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1、实验五实验五质粒质粒DNA的提取鉴定的提取鉴定n掌掌握握碱碱变变性性法法从从大大肠肠杆杆菌菌中中提提取取质质粒粒DNA原原理理和方法。和方法。n掌握琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒掌握琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒DNA的技术。的技术。一、实验目的一、实验目的 质粒粒plasmid是一种独立的是一种独立的稳定的定的遗传因子，存因子，存在于在于细菌等菌等细胞中。它胞中。它们为双双链、闭环的的DNA分子，大小分子，大小从从1kb到到200kb不等，具有自主复制和不等，具有自主复制和转录才干，能在子代才干，能在子代细胞中胞中坚持恒定的拷持恒定的拷贝数并表达所携数并表达所携带的的DNA基因信息，基因信息，但其复制和但其
2、复制和转录要利用宿主要利用宿主细胞胞编码的一些的一些酶和蛋白和蛋白质，而宿主在没有而宿主在没有质粒粒时是可以正常生是可以正常生长的。因此，的。因此，质粒是一粒是一种寄生性的自主复制子。种寄生性的自主复制子。 细菌菌质粒是基因工程中常用的基因粒是基因工程中常用的基因载体，也是分子生物体，也是分子生物学中研学中研讨基因构造、功能及其复制、表达的好基因构造、功能及其复制、表达的好资料。料。二、实验原理二、实验原理l碱碱变性抽提法法是常用的方法之一性抽提法法是常用的方法之一.l此此法法基基于于染染色色体体DNA与与质粒粒DNA的的变性性与与复复性性差差别而而到到达分达分别的目的。的目的。l在在pH高高
3、达达12.6的的条条件件下下，染染色色体体DNA的的氢键断断裂裂、双双螺螺旋旋解解开开而而变性性；质粒粒DNA的的大大部部分分氢键也也断断裂裂，但但超超螺螺旋旋共共价价闭合合环状状构构造造的的两两条条互互补链未未完完全全分分别，当当用用pH4.8的的Kac高高盐缓冲冲液液调理理pH至至中中性性时，变性性的的质粒粒DNA又又恢恢复复到到原原来来的的构构型型，以以可可溶溶性性形形状状存存在在于于液液相相中中，而而染染色色体体DNA不不能能复复性性，构构成成缠绕的的网网状状构构造造，与与不不稳定定的的大大分分子子RNA、蛋白、蛋白质等一同沉淀出来。等一同沉淀出来。二、实验原理二、实验原理抽提中各种要
4、素的影响，抽提中各种要素的影响，质粒粒DNA能能够以三种方式存在：以三种方式存在：1. 共价共价闭环DNAcovalently closed circular DNA，cccDNA，常以超螺旋方式存在；，常以超螺旋方式存在；2. 开开环DNAopen circular DNA，ocDNA，此种，此种质 粒粒DNA的两条的两条链中有一条中有一条链发生一生一处或多或多处断裂，构断裂，构成缺刻，可以自在旋成缺刻，可以自在旋转从而消除了从而消除了张力，构成松弛的力，构成松弛的环状分子；状分子；3. 线状状DNAlinear DNA，lDNA，质粒粒DNA的两条的两条 链在同一在同一处断裂所构成。在断裂
5、所构成。在电泳泳时，同一，同一质粒粒DNA 的泳的泳动速度根据迁移率从小到达分速度根据迁移率从小到达分别为开开环，线形形 和超螺旋和超螺旋DNA。 cccDNA含量越高，含量越高，阐明制明制备的的质粒粒DNA质量越好。量越好。 三、操作步三、操作步骤 1.取取2ml细菌培育液于菌培育液于2ml Eppendorf离心管中，离心管中，4，5000rpm，离心，离心5min， 弃上清将管倒置于弃上清将管倒置于卫生生纸上数分上数分钟，使液体尽能，使液体尽能够流尽，保流尽，保管菌体沉淀。管菌体沉淀。 2.沉淀沉淀悬浮于浮于100ul预冷的冷的试剂TEG缓冲液中，混匀冲液中，混匀置混合器振置混合器振 荡
6、，冰上置，冰上置10min。 3.参与新配制的参与新配制的试剂碱裂解液碱裂解液200ul，加盖，悄然，加盖，悄然颠倒倒34次，冰上置次，冰上置 10 min。 4.参与参与预冷的冷的试剂乙酸乙酸钾溶液溶液150ul，盖，盖紧管盖，管盖，颠倒倒数次，冰上置数次，冰上置10 min 。12000rpm，4，离心，离心10min，以除去，以除去细胞碎片及大部胞碎片及大部分分细菌染色体菌染色体DNA。 5.上清液移入另一干上清液移入另一干净离心管中，参与等体离心管中，参与等体积的平衡酚的平衡酚轻摇，12000rpm， 4，离心，离心10min。 6.取上取上层水相置于另一离心管中，参与等体水相置于另一
7、离心管中，参与等体积的的氯仿仿氯仿：仿：异戊醇异戊醇=24：1 抽提，抽提，12000rpm，4，离心，离心10min。 7.取上取上层水相置于另一离心管中，参与水相置于另一离心管中，参与2倍体倍体积的的预冷的无水冷的无水乙醇，混匀后乙醇，混匀后 置置20过夜至少要放置夜至少要放置2h以上。以上。 8.12000rpm，4，离心，离心10min，弃上清，将管口倒置于，弃上清，将管口倒置于纸巾巾上使一切液体尽上使一切液体尽 能能够流出。流出。 9.参与参与1ml70%乙醇洗沉淀一次。乙醇洗沉淀一次。12000rpm，4，离心，离心10min。 10.弃上清，将管口倒置于弃上清，将管口倒置于纸巾上
8、使液体流尽，放置枯燥或真巾上使液体流尽，放置枯燥或真空枯燥，即得空枯燥，即得质粒粒 DNA制品。制品。 11.将沉淀溶于将沉淀溶于20ulTE缓冲液，冲液，临用前参与用前参与1u 或或20ug/ml RNaseA待用。待用。50 mM 葡萄糖葡萄糖25 mM Tris-HCl10 mM EDTA-Na2200 mM NaOH 1% W/V SDS3 M NaAC省去省去25 min30 min 以上以上实实验验步步骤骤l 不同的不同的DNA片段由于其片段由于其电荷、分子量大小及构型的不同，在荷、分子量大小及构型的不同，在电泳泳时的泳的泳动速率就不同，从而可以区分出不同的区速率就不同，从而可以区
9、分出不同的区带。l 核酸构型不同，在凝胶中的核酸构型不同，在凝胶中的电泳速度差泳速度差别较大。同一大。同一质粒粒DNA的泳的泳动速度次序速度次序为：l 共价共价闭环DNA开开环DNA线状状DNA。l溴化乙溴化乙锭可插入到可插入到DNA分子的双分子的双链中。在波中。在波长254nm紫外光照紫外光照射下插入溴化乙射下插入溴化乙锭的的DNA显橙橙红色色荧光，所以溴化乙光，所以溴化乙锭可以作可以作荧光指示光指示剂指示指示DNA含量和位置。含量和位置。四、四、DNA的琼脂糖凝胶电泳原理的琼脂糖凝胶电泳原理 1.琼脂脂糖糖凝凝胶胶的的制制备：本本实验采采用用1.0%的的琼脂脂糖糖凝凝胶胶。称称取取0.3g
10、琼脂脂糖糖放放入入锥形形瓶瓶，参参与与30ml电泳泳缓冲冲液液，置置于于微微波波炉炉使使其其充充分分融融化化。室室温温放放置置至至60左左右右，参参与与EB使使其其终浓度度为0.5ug/ml，混匀，倒胶板，混匀，倒胶板30ml/板。板。 2.凝凝胶胶板板的的制制造造： 用用1cm宽的的胶胶带纸沿沿平平板板电泳泳槽槽模模板板两两端端边缘围成成高高4mm的的墙，在在其其一一端端放放置置样品品梳梳。将将预备好好的的模模板置于程度台上，迅速将上面板置于程度台上，迅速将上面胶液倒在模板的中央，胶液倒在模板的中央，让胶液自胶液自由流向周由流向周围。待胶液充分冷却凝。待胶液充分冷却凝固，将胶固，将胶纸围墙渐
11、渐取下，制取下，制备好的凝胶板放入好的凝胶板放入电泳槽中，加泳槽中，加电泳泳缓冲液直至没冲液直至没过胶面胶面约1mm深，深，取出取出样品梳。品梳。五、琼脂糖凝胶电泳操作步骤五、琼脂糖凝胶电泳操作步骤3. 加加样：10 ul TE 溶解溶解+ 4 ul 上上样缓冲液，取冲液，取10 ul点点样4. 电泳：泳：电压：120V电泳泳时间：45 min电泳泳终止：指示止：指示剂间隔凝胶前沿隔凝胶前沿约1cm处5.检测：取出胶板，用紫外：取出胶板，用紫外检测仪察看察看结果。果。纯的的质粒粒DNA只需超螺旋只需超螺旋DNA一条一条带。6.凝胶凝胶处置：置：鉴定后的凝胶定后的凝胶应放放在指定的地方，待枯燥后在指定的地方，待枯燥后烧毁，不能倒在渣滓中，以防不能倒在渣滓中，以防EB污染。染。五、琼脂糖凝胶电泳操作步骤五、琼脂糖凝胶电泳操作步骤六、实验报告要求六、实验报告要求一、一、 原理原理二、二、 操作操作三、三、 结果铅笔绘图：正负极，条带数目、称结果铅笔绘图：正负极，条带数目、称号、强弱、间隔号、强弱、间隔四、四、 结果阐明结果阐明五、五、 思索题思索题1、分别提取、分别提取DNA的过程中哪些要素会引起链的过程中哪些要素会引起链的断裂的断裂?2、本实验为了质粒、本实验为了质粒DNA纯度和分子的完好性，纯度和分子的完好性，采用了哪些措施？采用了哪些措施？
