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1、食品中蛋白质食品中蛋白质 含量测定含量测定 食品中蛋白质的含量分布是不平衡的。一般植物食品中蛋白质的含量分布是不平衡的。一般植物组织的含量低于动物组织。植物中蛋白质含量很少，组织的含量低于动物组织。植物中蛋白质含量很少，一般为一般为0.53%（鲜重），在果实中一般为（鲜重），在果实中一般为 0.41.5%（鲜重），（鲜重），黄豆黄豆中蛋白质可达中蛋白质可达40%。由动物中肌。由动物中肌肉及内脏中蛋白质含量校多，肉及内脏中蛋白质含量校多，牛肉牛肉20.1%，乳粉乳粉26.2%。 蛋白质的定量是基于测定蛋白质的定量是基于测定总有机氮总有机氮。但某些物质。但某些物质又含有大量的非蛋白氮化合物，必须把
2、蛋白质提出来，又含有大量的非蛋白氮化合物，必须把蛋白质提出来，分别测总氮及非蛋白氮就得到纯蛋白氮。分别测总氮及非蛋白氮就得到纯蛋白氮。 蛋白质的含量一般是按照蛋白质的含量一般是按照总氮量乘上一个合适的总氮量乘上一个合适的蛋白质换算系数蛋白质换算系数来求得的。这个系数决定于物质中蛋来求得的。这个系数决定于物质中蛋白质的含氮量。蛋白质的含氮量一般为白质的含氮量。蛋白质的含氮量一般为1517%，平，平均值为均值为16%左右。所以只要测出样品（鸡蛋、青豆、左右。所以只要测出样品（鸡蛋、青豆、肉、玉米等）中的含氮量，再乘以肉、玉米等）中的含氮量，再乘以换算系数换算系数，就可计，就可计算出样品中的蛋白质含
3、量。算出样品中的蛋白质含量。 蛋白质含量测定方法：蛋白质含量测定方法：n物理方法：物理方法：1 折射率法折射率法2 比重法比重法3 紫外吸收法紫外吸收法 蛋白质含量测定方法：蛋白质含量测定方法：n化学方法：化学方法：1 凯氏定氮法：凯氏定氮法：最准确和操作最简单的方法之一，同时测定最准确和操作最简单的方法之一，同时测定多个样品，是法定的标准检方法。多个样品，是法定的标准检方法。2 杜马法杜马法：多半用于：多半用于有机分析有机分析，很少用于食品分析。，很少用于食品分析。3 双缩脲反应法双缩脲反应法：在碱性环境中，：在碱性环境中，双缩脲双缩脲与与CuSO4结合生结合生成成红紫色红紫色的络合物，此法
4、称为双缩脲反应法。的络合物，此法称为双缩脲反应法。4 酚试剂法酚试剂法：和双缩脲法是：和双缩脲法是生物领域生物领域进行科学研究经常使用进行科学研究经常使用的方法。的方法。5 染料结合法：染料结合法：正在急速发展的新方法。正在急速发展的新方法。第一法（凯氏定氮法）第一法（凯氏定氮法）1 范围范围 本标准适用于食品中蛋白质的测定。本标准适用于食品中蛋白质的测定。 本标准不适用于添加无机含氮物质、有机非蛋白本标准不适用于添加无机含氮物质、有机非蛋白质含氮物质的食品测定。质含氮物质的食品测定。2 原理原理蛋白质与蛋白质与硫酸硫酸和和催化剂催化剂（硫酸铜、硫酸钾）一（硫酸铜、硫酸钾）一同加热同加热消化消
5、化使蛋白质分解。分解的使蛋白质分解。分解的氨氨与与硫酸硫酸生生成成硫酸铵硫酸铵，然后，然后碱化蒸馏碱化蒸馏使使氨氨分离。用分离。用硼酸硼酸吸吸收后，再用标准收后，再用标准硫酸或盐酸硫酸或盐酸滴定，根据酸的滴定，根据酸的消消耗量耗量乘以乘以换算系数换算系数，即为蛋白质含量。，即为蛋白质含量。3 试剂试剂硫酸铜、硫酸钾、硫酸硫酸铜、硫酸钾、硫酸硼酸溶液（硼酸溶液（20g/L） 氢氧化钠溶液（氢氧化钠溶液（400g/L）硫酸标准滴定溶液或盐酸标准滴定溶液：需标定硫酸标准滴定溶液或盐酸标准滴定溶液：需标定甲基红指示液甲基红指示液混合指示液：混合指示液：1份甲基红乙醇溶液（份甲基红乙醇溶液（1g/L）与
6、）与5份溴甲酚份溴甲酚绿乙醇溶液（绿乙醇溶液（1g/L）临用时临用时混合，也可用混合，也可用2份甲基红乙醇份甲基红乙醇溶液（溶液（1g/L）与）与1份亚甲基蓝乙醇溶液（份亚甲基蓝乙醇溶液（1g/L）临用时临用时混混合。合。4 仪器仪器凯氏烧瓶、定氮蒸馏装置、量筒、玻璃珠、酸式凯氏烧瓶、定氮蒸馏装置、量筒、玻璃珠、酸式滴定管、电炉（石棉网）、容量瓶（滴定管、电炉（石棉网）、容量瓶（100ml）、）、分析天平、托盘天平、三角瓶（分析天平、托盘天平、三角瓶（100ml）、小漏）、小漏斗、铁丝筐斗、铁丝筐5 分析步骤分析步骤5.1 消化：消化：精密称取固体样品（加样时应直接送入管底，避免粘精密称取固体
7、样品（加样时应直接送入管底，避免粘到管口和管颈上）于干燥的到管口和管颈上）于干燥的凯氏烧瓶凯氏烧瓶，加入，加入6g硫酸钾硫酸钾、硫酸铜、硫酸铜、20ml硫酸硫酸及及2粒玻璃珠粒玻璃珠，稍摇匀后于瓶口放入一，稍摇匀后于瓶口放入一小漏斗小漏斗，凯氏烧，凯氏烧瓶成瓶成45度倾斜度倾斜先小火加热，不久看到消化管内物质炭化变黑，并先小火加热，不久看到消化管内物质炭化变黑，并产生大量泡沫，此时注意不要让黑色物质上升到消化管的颈部，产生大量泡沫，此时注意不要让黑色物质上升到消化管的颈部，否则将严重影响测定结果。待泡沫停止后加大火，并保持瓶内液否则将严重影响测定结果。待泡沫停止后加大火，并保持瓶内液体微沸。在
8、消化时，应使全部样品都浸泡在消化液中，如在瓶颈体微沸。在消化时，应使全部样品都浸泡在消化液中，如在瓶颈上发现有黑色颗粒，应小心将消化管倾斜振摇，用消化液将它冲上发现有黑色颗粒，应小心将消化管倾斜振摇，用消化液将它冲洗下来。洗下来。 至液体呈至液体呈蓝绿色蓝绿色澄清透明后，再继续加热，取下放冷，小心澄清透明后，再继续加热，取下放冷，小心加加20ml水水，移入，移入100ml容量瓶容量瓶中，并用少量水洗涤烧瓶，洗液并中，并用少量水洗涤烧瓶，洗液并入容量瓶，再加水至刻度，混匀备用。同时做试剂空白试验。入容量瓶，再加水至刻度，混匀备用。同时做试剂空白试验。消化装置消化装置加入试剂的作用：加入试剂的作用
9、：K2SO4的作用：的作用：作为作为增温剂增温剂，提高溶液沸点；加速，提高溶液沸点；加速对有机物的分解作用。对有机物的分解作用。CuSO4的作用的作用：作为：作为催化剂催化剂。还可以作。还可以作消化终点指消化终点指示剂示剂：当完全消化后，反应停止，变为兰色。浓硫：当完全消化后，反应停止，变为兰色。浓硫硫酸的作用：硫酸的作用：硫酸使有机物脱水，并破坏有机物，硫酸使有机物脱水，并破坏有机物，使有机物中的使有机物中的C、H氧化为氧化为CO2和和H2O蒸汽逸出，而蒸汽逸出，而蛋白质则分解蛋白质则分解氮氮，与硫酸结合成，与硫酸结合成硫酸铵硫酸铵，留在酸性，留在酸性溶液中。溶液中。n（1）仪器的洗涤：）仪
10、器的洗涤：仪器应先经一般洗涤，再经水蒸汽洗涤。仪器应先经一般洗涤，再经水蒸汽洗涤。 洗涤方法：洗涤方法：先煮沸蒸汽发生器，器中盛有先煮沸蒸汽发生器，器中盛有2/3体积的用几滴体积的用几滴硫酸硫酸酸化酸化过的水，样品杯中也加入过的水，样品杯中也加入2/3体积蒸馏水进行体积蒸馏水进行水封水封。关闭反关闭反应管下的管夹应管下的管夹使蒸汽通过反应室的插管进入反应室，再由冷凝使蒸汽通过反应室的插管进入反应室，再由冷凝管下端逸出（可在冷凝管下口放一个准备好的盛有硼酸管下端逸出（可在冷凝管下口放一个准备好的盛有硼酸-指示剂指示剂的锥形瓶，观察锥形瓶中的溶液是否基本上不变色，可证明蒸的锥形瓶，观察锥形瓶中的溶
11、液是否基本上不变色，可证明蒸馏器内部已馏器内部已洗涤干净洗涤干净） 。 排废：排废：用右手用右手轻提轻提样品杯中棒状玻塞，使水流入反应室的同时，样品杯中棒状玻塞，使水流入反应室的同时，立即用左手立即用左手捏紧橡皮管捏紧橡皮管，以断气源，以断气源，盖好玻塞盖好玻塞。由于反应室外。由于反应室外层中蒸汽冷缩、压力降低，反应室内废液通过反应室中层中蒸汽冷缩、压力降低，反应室内废液通过反应室中插管插管自自动抽到反应室外壳中。再在样品杯中加入动抽到反应室外壳中。再在样品杯中加入2/3体积蒸馏水，反复体积蒸馏水，反复三次三次。关闭夹子再使蒸汽通过全套蒸馏仪。关闭夹子再使蒸汽通过全套蒸馏仪13min，可进行蒸
12、，可进行蒸馏。馏。5.2 蒸馏蒸馏： 蒸馏装置蒸馏装置n（2）加样：）加样：务必务必打开管夹打开管夹，准确移取，准确移取试样试样10mL，打开样品杯，打开样品杯的棒状玻塞，将样品放入反应室，用少量蒸馏水冲洗样品杯，的棒状玻塞，将样品放入反应室，用少量蒸馏水冲洗样品杯，将将管夹夹紧管夹夹紧。盖上玻塞，并在样品杯中加入蒸馏水进行。盖上玻塞，并在样品杯中加入蒸馏水进行水封水封。将装有将装有硼酸硼酸-指示剂指示剂（2%硼酸溶液硼酸溶液10ml，混和指示剂，混和指示剂12滴）滴）的锥形瓶放在冷凝管口下方，打开存放碱液杯下端的夹子，加的锥形瓶放在冷凝管口下方，打开存放碱液杯下端的夹子，加10mL40%氢氧
13、化钠氢氧化钠溶液于反应室后，立即溶液于反应室后，立即上提上提锥形瓶，使冷凝锥形瓶，使冷凝管下口管下口浸没浸没在锥形瓶的液面下。在锥形瓶的液面下。n（3）蒸馏：）蒸馏：反应液沸腾后，锥形瓶中的硼酸反应液沸腾后，锥形瓶中的硼酸-指示剂混合液由指示剂混合液由紫红色紫红色变为变为绿色绿色，自变色时起计时，蒸馏，自变色时起计时，蒸馏4min。移动锥形瓶，。移动锥形瓶，使硼酸液面离开约使硼酸液面离开约1cm，并用少量蒸馏水，并用少量蒸馏水冲洗冲洗冷凝管下口外面，冷凝管下口外面，继续蒸馏继续蒸馏1min，将锥形瓶取出，用表面皿覆盖以待滴定。，将锥形瓶取出，用表面皿覆盖以待滴定。n（4）排废液及洗涤：）排废液
14、及洗涤：一次蒸馏结束后，要排出反应后的废液并一次蒸馏结束后，要排出反应后的废液并对蒸馏装置对蒸馏装置洗涤洗涤（操作同前）。排废洗涤后，可进行下一个样（操作同前）。排废洗涤后，可进行下一个样品的蒸馏。品的蒸馏。5.2 蒸馏蒸馏： 滴定：滴定：n（1）硫酸滴定液的标定：）硫酸滴定液的标定：称取称取无水无水Na2CO3约约，加水，加水50ml使溶解，加使溶解，加甲基红甲基红-溴甲酚绿溴甲酚绿混合指示液混合指示液10滴，用本滴，用本液滴定至溶液由绿色转变为液滴定至溶液由绿色转变为暗红色暗红色时，煮沸时，煮沸2min，冷却，冷却至室温，继续滴定至溶液再现至室温，继续滴定至溶液再现暗红色暗红色。同时做空白
15、试验。同时做空白试验。n（2）回滴：）回滴：馏出液用馏出液用硫酸标准溶液硫酸标准溶液滴定，直到蓝绿色变滴定，直到蓝绿色变为为紫红色紫红色即为滴定终点，记录所消耗滴定液溶液体积。并即为滴定终点，记录所消耗滴定液溶液体积。并将滴定结果用将滴定结果用空白试验空白试验校正。校正。6.结果计算结果计算 X = （V1 V2）c0.014 F 100/ (m10/100)式中：式中：X试样中蛋白质的含量（试样中蛋白质的含量（g/100g或或g/100mL）;V1-试样消耗硫酸标准滴定液的体积（试样消耗硫酸标准滴定液的体积（mL）;V2-试剂空白硫酸标准滴定液的体积（试剂空白硫酸标准滴定液的体积（mL）;c
16、- 硫酸标准滴定液的浓度（硫酸标准滴定液的浓度（mol/L）;硫酸（）标准滴定液相当的氮的质量（硫酸（）标准滴定液相当的氮的质量（g）;m-试样的质量或体积（试样的质量或体积（g或或mL）F-氮换算为蛋白质的系数。一般食物为；乳制品为；面粉为；氮换算为蛋白质的系数。一般食物为；乳制品为；面粉为；玉米、高梁为；花生为；米为；大豆及其制品为；肉与肉制品玉米、高梁为；花生为；米为；大豆及其制品为；肉与肉制品为；大麦、小米、燕麦、裸麦为；芝麻、向日葵为。为；大麦、小米、燕麦、裸麦为；芝麻、向日葵为。计算结果保留计算结果保留三位有效数字三位有效数字。7.精密度精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果在重复性条件下获得的两次独立测定结果的的绝对差值绝对差值不得超过算术平均值的不得超过算术平均值的10%。
