。
A A A A A A3’已知序列Pi 5’端磷酸化特异引物逆逆转录转录 A A A A A A3’已知序列RNaseH降解掉mRNAT4RNALigase环化单链cDNAA2 A1 S1 S2 PCR1 A1、S1PCR2S2、A2整理ppt 三、三、转转座子座子标签标签法法转座子是一类可以在同一条染色体不同位点或不同染色体间转移的一段特殊的DNA 原理转座子插入基因失活或突变构建纯合突变株基因组文库转座子为探针筛选出包含目的基因片段的阳性克隆目的基因片段为探针筛选野生型的植株构建的基因组文库测序整理ppt 目的基因目的基因标签标签法法 × 转座子 导入 (含转座子的显性纯合体) A A* （隐性纯合体）a a (显性表型)Aa （突变或隐性表型 ）A*a 自交 aa A*a （突（突变纯变纯合子）合子）A*A* 建基因文建基因文库库 目的基因目的基因对应对应的的显显性性隐隐性性状个体都有性性状个体都有整理ppt 非目的基因非目的基因标签标签法法 × 转座子 导入 (含转座子的显性纯合体) A A* （显性纯合体）AA （突变或显性表型 ）A*A 自交 AA A*A（突（突变纯变纯合子）合子）A*A* 建基因文建基因文库库 （显性纯合体）AA 关注的是一群因关注的是一群因关注的是一群因关注的是一群因转转转转座子插入引起座子插入引起座子插入引起座子插入引起突突突突变变变变的性状的基的性状的基的性状的基的性状的基因，目的是因，目的是因，目的是因，目的是筛选筛选筛选筛选于某一性状相关于某一性状相关于某一性状相关于某一性状相关的几个基因的几个基因的几个基因的几个基因整理ppt 转转座子探座子探针针 转转座子座子标签标签法流程法流程图图 突变纯合子基因文库 转转座子座子目的片段目的片段 亚亚克隆克隆 PCR获获得全得全长长基因基因 筛选 野生型植野生型植株基因文株基因文库库全长目的基因 整理ppt 四、四、图图位克隆法位克隆法图图图图位克隆：位克隆：位克隆：位克隆：根据目的基因在基因根据目的基因在基因根据目的基因在基因根据目的基因在基因组组组组上的位置特性而不上的位置特性而不上的位置特性而不上的位置特性而不 是其是其是其是其编码产编码产编码产编码产物来物来物来物来进进进进行基因克隆。
行基因克隆行基因克隆行基因克隆基因定位的基本步基因定位的基本步骤骤：：1、通、通过过DNA连锁连锁分析、染色体缺失或平衡易位等分析、染色体缺失或平衡易位等方法将目的基因或其突方法将目的基因或其突变变定位到染色体上定位到染色体上2、在目的基因的一、在目的基因的一侧侧或两或两侧侧确定一条或两条确定一条或两条紧紧密密连锁连锁的的RFLP或或RAPD分子分子标记标记，也可以是已知序，也可以是已知序列基因片段，两者列基因片段，两者统统称称为为DNA分子分子标记标记3、利用、利用紧紧密密连锁连锁的分子的分子标记标记序列作探序列作探针针，通，通过过染染色体步移、染色体登色体步移、染色体登陆陆等技等技术术逐步逼近并最逐步逼近并最终终将目将目的基因分离出来的基因分离出来整理ppt 1、染色体步、染色体步移移染色体步移：利用与目的基因紧密连锁的标记DNA片段为探针筛选基因组文库，用已获得的阳性克隆的DNA片段的末端DNA为探针继续筛选，如此进行下去，直到获得含目的基因两侧序列为止整理ppt ●●● 筛选 已知的分子标记基因 未知的目的基因350kbYAC 基因组文库分子标记探针筛选 阳性克隆a探针a探针b阳性克隆b重复筛选直到获得目的基因含目的基因的克隆图 染色体步移筛选目的基因整理ppt 2 2、染色体登、染色体登、染色体登、染色体登陆陆陆陆如基因如基因组组文文库库的平均插入片段的的平均插入片段的长长度大于目度大于目的基因与已知分子的基因与已知分子标记标记的物理距离，就可以的物理距离，就可以通通过筛库过筛库直接直接获获得含目的基因的大片段克隆，得含目的基因的大片段克隆，接着从中分离出目的基因。
接着从中分离出目的基因这样这样就完全避开就完全避开了步移，了步移，这这种方法称种方法称为为染色体登染色体登陆陆 染色体步移往往因染色体步移往往因为为得不到重叠克隆而被得不到重叠克隆而被打断造成前功尽弃或因打断造成前功尽弃或因为为基因基因组组的复的复杂杂性性高而遇到重复序列改高而遇到重复序列改变变步移方向步移方向误误入歧途整理ppt 分子标记 Marker 目的基因 Target gene 100kb 探针 基因组文库 插入DNA ≥100kb 阳性克隆进一步证实目的基因图 染色体登陆筛选目的基因整理ppt 第五第五节节 酵母双酵母双杂杂交系交系统统Yeast Two Hybrid System (Interaction trap)90年代，年代，纽约纽约大学的大学的S. Field等建立整理ppt 有效地分离能与一种已知的靶蛋白相互有效地分离能与一种已知的靶蛋白相互作用的蛋白作用的蛋白质质二、酵母双二、酵母双杂杂交系交系统统的原理的原理许许多真核生物的多真核生物的转录转录激活因子激活因子都是由两个都是由两个在在结结构上可以分开的、功能上也相互独立构上可以分开的、功能上也相互独立的的结结构域构域组组成。
成1. 结结构域（构域（Domain）合作）合作一、酵母双一、酵母双杂杂交系交系统统的作用的作用整理ppt 例如：例如： 啤酒酵母的半乳糖苷啤酒酵母的半乳糖苷酶酶基因激活因子基因激活因子GAL4:DNA binding domainActive domainNC1-147aa768-881aa上游激活序列（上游激活序列（UAS））转录转录机机GAL4效效应应基因基因结结合合结结合合激活激活转录转录只要只要DNA binding domain（（DNA-BD）与）与Active domain（（AD）靠近就能）靠近就能够够表表现转录现转录激活活性激活活性实验发现实验发现：：转录转录表达表达整理ppt 2. 拆开拆开 DomainDNA binding domainActive domain上游激活序列（上游激活序列（UAS））转录转录机机GAL4效效应应基因基因结结合合用重用重组组DNA技技术术把把GAL4的两个的两个Domain分分开，就开，就丧丧失失了激活效了激活效应应基因的能力基因的能力不能不能转录转录整理ppt 3. 重重组组Domain用重用重组组DNA技技术术把把这这两个两个Domain分分别别与与两个不同的多两个不同的多肽连肽连接。
接Active domain蛋白蛋白A蛋白蛋白BDNA binding domain在体内，蛋白在体内，蛋白A与蛋白与蛋白B是否能是否能结结合通通过过效效应应基因是否被激活来基因是否被激活来检查检查：：4. 观观察察报报告基因表达告基因表达整理ppt 上游激活序列（上游激活序列（UAS））转录转录机机GAL4效效应应基因基因蛋白蛋白ADNA binding domain转录转录激活激活domain蛋白蛋白BGAL4的的DB domain与与AD Domain也不也不能靠近能靠近，所以仍然不能启，所以仍然不能启动动效效应应基因基因的的转录转录不能不能转录转录（（1）如果蛋白）如果蛋白A与蛋白与蛋白B不能相互不能相互结结合合整理ppt 上游激活序列（上游激活序列（UAS））转录转录机机GAL4效效应应基因基因蛋白蛋白ADNA binding domain转录转录激活激活domain蛋白蛋白B激活激活转录转录GAL4的的DB domain与与AD Domain也能也能靠近靠近，所以能启，所以能启动动效效应应基因的基因的转录转录转录转录表达表达（（2）如果蛋白）如果蛋白A与蛋白与蛋白B能相互能相互结结合合整理ppt 双双杂杂交原理交原理X基因和基因和Y基因基因产产物的相互物的相互结结合，合，导导致致reporter gene表表达。
达Reporter gene表表达就可达就可说说明明X基基因因产产物于物于Y基因基因产产物能物能结结合整理ppt 三、构建双三、构建双杂杂交体系的宿主菌交体系的宿主菌 删删除基因除基因组组中的内源野生型中的内源野生型GAL4基因基因使酵母菌只能利用使酵母菌只能利用载载体体表达的表达的GAL4蛋白如：如： SFY526; HF7c等菌株四、构建四、构建报报告基因（告基因（reporter gene））GAL4激活激活组组氨酸合成氨酸合成酶酶的表达，使酵母的表达，使酵母菌能生菌能生长长在在组组氨酸缺乏培养基氨酸缺乏培养基上GAL4的效的效应应基因是基因是his3/lacZ/URA3此外此外还还有其他有其他营营养缺陷整理ppt 1. 穿梭穿梭质质粒（粒（shuttle plasmid））五、构建双五、构建双杂杂交体系的穿梭交体系的穿梭质质粒粒既能在大既能在大肠肠杆菌中复制，又能在酵母杆菌中复制，又能在酵母菌中复制和表达的菌中复制和表达的质质粒2. 双双杂杂交体系需要两种穿梭交体系需要两种穿梭质质粒粒分分别别携携带带已知的靶蛋白基因已知的靶蛋白基因和携和携带带未未知基因知基因序列整理ppt 靶基因按正确的靶基因按正确的读码结读码结构和取向克隆在构和取向克隆在GAL4的的BD之后。
之后1））BD-plasmidP: ADH1启启动动子 T: ADH1终终止子筛选标筛选标志：志：TRP核定位信号是核定位信号是GAL4本身的一部分本身的一部分ADH：：Alcohol dehydrogenase整理ppt （（2））AD-plasmid外源基因按正确外源基因按正确阅读阅读框克隆到框克隆到GAL4的的AD片段之后片段之后P: ADHI启启动动子 T: ADHI终终止子筛选标筛选标志：志：LEU2核定位信号是核定位信号是SV40SV40的的T T抗原的抗原的序列序列整理ppt 六、酵母双六、酵母双杂杂交的交的实验过实验过程程1. 把蛋白把蛋白A插入到插入到BD质质粒上（粒上（pGBT9））2. 把蛋白把蛋白B插入到插入到AD质质粒上（粒上（pGAD424））3. 两种重两种重组质组质粒共同粒共同转转化酵母菌（化酵母菌（HF7c））报报告基因：告基因：HIS（合成（合成组组氨酸）氨酸）4. 筛选观筛选观察察整理ppt （（1）存活）存活选择选择在缺少在缺少亮氨酸（亮氨酸（LEU）和色氨酸（）和色氨酸（TRP））培培养基上养基上筛选筛选双双载载体体转转化子双双载载体体转转化才能合成化才能合成亮氨酸和色氨亮氨酸和色氨酸酸，菌体存活。
菌体存活Trp-Leu-整理ppt 在缺少在缺少组组氨酸（氨酸（HIS）、亮氨酸（）、亮氨酸（LEU）和）和色氨酸（色氨酸（TRP））的培养基上的培养基上筛选筛选蛋白蛋白A和蛋和蛋白白B能相互作用的双能相互作用的双载载体体转转化子2）蛋白）蛋白结结合合选择选择His-Trp-Leu-整理ppt 第五章第五章 作作业业1、什么是基因、什么是基因组组文文库库(genomic library)?构建基因构建基因组组文文库库，，涉及哪些基涉及哪些基本本过过程程?它同它同遗传遗传学上的基因学上的基因库库有什么不同有什么不同?2、构建、构建cDNA文文库时库时需要用到哪些工具需要用到哪些工具酶酶？？ 3、什么是、什么是cDNA文文库库(complement DNA library)?同基因同基因组组文文库库有何差有何差别别?整理ppt 化学合成化学合成DNA亚亚亚亚磷酸三磷酸三磷酸三磷酸三酯酯酯酯法法法法(1)脱二苯甲基保护基(2)活化新的碱基(3)缩合反应(4)盖帽反应(5)氧化反应化学合成化学合成DNA的用的用处处1. 直接合成基因直接合成基因2. 合成引物（合成引物（20mer左右）左右）3. 合成探合成探针针序列序列4. 定点突定点突变变合成合成5. 合成人工接合成人工接头头或或衔衔接物接物整理ppt 将某种生物将某种生物细细胞的胞的整个基因整个基因组组DNA切割切割成大小合适的片段，并将成大小合适的片段，并将所有所有这这些片段些片段都与适当的都与适当的载载体体连连接，引入相接，引入相应应的宿主的宿主细细胞中胞中保存和保存和扩扩增增。
理理论论上上讲讲，，这这些重些重组载组载体上体上带带有了有了该该生生物体的物体的全部基因全部基因，称，称为为基因文基因文库库基因文基因文库库（（gene library））整理ppt cDNA 文文库库利用某种生物的利用某种生物的总总mRNA合成合成cDNA，再将，再将这这些些cDNA与与载载体体连连接，接，转转入入细细菌菌细细胞中胞中进进行保存和行保存和扩扩增，称增，称cDNA文文库库整理ppt 2. mRNA消解消解杂杂交交原理：原理：羟羟基磷灰石柱基磷灰石柱结结合合DNA-RNA或或DNA-DNA双双链链，，不不结结合合单链单链DNA整理ppt AAA组织组织B组织组织总总mRNA（（A））总总mRNA（（B））含蛋白含蛋白A的的mRNA不含蛋白不含蛋白A的的mRNA总总cDNA第一第一链链A杂杂交交内含蛋白内含蛋白A 的的cDNA羟羟基磷灰石柱基磷灰石柱过过柱柱吸收吸收RNA-DNA单链滤过单链滤过羟羟基磷灰石柱基磷灰石柱BAcDNA文文库库整理ppt mRNA差异差异显显示示PCR（（DD RT-PCR））反向反向PCR 盒式盒式PCRRACE技技术术 整理ppt 转转座子座子标签标签法法图图位克隆法位克隆法1、染色体步、染色体步移移染色体步移：利用与目的基因紧密连锁的标记DNA片段为探针筛选基因组文库，用已获得的阳性克隆的DNA片段的末端DNA为探针继续筛选，如此进行下去，直到获得含目的基因两侧序列为止。
整理ppt 2 2、染色体登、染色体登、染色体登、染色体登陆陆陆陆如基因如基因组组文文库库的平均插入片段的的平均插入片段的长长度大于目度大于目的基因与已知分子的基因与已知分子标记标记的物理距离，就可以的物理距离，就可以通通过筛库过筛库直接直接获获得含目的基因的大片段克隆，得含目的基因的大片段克隆，接着从中分离出目的基因接着从中分离出目的基因这样这样就完全避开就完全避开了步移，了步移，这这种方法称种方法称为为染色体登染色体登陆陆 整理ppt 。