实验七 细菌接合（conjugation)•实验内容：学生操作：接合试验 讨论课：炭疽芽胞杆菌、铜绿假单胞菌鼠疫耶氏菌、放线菌属/布鲁菌 • 通过性菌毛使供菌与受菌接触，将供菌的遗通过性菌毛使供菌与受菌接触，将供菌的遗传物质转移到受菌内，使受菌获得供菌某些遗传传物质转移到受菌内，使受菌获得供菌某些遗传性状的基因转移方式称性状的基因转移方式称 接合接合(conjugation)(conjugation) 只有带有只有带有接合性质粒接合性质粒的细菌才能通过接合转的细菌才能通过接合转移遗传物质移遗传物质接合性质粒包括接合性质粒包括F F质粒、质粒、R R质粒、质粒、ColCol质粒质粒等接合配对是由接合配对是由致育因子致育因子(F(F质粒质粒) )的存在所决定的存在所决定的的 ，因为，因为F F质粒基因编码性菌毛质粒基因编码性菌毛细菌接合实验原理细菌接合实验原理 细菌性菌毛与接合过程细菌性菌毛与接合过程 •实验材料：实验材料：（（3 3人一组）人一组）•菌菌 株株: : 供菌供菌 （（A A）） 鼠伤寒沙门氯霉素耐药株鼠伤寒沙门氯霉素耐药株受菌受菌 （（B B）） 大肠杆菌氯霉素敏感株大肠杆菌氯霉素敏感株•培养基培养基: : 1ml 1ml 肉汤试管肉汤试管3 3支、含氯霉素麦康凯支、含氯霉素麦康凯 (MacCokey)(MacCokey)平板平板3 3块、不含氯霉素麦康块、不含氯霉素麦康凯凯 (MacCokey)(MacCokey)平板平板1 1块（贴纸标签）块（贴纸标签） •其它器材其它器材: : 100 100μ μl l 加样器加样器 无菌加样器枪头无菌加样器枪头Q1: 如何确定鼠伤寒沙门菌含氯霉素耐药质粒（R质粒）？ 操作步骤1. 1.分别吸取分别吸取0.1ml0.1ml供体菌和受体菌于供体菌和受体菌于2 2支支1ml1ml肉汤管中，另各吸取肉汤管中，另各吸取0.1ml0.1ml供体菌和受体供体菌和受体菌于菌于1ml1ml肉汤管中混合，置肉汤管中混合，置37℃37℃温箱温箱1-21-2小时培养。
小时培养2. 2.上述培养物分别接种麦康凯平板，培养上述培养物分别接种麦康凯平板，培养24h24h，观察结果，观察结果 • 供体菌供体菌 受体菌受体菌1ml1ml肉汤肉汤1ml1ml肉汤肉汤1ml1ml肉汤肉汤0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml37℃37℃37℃37℃温箱温箱温箱温箱1-21-21-21-2小时培养小时培养小时培养小时培养含氯霉素麦含氯霉素麦康凯平板康凯平板含氯霉素麦含氯霉素麦康凯平板康凯平板含氯霉素麦含氯霉素麦康凯平板康凯平板 不含氯霉素不含氯霉素麦康凯平板麦康凯平板 麦康凯平板上的两种菌落麦康凯平板上的两种菌落沙门氏菌沙门氏菌大肠杆菌大肠杆菌 Q2: 如何证明大肠杆菌获得氯霉素耐药性是由于细菌接合，而不是由其它遗传物质传递方式而导致的变异呢？无色透明菌落 无色透明菌落和粉红色不透明菌落无菌落生长经经37℃24h37℃24h培养后培养后无色透明菌落和粉红色不透明菌落含氯霉素麦康凯平板含氯霉素麦康凯平板不含不含氯霉素氯霉素麦康凯平板麦康凯平板 讨论课专题Ø白喉棒状杆菌Ø流感嗜血杆菌Ø军团菌Ø鲍特菌Ø炭疽芽胞杆菌Ø铜绿假单胞菌Ø鼠疫耶氏菌Ø放线菌属/布鲁菌（实验七）（实验六） 讨论课注意事项：1.时间：20min2.内容：前期选定3.形式：不限4.评分：同学间自评为主 主要生物特性：形态：G+, 粗大截平、竹节样链状排列，可形成芽胞（对氧化剂敏感）培养：多需氧、肉汤培养基，絮状沉淀生长；穿刺明胶培养基：倒松树状致病特性：致病：炭疽（anthrax), 包括皮肤（黑色焦痂）、肠、肺炭疽毒力因子：炭疽毒素（保护性抗原结合致死因子和水肿因子构成复合物）流行：摄食或接触感染动物、畜产品免疫、预防和治疗：免疫性：抗毒素、吞噬细胞，感染获持久免疫力预防：炭疽减毒疫苗、皮上划痕接种治疗：首选青霉素G，过敏者用环丙沙星、红霉素等检查：标本：患者病灶取材（水泡、血液、痰、粪便等）、动物割耳、舌尖（禁室外解剖、注意防护和扩散）镜检：涂片G+, 粗大杆菌、或荧光抗体染色分离培养：青霉素串珠试验炭疽芽胞杆菌 铜绿假单胞菌主要生物特性：形态：G-, 有荚膜和单极鞭毛培养：专性需氧、产青脓素和绿脓素致病特性：致病：为肠道正常菌群，可致局部化脓，如中耳、角膜、尿道、脓胸等毒力因子：内毒素（LPS和OEP)为主、密度感知系统（QS系统）；荚膜、酶和外毒素等流行：院内感染常见免疫、预防和治疗：免疫性：中性粒细胞吞噬为主、抗体、粘膜免疫参与预防：OEP疫苗等，防院内感染治疗：庆大霉素，多粘菌素等，注意多种耐药性。
检查：标本：病灶取材（脓液、血液、脑脊液等）分离培养：血琼脂平板见绿色水溶性色素 鼠疫耶尔森菌主要生物特性：形态：属肠杆菌科，两端钝圆、两极浓染卵圆形G-, 培养：27-30℃最适，肉汤培养48h可形成菌膜，摇动呈“钟乳石”状下沉变异：野生株呈R型菌落，人工培养成S型，毒力减弱（与其它菌相反）致病特性：致病：鼠疫（自然疫源性、甲类法定烈性传染病），包括腺鼠疫（腹股沟和腋下淋巴结炎）、肺鼠疫（黑死病）、败血症型鼠疫毒力因子：F1抗原（荚膜抗原)、V/W抗原（抗吞噬，可胞内寄生）、外膜蛋白、鼠毒素（细菌自溶释放、作用心血管系统）、内毒素等流行：鼠蚤叮咬或剥食感染动物免疫、预防和治疗：免疫性：抗体为主，感染可获牢固免疫力预防：灭鼠（储存宿主）、灭蚤（传播媒介）无毒株EV活疫苗，皮上划痕、皮下或皮内注射治疗：及早用抗生素、如链霉素联合磺胺或四环素等合用检查：标本：专用实验室操作取材（穿刺淋巴液、血液、痰、分泌物等）镜检：涂片染色（见特性）血清学、核酸检测等辅助 布鲁氏菌主要生物特性：形态：G-, 有微荚膜培养：需氧、分离需含5-10% CO2；不溶血，可分解尿素和产生H2S抵抗力：巴氏消毒法可灭菌（鲜奶）致病特性：致病：布鲁氏菌病（多次菌血症、波浪热），引起家畜流产，睾丸炎、乳腺炎等，易转为慢性毒力因子：内毒素为主、微荚膜、侵袭性酶等流行：接触病畜、或畜产品，多途径感染免疫、预防和治疗：免疫性：细胞免疫为主（布鲁菌可在中性粒、巨噬细胞内寄生）预防：避免接触病畜；接种家畜，疫区人群接种减毒活疫苗治疗：利福平联合多西环素、四环素，神经受累者四环素合用链霉素检查：标本：血液、骨髓，动物患病脏器等分离培养：4-7天可形成菌落、结合H2S、血清学（检测A和M菌体抗原）确定型别皮试（皮下注射布鲁菌素）：阳性者为慢性或曾经患过布鲁氏菌病 放线菌属主要生物特性：形态：G+, 有放射状菌丝和孢子，似真菌培养：厌氧或微需氧（加5%CO2)、难培养，葡萄糖肉汤培养可见灰白色球形颗粒致病特性：致病：为口腔等开放通道的正常菌群，致软组织化脓性炎症，伴慢性肉芽肿、多发性瘘管等，面颈部感染最为常见，可引起脑膜炎、脓肿，肺部感染、腹部、盆腔感染、龋齿和牙周炎等。
免疫、预防和治疗：免疫性：细胞免疫为主、抗体无保护作用预防：注意口腔卫生、及时治疗口腔疾病治疗：首选青霉素，亦可克林霉素、红霉素、林可霉素等检查：标本：病灶取材（脓液、痰液、组织切片等）镜检：找硫磺样颗粒（黄色小颗粒），压片染色见放射状排列菌丝、菊花状 。
