背景知识六菌种保藏技术

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1、背景知识六：菌种保藏技术背景知识六：菌种保藏技术武武汉职业技技术学院学院微生物技术应用微生物技术应用微生物会发生变化吗？微生物会发生变化吗？分离得到的微生物可以直接用于生产吗？分离得到的微生物可以直接用于生产吗？怎样保存微生物？怎样保存微生物？知识节点一知识节点一 遗传变异的物质基础遗传变异的物质基础知识节点二知识节点二 原核微生物的基因重组原核微生物的基因重组知识节点三知识节点三 真核微生物的基因重组真核微生物的基因重组知识节点四知识节点四 微生物育种技术微生物育种技术知识节点五知识节点五 菌种保藏技术菌种保藏技术知识节点一 遗传变异的物质基础 遗传：遗传： 变异：变异： 遗传型遗传型/基因

2、型：基因型： 表型：指某一生物体所具有的一切外表特征及内在表型：指某一生物体所具有的一切外表特征及内在特性的总和，是遗传型在合适环境下的具体体现。特性的总和，是遗传型在合适环境下的具体体现。 饰变：指微生物的某些改变是指不涉及遗传物质结饰变：指微生物的某些改变是指不涉及遗传物质结构改变，而只发生在转录、转译水平上的表型变化。构改变，而只发生在转录、转译水平上的表型变化。 一、三个经典实验证实核酸是遗传变异的物质基础一、三个经典实验证实核酸是遗传变异的物质基础 （一）经典转化实验：（一）经典转化实验：2、细菌培养试验、细菌培养试验 热死热死S菌菌 不生长不生长肺炎双球菌肺炎双球菌 活活R菌菌 长

3、出长出R菌菌 热死热死S菌菌+活活R菌菌 长出大量长出大量R菌菌+10-6S菌菌 （二）噬菌体感染实验（二）噬菌体感染实验 （三）植物病毒的重建实验（三）植物病毒的重建实验TMV重建实验示意图重建实验示意图(箭头表示遗传信息的去向箭头表示遗传信息的去向) 二、遗传物质在细胞内的存在部位和方式二、遗传物质在细胞内的存在部位和方式 (一一)细胞水平细胞水平1 核染色体核染色体 2 质粒质粒 （1）致育因子（）致育因子（F因子）又称致育因子或性因子因子）又称致育因子或性因子 （2）抗性因子（）抗性因子（R因子）因子） 又称又称R质粒质粒 （3）产细菌素因子）产细菌素因子 （ 4）诱癌质粒（）诱癌质粒

4、（Ti质粒）质粒） （5）巨大质粒（）巨大质粒（mega质粒）质粒） （6）降解性质粒）降解性质粒 (二二)分子水平分子水平核酸（核酸（DNA、RNA）知识节点二 原核微生物的基因重组基因重组：将两个不同性状个体细胞内的遗传基因移到一个个体细胞基因重组：将两个不同性状个体细胞内的遗传基因移到一个个体细胞内，经过遗传分子间的重新组合，形成新的遗传性个体的过程。内，经过遗传分子间的重新组合，形成新的遗传性个体的过程。 获取外源获取外源DNA的方式的方式原核微生物原核微生物 转化转化 裸露的裸露的DNA基因重组的方式基因重组的方式 转导转导 噬菌体作媒介噬菌体作媒介 接合接合 细菌之间的接触细菌之间

5、的接触相同：基因转移导致遗传重组相同：基因转移导致遗传重组一、转化一、转化 （一）定义（一）定义 转化或转化作用：转化或转化作用： 转化因子：具有转化活性的外来转化因子：具有转化活性的外来DNA片段片段 转化子：转化后出现了供体性状的受体细胞转化子：转化后出现了供体性状的受体细胞（二）转化微生物的种类（二）转化微生物的种类 肺炎链球菌、嗜血杆菌属、芽孢杆菌属、奈瑟氏球菌肺炎链球菌、嗜血杆菌属、芽孢杆菌属、奈瑟氏球菌属）、根瘤菌属、葡萄球菌属、假单胞菌属和黄单胞菌属属）、根瘤菌属、葡萄球菌属、假单胞菌属和黄单胞菌属 （三）转化的条件（三）转化的条件能进行转化的受体细胞必须处于能进行转化的受体细胞

6、必须处于感受态感受态，同时有外源，同时有外源DNA片段存在，片段存在，才能实现其转化。才能实现其转化。 （四）转化过程（四）转化过程 （五）与转染区别）（五）与转染区别）抗链霉素基因抗链霉素基因strr链霉素敏感型基因链霉素敏感型基因strs二、转导二、转导完全缺陷噬菌体：完全缺陷噬菌体：转导噬菌体转导噬菌体/转导颗粒转导颗粒 部分缺陷噬菌体：部分缺陷噬菌体：转导子：获得新遗传性状的受体细胞转导子：获得新遗传性状的受体细胞（一）普遍转导（一）普遍转导 1 完全普遍转导完全普遍转导2 流产转导流产转导 （二）局限转导（二）局限转导 1. 低频转导低频转导 （LFT）部分缺陷噬菌体的形成部分缺陷噬

7、菌体的形成当部分缺陷噬菌体感染宿主细胞并整合在宿主的核基因组上时，当部分缺陷噬菌体感染宿主细胞并整合在宿主的核基因组上时，可使宿主细胞成为一个局限转导子（而不是一个溶源菌，可使宿主细胞成为一个局限转导子（而不是一个溶源菌， 对对噬菌体不具有免疫性）。噬菌体不具有免疫性）。2. 高频转导高频转导 （HFT）当双重溶源菌被紫外线等诱导时，其中的正常当双重溶源菌被紫外线等诱导时，其中的正常噬菌体的基因噬菌体的基因可补偿可补偿dgal所缺失的部分基因功能，因而两种噬菌体就同时所缺失的部分基因功能，因而两种噬菌体就同时获得复制的机会。获得复制的机会。因此由双重溶源菌所产生的裂解物中，含有因此由双重溶源菌

8、所产生的裂解物中，含有等量的等量的和和dgal粒子粒子，这就称，这就称HFT（高频转导）裂解物（高频转导）裂解物（三）普遍性转导和局限性转导的比较（三）普遍性转导和局限性转导的比较比比较项目目 普遍性普遍性转导 局限性局限性转导转导的的发生生噬菌体形成噬菌体形成形成机制形成机制内含内含DNADNA转导性状性状转导过程程转导子子自然自然发生生 错误的包装的包装包裹包裹选择模型模型只含宿主染色体只含宿主染色体DNADNA供体的任何性状供体的任何性状通通过双交双交换使使转导DNADNA替替换了受了受体体DNADNA同源区同源区不能使受体菌溶源化不能使受体菌溶源化转导特性特性稳定定人工人工诱导如如UV

9、UV等等前噬菌体反常切除前噬菌体反常切除杂种形成模型种形成模型同同时含有噬菌体含有噬菌体DNADNA和宿主和宿主DNADNA多多为前噬菌体前噬菌体邻近两端的近两端的DNADNA片段片段转导DNADNA插入，使受体菌插入，使受体菌为部分二倍体部分二倍体为缺陷溶源菌缺陷溶源菌转导特性不特性不稳定定 三、接合三、接合 （一）定义（一）定义 接合：供体菌（接合：供体菌（“雄雄”）通过其性菌毛与受体菌（）通过其性菌毛与受体菌（“雌雌”）相）相接触，前者传递不同长度的单链接触，前者传递不同长度的单链DNA给后者，并在后者细胞中进给后者，并在后者细胞中进行双链化或进一步与核染色体发生交换、整合，从而使后者获

10、得行双链化或进一步与核染色体发生交换、整合，从而使后者获得供体菌的遗传性状的现象。供体菌的遗传性状的现象。接合子：通过接合而获得新性状的受体细胞。接合子：通过接合而获得新性状的受体细胞。（二）（二）Ecoli的四种接合型菌株的四种接合型菌株（三）几种杂交的结果：（三）几种杂交的结果： 1.F+ 与与F-的杂交的杂交 杂交的结果：供体菌和受体菌均成为杂交的结果：供体菌和受体菌均成为F+细胞细胞 没有供体菌染色体没有供体菌染色体DNA的转移的转移 2. Hfr 与与F- 的杂交的杂交 杂交后的受体细胞仍然是杂交后的受体细胞仍然是F- 部分供体菌部分供体菌DNA染色体转移到受体菌中染色体转移到受体菌

11、中 3. F与与F-杂交杂交 受体细胞也就变成了受体细胞也就变成了F 部分宿主细胞的部分宿主细胞的DNA随随F因子进入受体菌细胞因子进入受体菌细胞（四）原生质体融合（四）原生质体融合 是将遗传性状不同的两种菌融合为一个新细胞是将遗传性状不同的两种菌融合为一个新细胞的过程的过程 主要包括原生质体的制备、原生质体的融合、原主要包括原生质体的制备、原生质体的融合、原生质体再生和融合子的选择等步骤。生质体再生和融合子的选择等步骤。知识节点三 真核微生物的基因重组 一、有性杂交一、有性杂交 一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组，并一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组，并产生新遗传型后代的一种

12、育种技术产生新遗传型后代的一种育种技术 二、准性生殖二、准性生殖 是一种类似于有性生殖，但比有性生殖更为原始的一是一种类似于有性生殖，但比有性生殖更为原始的一种生殖方式，它可使同种物两个不同菌株的体细胞发生融种生殖方式，它可使同种物两个不同菌株的体细胞发生融合，并不经过减数分裂就能导致基因重组的生殖过程合，并不经过减数分裂就能导致基因重组的生殖过程 准性生殖和有性生殖的比较准性生殖和有性生殖的比较知识节点四 微生物育种 微生物菌种选育途径：自然选育、定向选育、诱变育种、杂交微生物菌种选育途径：自然选育、定向选育、诱变育种、杂交育种育种 一、利用自发突变进行的育种一、利用自发突变进行的育种 （一

13、）自发突变原因（一）自发突变原因 1.环境因素对微生物的诱变作用环境因素对微生物的诱变作用 各种短波辐射和高温等各种短波辐射和高温等 2.DNA复制复制 3.微生物自身产诱变物质微生物自身产诱变物质 （二）自发突变与育种（二）自发突变与育种 1.自然选育自然选育 在日常生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自发在日常生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自发突变，从而选育出优良菌种的过程突变，从而选育出优良菌种的过程 2.定向育种定向育种 是指在某一特定条件下，用某一特定因素长期处理某微是指在某一特定条件下，用某一特定因素长期处理某微生物的群体，同时不断地对它们进行移种传代，以积累自生物的群体

14、，同时不断地对它们进行移种传代，以积累自发突变，并最终获得优良菌株的过程发突变，并最终获得优良菌株的过程 二、诱变育种二、诱变育种 指用人工的方法处理均匀而分散的微生物细胞群，促指用人工的方法处理均匀而分散的微生物细胞群，促使它们发生突变，再从中筛选出符合要求的突变菌株，使它们发生突变，再从中筛选出符合要求的突变菌株，供生产和科学实验用供生产和科学实验用 （一）诱发突变原因（一）诱发突变原因诱变剂诱变剂 1.物理因素的诱变物理因素的诱变 （1）紫外线）紫外线 （2）x射线和射线和r射线射线（3）热和激光等）热和激光等 2.化学因素的诱变化学因素的诱变 （1）碱基结构类似物）碱基结构类似物 5-

15、溴尿嘧啶（溴尿嘧啶（5-BU）、）、5-氨基尿嘧啶（氨基尿嘧啶（5-AU）、）、8-氮鸟嘌呤氮鸟嘌呤（8-NG）、）、2-氨基嘌呤（氨基嘌呤（2-AP）和）和6-氯嘌呤（氯嘌呤（6-CP） （2）与核酸上碱基起化学反应的诱变剂）与核酸上碱基起化学反应的诱变剂 结果使结果使A H（次黄嘌呤）（次黄嘌呤） G X（黄嘌呤）（黄嘌呤） C U（尿嘧啶）（尿嘧啶）（3）移码突变）移码突变 （二）诱变育种（二）诱变育种诱变育种的基本过程如图：诱变育种的基本过程如图： 1.诱变育种的基本过程诱变育种的基本过程操作方法操作方法2.产量突变株的筛选产量突变株的筛选3.抗药性突变株的筛选抗药性突变株的筛选抗药性

16、基因：选择性遗传标记、重要的生产菌种。抗药性基因：选择性遗传标记、重要的生产菌种。筛选方法：筛选方法：（ a）梯度平板法）梯度平板法：梯度平板法定向筛选抗异烟肼的吡多醇高产酵母菌突变株梯度平板法定向筛选抗异烟肼的吡多醇高产酵母菌突变株（b）影印平板培养法）影印平板培养法4.营养缺陷型突变株的筛选营养缺陷型突变株的筛选（1）营养缺陷型）营养缺陷型（2）与筛选营养缺陷型突变株有关的三类培养基）与筛选营养缺陷型突变株有关的三类培养基 基本培养基基本培养基MM-： 完全培养基完全培养基CM+： 补充培养基补充培养基SMA/B：（3）与营养缺陷型突变有关的三类遗传型个体）与营养缺陷型突变有关的三类遗传型

17、个体 （4）营养缺陷型的筛选方法）营养缺陷型的筛选方法夹层培养法及其结果夹层培养法及其结果影印接种法及其结果影印接种法及其结果知识节点五 菌种保藏技术一、菌种衰退和菌种的复壮一、菌种衰退和菌种的复壮1 1、什么是菌种的衰退？、什么是菌种的衰退？2 2、菌种衰退有怎样的表现？、菌种衰退有怎样的表现？3 3、菌种退化的原因是什么？、菌种退化的原因是什么？4 4、如何防止菌种衰退？、如何防止菌种衰退？5 5、如何复壮菌种？、如何复壮菌种？二、菌种保藏二、菌种保藏1 1、菌种保藏的目的是什么？、菌种保藏的目的是什么？2 2、菌种保藏的原理是什么？、菌种保藏的原理是什么？3 3、常用的菌种保藏方法有哪些

18、？各如何操作？、常用的菌种保藏方法有哪些？各如何操作？一、菌种衰退和菌种的复壮一、菌种衰退和菌种的复壮1 1、菌种衰退：指生产菌株性状的劣化或遗传标记丢、菌种衰退：指生产菌株性状的劣化或遗传标记丢失的现象。失的现象。纯菌种纯菌种自发突变自发突变突变个体突变个体传代增殖传代增殖原始个体原始个体不纯菌种不纯菌种衰退菌种衰退菌种2 2、菌种衰退表现、菌种衰退表现 菌落和细胞形态改变菌落和细胞形态改变 生长速度缓慢，产孢子越来越少生长速度缓慢，产孢子越来越少 代谢产物生产能力下降，即出现负突变代谢产物生产能力下降，即出现负突变 致病菌对宿主侵染能力下降致病菌对宿主侵染能力下降 对外界不良条件的抵抗能力

19、下降等对外界不良条件的抵抗能力下降等3 3、菌种衰退的原因、菌种衰退的原因基因变异基因变异主要原因主要原因菌种衰退的基本原因是有关基因发生负突变，菌种衰退的基本原因是有关基因发生负突变， 连续传代连续传代加速衰退加速衰退 不适宜的培养和保藏条件不适宜的培养和保藏条件加速衰退加速衰退4 4、菌种衰退的防止、菌种衰退的防止 控制传代次数控制传代次数 创造良好的培养条件创造良好的培养条件 利用不易衰退的细胞移种传代利用不易衰退的细胞移种传代 采用有效的菌种保藏方法采用有效的菌种保藏方法 讲究菌种选育技术讲究菌种选育技术 定期进行分离纯化定期进行分离纯化5 5、菌种的复壮、菌种的复壮狭义的复壮狭义的复

20、壮消极的措施消极的措施 是指在菌种已经发生衰退的情况下，通过纯种分离和典是指在菌种已经发生衰退的情况下，通过纯种分离和典型性状、生产性能等指标测定，从中筛选出少数尚未退化的型性状、生产性能等指标测定，从中筛选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的相应措施。个体，以达到恢复原菌株固有性状的相应措施。广义的复壮广义的复壮积极的措施积极的措施 是指在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常是指在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性状测定工作，以期从中选择有意识地采取纯种分离和生产性状测定工作，以期从中选择到自发的正突变个体。到自发的正突变个体。菌种复壮的

21、主要方法菌种复壮的主要方法纯种分离法：纯种分离法：分离仍保持原有典型性状的单细胞分离仍保持原有典型性状的单细胞淘汰法：淘汰法：处理（如药物、低温、高温等）衰退菌种，淘汰已处理（如药物、低温、高温等）衰退菌种，淘汰已衰退个体衰退个体遗传育种法：遗传育种法：退化的菌种重新进行遗传育种退化的菌种重新进行遗传育种宿主体内复壮法：宿主体内复壮法：对于寄生性微生物的衰退菌株，可通过接对于寄生性微生物的衰退菌株，可通过接种到相应宿主体内来提高菌株的毒性种到相应宿主体内来提高菌株的毒性 二、菌种保藏二、菌种保藏菌种保藏是一种保持微生物菌株的生活力和原有性状的方法。菌种保藏是一种保持微生物菌株的生活力和原有性状

22、的方法。1 1、菌种保藏的目的、菌种保藏的目的菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原有性状和活力的菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原有性状和活力的稳定，确保菌种不死亡、不被污染、不变异稳定，确保菌种不死亡、不被污染、不变异变异不可避免变异不可避免, ,但可减缓变异速度。但可减缓变异速度。 2 2、菌种保藏的原理、菌种保藏的原理人为地创造环境条件（如：干燥、低温和缺氧），使微生人为地创造环境条件（如：干燥、低温和缺氧），使微生物长期处于休眠状态物长期处于休眠状态挑选典型菌种的优良纯种进行保藏，最好保藏它们的休眠挑选典型菌种的优良纯种进行保藏，最好保藏它们的休眠体，如分生孢子、芽孢等体，如分生

23、孢子、芽孢等3、常用的菌种保藏方法、常用的菌种保藏方法菌种保藏技术菌种保藏技术（1 1）斜面低温保藏法）斜面低温保藏法（2）蒸馏水保藏法）蒸馏水保藏法（3 3）真空冷冻干燥保藏法）真空冷冻干燥保藏法/ /冷冻干燥保藏法冷冻干燥保藏法（4）液氮冷冻保藏法）液氮冷冻保藏法（1 1）斜面低温保藏法常用保藏法）斜面低温保藏法常用保藏法 菌种在适宜的斜面上菌种在适宜的斜面上 44冰箱中冰箱中 生长完全生长完全 保藏保藏 每隔一定时间（保藏期每隔一定时间（保藏期 1-61-6个月）后个月）后 新的斜面上新的斜面上 4 4 生长生长 保藏保藏此法广泛适用于此法广泛适用于各大类微生物各大类微生物菌种的菌种的短

24、期保藏短期保藏此法的主要保藏措施是低温。原理是低温抑制生长。此法的主要保藏措施是低温。原理是低温抑制生长。优点是简便易行，容易推广，存活率高；优点是简便易行，容易推广，存活率高；缺点是保藏期短，传代次数多，菌种较容易发生变异和缺点是保藏期短，传代次数多，菌种较容易发生变异和被污染。被污染。螺旋口试管替代传统的棉塞、减少培养基碳水化合物的螺旋口试管替代传统的棉塞、减少培养基碳水化合物的含量含量 （2）蒸馏水保藏法：）蒸馏水保藏法：菌种制备菌种制备 蒸馏水灭菌蒸馏水灭菌 接入菌种接入菌种 不要沾湿棉塞不要沾湿棉塞 塞紧塞紧 室温保藏室温保藏螺旋口试管或加橡皮塞试管螺旋口试管或加橡皮塞试管 10 或

25、或18可保藏可保藏1年左右年左右适用于丝状真菌、酵母型真菌及细菌中的肠道菌科。适用于丝状真菌、酵母型真菌及细菌中的肠道菌科。思考：思考：原理、优缺点、改进原理、优缺点、改进其原理是对菌丝体造成营养饥饿，从而抑制菌丝的其原理是对菌丝体造成营养饥饿，从而抑制菌丝的生长。生长。简便，使用方便，取后剩余可继续保藏简便，使用方便，取后剩余可继续保藏也可用不含养分的溶液如也可用不含养分的溶液如0.25M磷酸缓冲液磷酸缓冲液（Ph6.5）或生理盐水）或生理盐水（3 3）真空冷冻干燥保藏法）真空冷冻干燥保藏法/ /冷冻干燥保藏法，简称冻冷冻干燥保藏法，简称冻干法：干法：一般菌种可保存一般菌种可保存5 5年年-

26、15-15年。年。除不宜于丝状真菌的菌丝体外，对病毒、细菌、放除不宜于丝状真菌的菌丝体外，对病毒、细菌、放线菌、酵母及丝状真菌孢子等各类微生物都适用，线菌、酵母及丝状真菌孢子等各类微生物都适用，不宜用冻干法保存的微生物不到不宜用冻干法保存的微生物不到2%2%（霉菌、蕈菌、（霉菌、蕈菌、藻类）。藻类）。安瓿管安瓿管 菌种菌种菌种要纯菌种要纯 配制保护剂配制保护剂如脱脂牛奶、海如脱脂牛奶、海 藻糖、血清白蛋白、糊精藻糖、血清白蛋白、糊精 酸洗、水洗酸洗、水洗 培养培养生长良好生长良好 分装分装 烘干烘干 制备菌悬液制备菌悬液浓度应高浓度应高 灭菌灭菌 灭菌灭菌 分装安瓿管分装安瓿管 预冻预冻低温冰

27、箱低温冰箱20-60m或冷冻剂或冷冻剂5-10m至至-30 真空干燥真空干燥在在30m内达到内达到93.3Pa（0.7mmHg） 装在歧管上抽真空装在歧管上抽真空慢干至慢干至26.7Pa0.2mmHg 火焰上熔封安瓿管口火焰上熔封安瓿管口 检测真空检测真空 保藏保藏冰箱或室温暗处冰箱或室温暗处冷冻干燥保藏管冷冻干燥保藏管 一种简易冷冻干燥装置一种简易冷冻干燥装置思考：思考：原理、优缺点原理、优缺点是兼具低温、干燥、除氧三方面菌种保藏的方法是兼具低温、干燥、除氧三方面菌种保藏的方法冷冻干燥保存的菌种存活时间长、变异率低、效冷冻干燥保存的菌种存活时间长、变异率低、效果好，便于大量保藏，还具有体积小

28、、不易污染、果好，便于大量保藏，还具有体积小、不易污染、便于运输等优点便于运输等优点缺点是设备和操作都比较复杂缺点是设备和操作都比较复杂。（4）液氮冷冻保藏法：）液氮冷冻保藏法：原则是原则是“慢冻快融慢冻快融”许多细菌可保藏许多细菌可保藏15年以上。年以上。此法除适宜于一般微生物的保藏外，一些用冷冻干燥法此法除适宜于一般微生物的保藏外，一些用冷冻干燥法都难以保存的微生物如支原体、衣原体、氢细菌、难以都难以保存的微生物如支原体、衣原体、氢细菌、难以形成孢子的霉菌、噬菌体及动物细胞都适用形成孢子的霉菌、噬菌体及动物细胞都适用准备安瓿管准备安瓿管 加保护剂与灭菌加保护剂与灭菌能耐受温度突然变化能耐受

29、温度突然变化 霉菌菌丝体：霉菌菌丝体：安瓿管内预先加入保护剂安瓿管内预先加入保护剂 接菌种入安瓿管接菌种入安瓿管细菌细菌10的甘油蒸馏水菌悬液的甘油蒸馏水菌悬液 霉菌菌丝体用灭菌打孔器切取菌落圆块霉菌菌丝体用灭菌打孔器切取菌落圆块 用火焰熔封，浸入水中检查用火焰熔封，浸入水中检查 冻结冻结以每分钟下降以每分钟下降1的慢速冻结至的慢速冻结至-30 保藏保藏立即放入液氮冷冻保藏器内（气相为立即放入液氮冷冻保藏器内（气相为 -150，液态氮内为，液态氮内为-196）恢复培养：恢复培养：需用时，将安瓿管取出，立即放入需用时，将安瓿管取出，立即放入3840的水的水浴中震荡，浴中震荡，1分钟内全部融化分钟

30、内全部融化。再打开安瓿管，将内容物移入适宜。再打开安瓿管，将内容物移入适宜的培养基上培养的培养基上培养防爆炸、防冻伤，防爆炸、防冻伤，要戴皮手套操作。要戴皮手套操作。低于低于-130微生物代谢停止，处于休眠状态微生物代谢停止，处于休眠状态优点：保藏期长、变异率低、效果好、方法简单、保优点：保藏期长、变异率低、效果好、方法简单、保藏的对象也最为广泛藏的对象也最为广泛 缺点：需要特殊设备、缺点：需要特殊设备、 液氮消耗较多费用较高液氮消耗较多费用较高4 4、菌种保藏机构、菌种保藏机构美国美国标准菌种收藏所标准菌种收藏所ATCCATCC采用冷冻干燥保藏法和采用冷冻干燥保藏法和液氮保藏法来保藏所有菌种。液氮保藏法来保藏所有菌种。中国微生物菌种保藏委员会中国微生物菌种保藏委员会CCCCMCCCCM采用斜面低温采用斜面低温保藏法、冷冻干燥保藏法和液氮保藏法进行菌种保藏法、冷冻干燥保藏法和液氮保藏法进行菌种保藏。保藏。ATCCATCC采用的两种保藏方法的优点示意图采用的两种保藏方法的优点示意图至少在至少在20年内，年内，获得该菌种的用户，获得该菌种的用户，至多只是原种的第二代至多只是原种的第二代