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1、CompanyLOGO蛋白样本制备与Western Blothttp:/主要内容主要内容蛋白样本制备的目的蛋白样本制备的目的蛋白样本制备的目的蛋白样本制备的目的1蛋白样本制备总体原则和策略蛋白样本制备总体原则和策略蛋白样本制备总体原则和策略蛋白样本制备总体原则和策略2案例分析案例分析案例分析案例分析细胞总蛋白的提细胞总蛋白的提细胞总蛋白的提细胞总蛋白的提取取取取3成功的成功的 Western Blot6蛋白提取产品选择指蛋白提取产品选择指蛋白提取产品选择指蛋白提取产品选择指南南南南4蛋白定量方法的选蛋白定量方法的选蛋白定量方法的选蛋白定量方法的选择择择择5Company Logo一一 蛋白样本
2、制备蛋白样本制备-成功蛋白分析的基础成功蛋白分析的基础蛋蛋白白样样本本activity assaysprotein microarraysSDS-PAGE /IEFimmunoblottingmass spectrometry2-DE2-DEEMSAELISA蛋白样本制备的目的蛋白样本制备的目的: 后续应用后续应用Company Logo二二 蛋白样本制备的原则蛋白样本制备的原则蛋白样本制备原则方法应具备标准化，具有重现性方法应具备标准化，具有重现性 、可靠性、简便性；、可靠性、简便性；尽量抽提完全；尽量抽提完全；应使所有蛋白全部处于溶解状态应使所有蛋白全部处于溶解状态防止发生蛋白的降解、聚集
3、、沉淀、变性防止发生蛋白的降解、聚集、沉淀、变性防止在抽提过程中发生化学修饰防止在抽提过程中发生化学修饰如做如做2D则需去除高丰度蛋白或无关蛋白则需去除高丰度蛋白或无关蛋白必要时去除样品中的核酸和某些干扰蛋白必要时去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。Company Logo二二 蛋白样本制备的策略蛋白样本制备的策略制备蛋白的目的制备蛋白的目的活性分析 免疫印迹杂交 免疫沉淀或共沉淀1D 2D EMSA CHIP等实验材料实验材料 细胞 组织 固定组织或石蜡包埋组织 微生物 酵母 植物 提取RNA后的剩余的蛋白样本等目的蛋白的结性质目的蛋白的结性质与分布与分布分布于胞桨/胞核/膜 可溶/不可溶 含量
4、多少 分子量大小 四级结构特征 磷酸化等修饰方法的选择方法的选择 1 自行配制抽提试剂,根据文献方法或经验提取 2 购买商品化试剂盒,按其说明书的方法提取Company Logo三三 案例分析案例分析- 细胞中总蛋白的制备细胞中总蛋白的制备高速离心收集高速离心收集高速离心收集高速离心收集上清即得全蛋上清即得全蛋上清即得全蛋上清即得全蛋白样本白样本白样本白样本细胞加入裂解细胞加入裂解液冰上放置液冰上放置10-1510-15分钟分钟蛋白定量和蛋白定量和蛋白定量和蛋白定量和SDS-PAGESDS-PAGE检测检测检测检测裂解样品离心收集定量检测Company Logo细胞裂解液-RIPA Buffe
5、r的配方分析及技术要点表面活性剂表面活性剂缓冲液缓冲液蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂磷酸酶抑制剂磷酸酶抑制剂其它：其它：H2O、NaCl、等、等还原剂还原剂RIPA BufferCompany Logo细胞裂解液-RIPA Buffer的配方分析及技术要点 缓冲液缓冲液Tris-HCl（pH7.5),提供提供pH环境，使蛋白保持稳定，环境，使蛋白保持稳定，增加溶解性增加溶解性。Company Logo细胞裂解液-RIPA Buffer的配方分析及技术要点表面活表面活表面活表面活性剂性剂性剂性剂溶解膜与脂膜，溶解与稳定蛋白质（特别是膜蛋白）溶解膜与脂膜，溶解与稳定蛋白质（特别是膜蛋白）分为离子型（如分
6、为离子型（如SDS、脱氧胆酸盐等）和非离子型、脱氧胆酸盐等）和非离子型（如（如NP-40、Triton-100、tween系列等）。系列等）。Company Logo各类表面活性剂特点各类表面活性剂特点 1 阴离子型阴离子型: SDS 脱氧胆酸盐 2 阳离子型阳离子型: CPB和CTAB 3 双性离子型双性离子型: CHAPS Zwittergent系列 4 非离子型非离子型: Brij系列 Triton-100 Nonidet P40 Tween 系列等Company Logo选用表面活性剂考虑的因素选用表面活性剂考虑的因素参考文献报告保持生物活性时使用的表面活性剂参考文献报告保持生物活性时
7、使用的表面活性剂选选选选用用用用表表表表面面面面活活活活性性性性剂剂剂剂考考考考虑虑虑虑的的的的因因因因素素素素工作条件下表面活性剂的溶解性工作条件下表面活性剂的溶解性使用分子生物学级的表面活性剂使用分子生物学级的表面活性剂,无核酸酶蛋白酶等无核酸酶蛋白酶等根据样本下游的应用来选择表面活性剂的种类根据样本下游的应用来选择表面活性剂的种类考虑表面活性剂的去除方法考虑表面活性剂的去除方法表面活性剂的纯度影响提取蛋白的质量表面活性剂的纯度影响提取蛋白的质量保护蛋白活性时保护蛋白活性时,不仅考虑表面活性剂的种类还有浓度不仅考虑表面活性剂的种类还有浓度尽量使用毒性较低的表面活性剂尽量使用毒性较低的表面活
8、性剂因不明原因某些蛋白适用专门的表面活性剂进行分离因不明原因某些蛋白适用专门的表面活性剂进行分离使用非表面活性剂使用非表面活性剂NDSB结合表面活性剂来增加膜蛋白溶解性结合表面活性剂来增加膜蛋白溶解性有时比较难仅一种表面活性剂既能溶解蛋白又适用于蛋白分析有时比较难仅一种表面活性剂既能溶解蛋白又适用于蛋白分析,常先用一种表面活性剂将蛋白溶解常先用一种表面活性剂将蛋白溶解,而另一种表面活性剂取代进而另一种表面活性剂取代进行蛋白的后续分析行蛋白的后续分析Company Logo去除未结合的表面活性剂1疏水吸附方法疏水吸附方法 Hydrophobic Adsorption 2透析法透析法 Dialys
9、is3凝胶层析法凝胶层析法 Gel Chromatography4离子交换层析离子交换层析Ion-exchange Chromatography 根椐表面活性剂的疏水性根椐表面活性剂的疏水性,CMC,凝聚数目凝聚数目,和电荷等性质来去除和电荷等性质来去除. Company Logo细胞裂解液-RIPA Buffer的配方分析及技术要点蛋白蛋白酶抑酶抑制剂制剂抑制蛋白酶的活性，防止蛋白被水解，使用前临抑制蛋白酶的活性，防止蛋白被水解，使用前临时加入时加入Company Logo蛋白酶抑制剂及其鸡尾酒蛋白酶抑制剂及其鸡尾酒Company Logo细胞裂解液-RIPA Buffer的配方分析及技术要
10、点磷酸磷酸酶抑酶抑制剂制剂抑制磷酸酶的活化，防止蛋白样本脱磷酸化，使抑制磷酸酶的活化，防止蛋白样本脱磷酸化，使用前临时加入。用前临时加入。Company Logo磷酸酶抑制剂选择磷酸酶抑制剂选择磷酸酶主要包括非特异性的磷酸酶（例如：碱性磷酸酶，磷酸酶主要包括非特异性的磷酸酶（例如：碱性磷酸酶，酸性磷酸酶），特异性的丝氨酸酸性磷酸酶），特异性的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶（例如：苏氨酸磷酸酶（例如：PP1, PP2A, PP2B） 、酪氨酸蛋白磷酸酶（例如：、酪氨酸蛋白磷酸酶（例如：PTP）。）。常规的抑制剂主要包括：常规的抑制剂主要包括： 试剂名称名称抑制作用抑制作用氟化氟化钠酸性磷酸酶，丝氨酸酸性磷
11、酸酶，丝氨酸/苏氨酸磷酸酶苏氨酸磷酸酶正正钒酸酸钠碱性磷酸酶，酪氨酸蛋白磷酸酶碱性磷酸酶，酪氨酸蛋白磷酸酶焦磷酸焦磷酸钠丝氨酸丝氨酸-苏氨酸磷酸苏氨酸磷酸 Company Logo细胞裂解液-RIPA Buffer的配方分析及技术要点还原剂还原剂防止蛋白质发生氧化，保护二硫键。防止蛋白质发生氧化，保护二硫键。DTT、 巯基乙醇等。巯基乙醇等。.Company Logo细胞裂解液-RIPA Buffer的配方分析及技术要点其它其它水；溶剂水；溶剂NaCl：Company Logo全蛋白抽提时注意事项全蛋白抽提时注意事项可以适量加入甘可以适量加入甘油油,稳定蛋白稳定蛋白注意事项注意事项可以适量加入
12、可以适量加入Benzonase /DNase I等核酸等核酸酶酶,去除去除DNA,充充分提取蛋白分提取蛋白,降降低提取的粘度低提取的粘度.抑制蛋白酶及磷抑制蛋白酶及磷酸酶酸酶使用的使用的Detergent的种的种类类 纯度纯度 浓度浓度 干干扰扰 去除等因素去除等因素Temperature 试剂和器皿冰上试剂和器皿冰上预冷预冷,低温低温4操操作作细胞或组织的样细胞或组织的样本量本量裂解液的用量裂解液的用量Company Logo细胞裂解液-RIPA Buffer的配方分析及技术要点Company Logo四四 蛋白样本制备产品选择指南蛋白样本制备产品选择指南Company Logo核蛋白样本制
13、备核蛋白样本制备抽提原理抽提原理低渗裂解细胞膜低渗裂解细胞膜, ,释放出胞浆蛋白释放出胞浆蛋白与胞核与胞核; ;离心分离出胞核离心分离出胞核; ;高渗破裂胞核高渗破裂胞核, ,释放出可溶性核蛋释放出可溶性核蛋白白; ;加核酸酶降解加核酸酶降解DNA,DNA,释放出释放出DNADNA结结合蛋白合蛋白( (组蛋白和转录因子组蛋白和转录因子) ) 实验注意事项实验注意事项试剂和器皿冰上预冷试剂和器皿冰上预冷裂解液的用量裂解液的用量细胞总量细胞总量抑制蛋白酶抑制蛋白酶蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂Company Logo膜蛋白样本制备膜蛋白样本制备Company Logo膜蛋白的抽提v方法及原理方法及原理方
14、法多 直接抽提法 分级抽提法 1:先机械法等非表面活性剂方法裂解细胞,再用表面活性剂抽提 2:按溶解性分级抽提 3:按亚细胞分级抽提 v产物产物细胞膜蛋白细胞器质膜蛋白v注意事项注意事项根椐膜蛋白种类和后续研究目的的不同,选择不同的产品或表面活性剂变性剂等.抑制蛋白酶.样本量Company Logo膜蛋白的直接提取膜蛋白的直接提取Company Logo蛋白的分级提取蛋白的分级提取 按蛋白溶解度不同按蛋白溶解度不同进行分行分级抽提抽提,降低降低样品的复品的复杂性并富集低丰度蛋白性并富集低丰度蛋白质第一步：用非表面活性剂溶液裂解细胞提取高溶解性蛋白；第一步：用非表面活性剂溶液裂解细胞提取高溶解性
15、蛋白；第二步：把未溶解的第二步：把未溶解的pellet用裂解液溶解用裂解液溶解,提取高疏水性蛋白提取高疏水性蛋白(膜蛋白膜蛋白)；第三步：用含复合表面活性剂的蛋白溶解液，最后抽提前两次抽提后不第三步：用含复合表面活性剂的蛋白溶解液，最后抽提前两次抽提后不能溶解的膜蛋白约占整个样品的能溶解的膜蛋白约占整个样品的11%（W/W）。）。Company Logo亚细胞分级抽提亚细胞分级抽提v用超离心技用超离心技术分离出分离出细胞器、胞器、质膜和膜和细胞核等成分，再用适胞核等成分，再用适当的蛋白当的蛋白质溶解液溶解液进行溶解。行溶解。其其优点是不点是不仅大大减少大大减少样品的品的复复杂性，而且可性，而且
16、可对分离的蛋白分离的蛋白质进行行亚细胞定位。但胞定位。但该法需法需要要专业仪器，有器，有时会出会出现假阳假阳性。性。v根椐胞根椐胞浆/胞膜胞膜/胞核胞核/骨架骨架蛋白的蛋白的亚细胞策略用不同胞策略用不同提取液逐提取液逐级溶解溶解Company Logo四种亚细胞组分分离提取的结果四种亚细胞组分分离提取的结果Company Logo线粒体蛋白样本制备线粒体蛋白样本制备v首先用密度梯度离心方法分首先用密度梯度离心方法分别分离分离出出线粒体粒体,胞胞质,胞核胞核.v再用再用线粒体抽提粒体抽提Buffer溶解溶解线粒体粒体蛋白蛋白.Company Logo其它蛋白抽提产品其它蛋白抽提产品v高丰度蛋白去
17、除试剂盒高丰度蛋白去除试剂盒v信号蛋白提取试剂盒信号蛋白提取试剂盒v糖蛋白提取试剂盒糖蛋白提取试剂盒v细菌蛋白提取试剂盒细菌蛋白提取试剂盒v酵母蛋白提取试剂盒酵母蛋白提取试剂盒v植物蛋白提取试剂盒植物蛋白提取试剂盒Company Logo五五 蛋白定量产品选择指南蛋白定量产品选择指南Company LogoBCA法蛋白定量法蛋白定量 BCA（bicinchoninic acid）是理想的蛋白）是理想的蛋白质定量方法。定量方法。该方法因快速灵敏、方法因快速灵敏、稳定可靠，定可靠，对不同种不同种类蛋白蛋白质检测的的变异系数非常小而倍异系数非常小而倍备受受专业人士的青人士的青睐。该方法的原理方法的原
18、理是，在碱性条件下，蛋白将是，在碱性条件下，蛋白将Cu2+还原原为Cu+，Cu+与与BCA试剂形成紫色的形成紫色的络合物，合物，测定其在定其在562nm处的吸收的吸收值，并与，并与标准曲准曲线对比，即可比，即可计算待算待测蛋白的蛋白的浓度。度。BCA法法测定蛋白定蛋白浓度不受度不受绝大部分大部分样品中的化学物品中的化学物质的影响。的影响。在在组织细胞裂解胞裂解实验中，低中，低浓度的去垢度的去垢剂SDS，Triton X-100，Tween不影响不影响检测结果，但螯合果，但螯合剂（EDTA，EGTA）、）、还原原剂（DTT，巯基乙醇）和脂基乙醇）和脂类会会对检测结果有一定影响。果有一定影响。实验
19、中，若中，若发现样品稀品稀释液或裂解液本身液或裂解液本身背景背景值较高，可高，可试用用Bradford法法测定蛋白定蛋白浓度。度。 Company LogoBradford法法蛋白定量蛋白定量 考马斯亮兰考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（染料的最大吸收峰的位置（lmax），由），由465nm变为变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。测
20、定快速、简便，只需加一种芳香族氨基酸残基相结合。测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜分钟即可完成，其颜色可以在色可以在1小时内保持稳定，且在小时内保持稳定，且在5分钟至分钟至20分钟之间，颜分钟之间，颜色的稳定性最好。由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨色的稳定性最好。由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。去污剂、有较大的
21、偏差。去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸钠（SDS）干扰此法的测定。）干扰此法的测定。 Company LogoLowery法蛋白定量法蛋白定量 Lowry法蛋白法蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。定法是最灵敏的方法之一。过去此法是去此法是应用最广泛的一种方法，在碱性条件下，蛋白用最广泛的一种方法，在碱性条件下，蛋白质中的中的肽键与与铜结合生成复合物。合生成复合物。 Folin酚酚试剂中的磷中的磷钼酸酸盐磷磷钨酸酸盐被蛋白被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，原，产生深生深兰色（色（钼兰和和钨兰的混合物）。在一定的条件下，的混合物）。在一定的
22、条件下，兰色深色深度与蛋白的量成正比。度与蛋白的量成正比。这个个测定法的定法的优点是灵敏度高，缺点是灵敏度高，缺点是点是费时间较长，要精确控制操作，要精确控制操作时间，标准曲准曲线也不是也不是严格的直格的直线形式，且形式，且专一性一性较差，干差，干扰物物质较多。多。Company Logo六六 成功的成功的Western BlotDiagram通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至15ng（最低可到10100pg）中等大小的靶蛋白 原理原
23、理Company Logo六六 成功的成功的Western Blot二抗孵育二抗孵育蛋白提取与定量蛋白提取与定量一一抗孵育抗孵育封闭封闭转膜转膜SDS-聚丙烯酰胺电泳聚丙烯酰胺电泳蛋白变性蛋白变性显影显影Company Logo蛋白变性蛋白变性Tris-cl(PHTris-cl(PH 6.8) 6.8) SDS SDS Glycerol Glycerol B Bromphendromphend-blue -blue -巯基乙醇巯基乙醇 DTTDTT高温变性高温变性, ,形成形成蛋蛋白质白质-SDS胶束胶束急速冷却，防止复性急速冷却，防止复性加入Sample buffer沸水浴15min冰浴30
24、minCompany LogoSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳产物：三维网状结构凝胶产物：三维网状结构凝胶加速剂加速剂催化剂催化剂单体单体交联剂交联剂缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液Tris-ClTris-Cl四甲基乙二胺（四甲基乙二胺（TEMED）丙烯酰胺（丙烯酰胺（Acr）过硫酸胺或核黄素（过硫酸胺或核黄素（AP）甲叉双丙烯酰胺（甲叉双丙烯酰胺（Bis）Company LogoSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 作用缓冲液PH凝胶浓度浓缩胶浓缩胶使蛋白样品浓缩使蛋白样品浓缩PH6.8Tris-ClPH6.8Tris-Cl 低，低，2-5%2-5%分离胶分离胶使蛋白样品分离使蛋
25、白样品分离PH8.8Tris-ClPH8.8Tris-Cl 高，根据蛋白高，根据蛋白大小大小电泳缓冲液：电泳缓冲液：PH8.3Tris-PH8.3Tris-甘氨酸甘氨酸-SDS-SDS系统系统。Company LogoSDS-聚丙烯酰胺凝胶最佳分离范围聚丙烯酰胺凝胶最佳分离范围不同分子量范围的蛋白质应选用不同的凝胶浓度。不同分子量范围的蛋白质应选用不同的凝胶浓度。Company Logo聚丙烯酰胺分离胶配方聚丙烯酰胺分离胶配方Company LogoSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳灌制分离胶 隔绝空气灌好后一般室温放置灌好后一般室温放置3040分钟分钟Company LogoSDS
26、-聚丙烯酰胺凝胶浓缩胶配方聚丙烯酰胺凝胶浓缩胶配方Company LogoSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳灌制积层胶灌制积层胶 插入梳子插入梳子Company LogoSDS-PAGE胶制备注意事项胶制备注意事项v过硫酸铵一般现配现用，如连续实验可在过硫酸铵一般现配现用，如连续实验可在4度放置度放置23天。配制天。配制30丙烯酰胺储存液要过滤。丙烯酰胺储存液要过滤。v配制过程中每加入一种试剂要充分混匀，防止胶配制过程中每加入一种试剂要充分混匀，防止胶出现浓度不均的情况。出现浓度不均的情况。v要根据温度调整要根据温度调整TEMED的使用量。的使用量。v水封的时候水要慢慢加入，太快会导
27、致胶面不平。水封的时候水要慢慢加入，太快会导致胶面不平。v插梳子的时候要用力均匀，一次成型。插梳子的时候要用力均匀，一次成型。v在上样前可在上样前可20V恒压预电泳恒压预电泳20分钟，可去除泳道分钟，可去除泳道中的杂质。中的杂质。Company Logo上样及电泳上样及电泳v提前将样品沸水浴提前将样品沸水浴5分钟，分钟，1200014000rpm离心离心5分钟。分钟。v根据自己的设计上样。根据自己的设计上样。v80V恒压跑浓缩胶。恒压跑浓缩胶。v看溴酚蓝压缩成一条线后把电压调为看溴酚蓝压缩成一条线后把电压调为100V。v当溴酚蓝跑至离胶的下面还有当溴酚蓝跑至离胶的下面还有0.40.6mm时停止
28、电泳。时停止电泳。Company Logo转膜转膜 蛋白质带负电荷，凝胶在负极一侧，膜在正极一蛋白质带负电荷，凝胶在负极一侧，膜在正极一侧，接通电源以后，蛋白质由负极向正极转移至侧，接通电源以后，蛋白质由负极向正极转移至膜上。膜上。Company Logo转膜转膜Company Logo转膜注意事项转膜注意事项vPVDF膜要预先用甲醇活化；膜要预先用甲醇活化；NC膜要预先泡水，除去中间的气泡。然膜要预先泡水，除去中间的气泡。然后在转膜也中平衡后在转膜也中平衡20分钟。分钟。v膜、胶、滤纸夹好后要将中间的气泡全部赶出来，否则有气泡的地方膜、胶、滤纸夹好后要将中间的气泡全部赶出来，否则有气泡的地方
29、就会断路，蛋白无法转到膜上。就会断路，蛋白无法转到膜上。v转膜要在冰浴中进行，防止散热量太大导致转膜温度过高。转膜要在冰浴中进行，防止散热量太大导致转膜温度过高。v根据蛋白分子量大小选择适合的转膜条件。根据蛋白分子量大小选择适合的转膜条件。分子量（分子量（kd）转膜条件膜条件200同上，可在同上，可在转膜液中加膜液中加0.1SDSCompany Logo膜的封闭膜的封闭为避免膜与作为检测试剂的特异性第一抗体发生非特异性结合，使非特异为避免膜与作为检测试剂的特异性第一抗体发生非特异性结合，使非特异性背景提高，需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理性背景提高，需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理,一般用
30、一般用5的脱脂奶的脱脂奶粉或者粉或者3的的BSA室温或室温或37度封闭度封闭2小时。小时。Company Logo转好蛋白的膜转好蛋白的膜ProteinProteinCompany Logo封闭封闭ProteinProteinBlocking AgentBlocking AgentBlocking AgentCompany Logo一抗孵育一抗孵育ProteinProteinBlocking AgentBlocking AgentBlocking AgentPrimary AntibodyCompany Logo二抗孵育二抗孵育ProteinProteinBlocking AgentBlock
31、ing AgentBlocking AgentE E E EPrimary AntibodySecondary AntibodyCompany Logo显影显影ProteinProteinBlocking AgentBlocking AgentBlocking AgentE E E EPrimary AntibodySecondaryAntibodyEnzyme (E)sssssPPPP SubstrateCompany Logo显色方法显色方法- HRP酶促底物直接显色酶促底物直接显色Company Logo显色方法显色方法化学发光化学发光SuperSignal West Pico化学发光底
32、物SuperSignal West Femto超灵敏型底物SuperSignal West Femto增强型底物主要优点与ECL 系统相比减半的价格、双倍的信号适用于HRP检测的最灵敏的化学发光底物延长的信号持续时间使这种底物用于今天的成像设备最为理想检测下限10-12g10-15g 10-14g信号持续时间6-8小时8小时24小时首选检测方法X胶片成像设备或X胶片成像设备或X胶片建议一抗稀释度1:1000-1:50001:5,000-1:100,0001:1000-1:50,000建议二抗稀释度1:20,000-1:100,0001:100,000-1:500,0001:50,000-1:2
33、50,000产品保存期室温1年41年或室温6个月室温1年建议印迹膜硝化纤维硝化纤维或PVDF硝化纤维或PVDFCompany Logo成功的要素成功的要素1质优量足的蛋白样本质优量足的蛋白样本2科学的对照科学的对照3正确的抗体选择正确的抗体选择 保存和使用保存和使用4细致的实验操作细致的实验操作5步步监测步步监测Company Logo科学的对照科学的对照v蛋白蛋白Marker：预染或非预染各种分子量的蛋白，用于标示电泳中蛋白：预染或非预染各种分子量的蛋白，用于标示电泳中蛋白的大小和示踪的大小和示踪v阳性对照：目的蛋白或明确表达目的蛋白的组织或细胞的蛋白提取物，阳性对照：目的蛋白或明确表达目的
34、蛋白的组织或细胞的蛋白提取物，用于检验整个实验体系和过程的正确性有效性用于检验整个实验体系和过程的正确性有效性/特别是一抗的质量和效特别是一抗的质量和效率率v阴性对照：非目的蛋白或明确不表达目的蛋白组织或细胞的蛋白提取阴性对照：非目的蛋白或明确不表达目的蛋白组织或细胞的蛋白提取物，用于检验抗体的特异性物，用于检验抗体的特异性v二抗对照：不加一抗，用于检验二抗的特异性二抗对照：不加一抗，用于检验二抗的特异性v内参对照：管家基因编码的、很多组织和细胞中都稳定表达的蛋白，内参对照：管家基因编码的、很多组织和细胞中都稳定表达的蛋白，用于检测整个用于检测整个WB实验过程及体系是否正常工作，并作为半定量检
35、测实验过程及体系是否正常工作，并作为半定量检测目的蛋白表达量的标准对照目的蛋白表达量的标准对照v空白对照：不加一抗和二抗；用于检测膜的性质和封闭的效果空白对照：不加一抗和二抗；用于检测膜的性质和封闭的效果Company Logo蛋白蛋白MarkerCompany LogoWB常用内参及其技术参数常用内参及其技术参数antibody AC-15 (ab6276) at 1/5000 dilution, Lysates/proteins at 20 ug per laneLane 1 : HeLa nuclearLane 2 : HeLa whole cell lysateLane 3 : A43
36、1 cell lysateLane 4 : Jurkat cell lysateLane 5 : HEK293 cell lysate.Company Logo正确的抗体选择正确的抗体选择 保存和使用保存和使用v一抗的选择一抗的选择: 1、 样本的种属样本的种属 2、 适用于适用于WB实验方法实验方法 3、 单克隆抗体单克隆抗体 经亲和纯化的多克隆抗体经亲和纯化的多克隆抗体v二抗的选择二抗的选择 与一抗种属匹配与一抗种属匹配 HRP标记的标记的 重链轻链 全长的、全长的、Fab段的以及段的以及Fc段的段的v抗体的保存和使用：抗体的保存和使用： 1、按说明书的要求分装保存；、按说明书的要求分装保
37、存； 避免反复冻融避免反复冻融 2、工作液现配现用，、工作液现配现用，4度不超过度不超过2周周 3、说明书推荐的稀释倍数作参考，、说明书推荐的稀释倍数作参考， v提前一个月预订提前一个月预订Company Logo实验细节实验细节v电泳: 变性与还原 SDS的质量 胶的浓度 上样量v转膜: 湿式 半干式 蛋白大小与电转液SDS和甲醇的比例 膜的种类 PVDF NC 尼龙膜 膜的预处理:尺寸同胶 充分浸透 杜绝气泡 防止干燥封闭 脱脂奶粉与BSA的选择 以TBST配制 封闭液需过滤 封闭41小时 封闭与洗膜时间 按抗体说明书提示使用的特殊的封闭剂v一抗孵育 抗体释释液(TBST或封闭液)及稀释倍
38、数, 尽量采用低浓度抗体和较长的孵育时间(过夜) 孵育温度:4 ,轻摇v二抗孵育 抗体释释液(TBST)及稀释倍数 室温 1-2小时 ,轻摇 标记HPRv底物压片曝光 ECL试剂盒 压片时间Company Logo步步监测步步监测v蛋白样本蛋白样本 定量和定量和SDS-PAGE考马斯蓝染色考马斯蓝染色vSDS-PAGE电泳电泳 凝胶铜染监测凝胶铜染监测v转膜转膜 丽春红染色监测丽春红染色监测v一抗一抗 阳性对照阳性对照 阴性对照阴性对照v二抗二抗 二抗对照二抗对照v封闭与洗膜封闭与洗膜 内参对照内参对照 空白对照空白对照v半定量半定量 内参对照内参对照v压片压片 底物直接显色底物直接显色v实验体系实验体系 内参与阳性对照内参与阳性对照Company Logo问题分析问题分析1Company Logo问问题题分分析析2 2Company Logo问题分析3Company Logo问题分析4Company LogoCompany LogoCompanyLOGO
