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1、 二、质粒不稳定的原因二、质粒不稳定的原因 含质粒菌产生不含质粒菌的频率含质粒菌产生不含质粒菌的频率含质粒菌产生不含质粒菌的频率含质粒菌产生不含质粒菌的频率 两种菌的比生长率的大小两种菌的比生长率的大小两种菌的比生长率的大小两种菌的比生长率的大小 对同一工程菌控制不同的比生长数率可改变质对同一工程菌控制不同的比生长数率可改变质对同一工程菌控制不同的比生长数率可改变质对同一工程菌控制不同的比生长数率可改变质粒的拷贝数：粒的拷贝数：粒的拷贝数：粒的拷贝数： 低拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率高低拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率高低拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率高低拷贝质粒工程菌产生不
2、含质粒子代菌频率高如增加工程菌质粒拷贝数可提高稳定性；如增加工程菌质粒拷贝数可提高稳定性；如增加工程菌质粒拷贝数可提高稳定性；如增加工程菌质粒拷贝数可提高稳定性； 高拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率低高拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率低高拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率低高拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率低但对稳定性不利。但对稳定性不利。但对稳定性不利。但对稳定性不利。三、提高质粒稳定性的方法 1 1、选择合适的宿主菌、选择合适的宿主菌 2 2、选择合适的载体、选择合适的载体 3 3、选择性压力、选择性压力 4 4、分阶段控制培养、分阶段控制培养 5 5、控制培养条件、控制培养
3、条件 6 6、固定化、固定化第五节第五节 基因工程菌生长代谢的特点基因工程菌生长代谢的特点n n大肠杆菌的蛋白大肠杆菌的蛋白/ /菌体量的比值是基本菌体量的比值是基本恒定的，因而菌体的生长速度反映了恒定的，因而菌体的生长速度反映了蛋白质的合成速度。蛋白质的合成速度。n n控制菌体的生长对提高质粒的稳定性、控制菌体的生长对提高质粒的稳定性、减少代谢副产物积累、提高外源蛋白减少代谢副产物积累、提高外源蛋白产率有重要意义。产率有重要意义。第五节第五节 基因工程菌生长代谢的特点基因工程菌生长代谢的特点n n菌体生长与能量的关系菌体生长与能量的关系 能量不足时，菌体代谢产生乙酸抑制菌体能量不足时，菌体代
4、谢产生乙酸抑制菌体生长。调控操作参数以控制菌体的生长。生长。调控操作参数以控制菌体的生长。 适当提高适当提高pHpH值、培养方式、培养基、代谢值、培养方式、培养基、代谢工程的方法工程的方法n n菌体生长与前体供应的关系菌体生长与前体供应的关系 竞争竞争第六节第六节 基因工程菌中试基因工程菌中试1 1、工程菌选择、工程菌选择2 2、反应器设计、反应器设计3 3、发酵培养基组成、发酵培养基组成4 4、工艺最佳化育参数监测控制、工艺最佳化育参数监测控制5 5、计算机的应用、计算机的应用第七节第七节 基因工程菌的培养基因工程菌的培养一、培养方式一、培养方式 补料分批培养补料分批培养 连续培养连续培养
5、透析培养透析培养 固定化培养固定化培养二、基因工程菌发酵工艺二、基因工程菌发酵工艺1 1、培养基、培养基 碳源：葡萄糖、乳糖碳源：葡萄糖、乳糖 氮源：酪蛋白水解物、色氨酸氮源：酪蛋白水解物、色氨酸 无机磷：大分子的合成、糖代谢无机磷：大分子的合成、糖代谢2 2、接种量、接种量 过小，延长菌体延迟期过小，延长菌体延迟期 过大，代谢积累物过多过大，代谢积累物过多基因工程菌发酵工艺基因工程菌发酵工艺3 3、温度、温度 复制、转录、翻译或小分子调节分子的合复制、转录、翻译或小分子调节分子的合成等水平成等水平4 4、溶解氧、溶解氧5 5、诱导时机、诱导时机6 6、pHpH值值三、高密度发酵三、高密度发酵
6、n n高密度发酵的概念高密度发酵的概念 一般是指培养液中工程菌的菌体浓度在一般是指培养液中工程菌的菌体浓度在50 50 gDCMgDCM/L/L以上，理论上的最高值可达以上，理论上的最高值可达200 200 gDCMgDCM/L/L。n n高密度发酵的优点高密度发酵的优点 提高提高- -、减少、减少- -、降低、降低- -、缩短、缩短- -1.1.影响高密度发酵的因素影响高密度发酵的因素n n培养基培养基 C/N C/N 寻找葡萄糖的替代物寻找葡萄糖的替代物n n溶氧浓度溶氧浓度 通气量和搅拌速度通气量和搅拌速度 措施：提高氧分压、克隆血红蛋白基因、措施：提高氧分压、克隆血红蛋白基因、与小球藻
7、混合培养与小球藻混合培养n npHpH值值 氨水的使用氨水的使用1.1.影响高密度发酵的因素影响高密度发酵的因素n n温度温度 不同的培养阶段采用不同的温度不同的培养阶段采用不同的温度n n代谢副产物代谢副产物 二氧化碳、乙酸二氧化碳、乙酸2.2.实现高密度发酵的措施实现高密度发酵的措施n n发酵条件的改进发酵条件的改进 培养基的选择培养基的选择 建立流加式培养方式建立流加式培养方式 提高供氧能力提高供氧能力n n构建产乙酸能力低的工程化宿主菌构建产乙酸能力低的工程化宿主菌n n构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌第七节第七节 生物技术药物的分离纯化生物技术药物
8、的分离纯化一、建立分离纯化工艺的根据一、建立分离纯化工艺的根据二、分离纯化的基本过程二、分离纯化的基本过程三、生物分离过程经验法则三、生物分离过程经验法则一、建立分离纯化工艺的根据一、建立分离纯化工艺的根据1. 1. 含目的产物的起始物料的特点含目的产物的起始物料的特点2. 2. 2. 2. 物料中杂质的种类和性质物料中杂质的种类和性质物料中杂质的种类和性质物料中杂质的种类和性质3. 3. 3. 3. 目的产物特性目的产物特性目的产物特性目的产物特性产物的化学、物理和生物学特性产物的化学、物理和生物学特性产物的化学、物理和生物学特性产物的化学、物理和生物学特性4. 4. 4. 4. 产品质量的
9、要求产品质量的要求产品质量的要求产品质量的要求产品纯度、生物活性、比活产品纯度、生物活性、比活产品纯度、生物活性、比活产品纯度、生物活性、比活二、分离纯化的基本过程二、分离纯化的基本过程n n细胞破碎细胞破碎n n固液分离固液分离n n浓缩与初步纯化浓缩与初步纯化n n高度纯化高度纯化n n制剂制剂n n产品产品三、生物分离过程经验法则三、生物分离过程经验法则经验法则经验法则经验法则经验法则基本原理基本原理基本原理基本原理在分离过程中尽早减小样品体积在分离过程中尽早减小样品体积在分离过程中尽早减小样品体积在分离过程中尽早减小样品体积降低装置体积、成本和操作费用降低装置体积、成本和操作费用降低装
10、置体积、成本和操作费用降低装置体积、成本和操作费用将耗费最高的分离步骤（通常是高分将耗费最高的分离步骤（通常是高分将耗费最高的分离步骤（通常是高分将耗费最高的分离步骤（通常是高分辨率的步骤）放在最后辨率的步骤）放在最后辨率的步骤）放在最后辨率的步骤）放在最后适应顾客和管理需要，减小处理量以适应顾客和管理需要，减小处理量以适应顾客和管理需要，减小处理量以适应顾客和管理需要，减小处理量以降低成本降低成本降低成本降低成本遵守遵守遵守遵守KISSKISSKISSKISS原则原则原则原则减少过程中的步骤数，降低故障率和减少过程中的步骤数，降低故障率和减少过程中的步骤数，降低故障率和减少过程中的步骤数，降
11、低故障率和成本成本成本成本尽早提炼目标组分尽早提炼目标组分尽早提炼目标组分尽早提炼目标组分减少由于酶解导致的产物损失，尽早减少由于酶解导致的产物损失，尽早减少由于酶解导致的产物损失，尽早减少由于酶解导致的产物损失，尽早除去杂质以提高下游分离过程效率除去杂质以提高下游分离过程效率除去杂质以提高下游分离过程效率除去杂质以提高下游分离过程效率使生物反应器中的产物抑制降至最低，使生物反应器中的产物抑制降至最低，使生物反应器中的产物抑制降至最低，使生物反应器中的产物抑制降至最低，提高最终产品浓度提高最终产品浓度提高最终产品浓度提高最终产品浓度高浓产物可以提高收率，简化分离步高浓产物可以提高收率，简化分离
12、步高浓产物可以提高收率，简化分离步高浓产物可以提高收率，简化分离步骤骤骤骤在分离过程中尽早减小样品体积在分离过程中尽早减小样品体积n n生物分离过程中两个需要尽可能减小的生物分离过程中两个需要尽可能减小的变量是成本和时间变量是成本和时间n n首先，设计者要确定能够满足分离要求首先，设计者要确定能够满足分离要求必需的分离步骤必需的分离步骤n n此后，分离过程的成本就与样品的体积此后，分离过程的成本就与样品的体积或流速紧密相关或流速紧密相关n n减小样品体积的实质是除去水分减小样品体积的实质是除去水分n n沉淀、萃取沉淀、萃取 、吸附、亲和、吸附、亲和举例举例生物反应器生物反应器生物反应器生物反应
13、器混合器混合器混合器混合器离心机离心机离心机离心机混合器混合器混合器混合器离心机离心机离心机离心机一级丁醇一级丁醇一级丁醇一级丁醇萃取液萃取液萃取液萃取液丁醇丁醇丁醇丁醇二级丁醇二级丁醇二级丁醇二级丁醇萃取液萃取液萃取液萃取液丁醇丁醇丁醇丁醇链霉素的萃取流程链霉素的萃取流程链霉素的萃取流程链霉素的萃取流程将耗费最高的分离步骤（通常是高分辨将耗费最高的分离步骤（通常是高分辨率的步骤）放在最后率的步骤）放在最后原因有二原因有二1. 1. 分离操作的设备投资和操作费用是与样分离操作的设备投资和操作费用是与样品流速相关的，虽然高分离成本主要是由品流速相关的，虽然高分离成本主要是由高分辨率高所致，但也不
14、难理解此时处理高分辨率高所致，但也不难理解此时处理的样品流率也应尽可能低的样品流率也应尽可能低 2.2.可以在得到合格的产品后立即成形和包可以在得到合格的产品后立即成形和包装装遵守遵守KISSKISS原则原则n n保持过程简单和笨拙保持过程简单和笨拙（keep it simple keep it simple and stupid)and stupid)n n只有当从易于过程控制和故障排除方面考只有当从易于过程控制和故障排除方面考虑时，才会希望用所谓先进的、精致的流虑时，才会希望用所谓先进的、精致的流程程n n在能够满足目标的前提下，该过程所包含在能够满足目标的前提下，该过程所包含的步骤应该尽
15、可能少的步骤应该尽可能少举例举例固定化细胞固定化细胞固定化细胞固定化细胞反应器反应器反应器反应器加热，调加热，调加热，调加热，调pHpHpHpH至至至至2.72.72.72.7冷却至冷却至冷却至冷却至2525离心机离心机离心机离心机干燥器干燥器干燥器干燥器天冬氨酸沉淀天冬氨酸沉淀天冬氨酸沉淀天冬氨酸沉淀天冬氨酸生产天冬氨酸生产尽早提炼组分尽早提炼组分原因原因n n减少分离步骤减少分离步骤n n杂质存在导致酶降解或产品变性杂质存在导致酶降解或产品变性举例举例生物反应器生物反应器生物反应器生物反应器离心机离心机离心机离心机阳离子交换剂阳离子交换剂阳离子交换剂阳离子交换剂反渗透膜反渗透膜反渗透膜反渗
16、透膜固体固体固体固体反应器料液反应器料液反应器料液反应器料液的废液的废液的废液的废液氨和水氨和水氨和水氨和水采用阳离子交换剂初步分离赖氨酸采用阳离子交换剂初步分离赖氨酸其他其他n n依据类似商业产品的生产过程来设计生物依据类似商业产品的生产过程来设计生物分离过程分离过程n n生物分离过程和生物反应器研发同步进行生物分离过程和生物反应器研发同步进行时的问题时的问题n n利用模拟料液进行中试实验利用模拟料液进行中试实验在分离过程设计中，当生物反应器料液不足或产品浓度低在分离过程设计中，当生物反应器料液不足或产品浓度低在分离过程设计中，当生物反应器料液不足或产品浓度低在分离过程设计中，当生物反应器料
17、液不足或产品浓度低于预期值时，一个实用的解决方法是向生物反应器流体中于预期值时，一个实用的解决方法是向生物反应器流体中于预期值时，一个实用的解决方法是向生物反应器流体中于预期值时，一个实用的解决方法是向生物反应器流体中加入目标组分，使其达到预期值。加入目标组分，使其达到预期值。加入目标组分，使其达到预期值。加入目标组分，使其达到预期值。第三节第三节 包含体的分离与包含体的分离与蛋白质的复性蛋白质的复性一、包含体一、包含体 外源蛋白质在外源蛋白质在E. coli中高效表达时常形成不中高效表达时常形成不可溶、无生物活性的聚集体。可溶、无生物活性的聚集体。二、包含体的形成二、包含体的形成 部分的折叠
18、的中间态之间相互作用的成果部分的折叠的中间态之间相互作用的成果 三、包含体的分离与蛋白质复性三、包含体的分离与蛋白质复性（一）分离（一）分离 细胞破碎细胞破碎细胞破碎细胞破碎低速离心或洗滤低速离心或洗滤低速离心或洗滤低速离心或洗滤包含体沉淀包含体沉淀包含体沉淀包含体沉淀（二）蛋白质的复性步骤（二）蛋白质的复性步骤 1. 1. 用含有蔗糖、用含有蔗糖、用含有蔗糖、用含有蔗糖、Triton-100Triton-100、脱氧胆酸或尿素缓冲液冲洗、脱氧胆酸或尿素缓冲液冲洗、脱氧胆酸或尿素缓冲液冲洗、脱氧胆酸或尿素缓冲液冲洗包含体。包含体。包含体。包含体。 2 2. . 用变性尿素或盐酸胍以及用变性尿素
19、或盐酸胍以及用变性尿素或盐酸胍以及用变性尿素或盐酸胍以及SDSSDS等变性剂溶解包含体使等变性剂溶解包含体使等变性剂溶解包含体使等变性剂溶解包含体使其变成伸展的肽链，还原剂还原二硫键。其变成伸展的肽链，还原剂还原二硫键。其变成伸展的肽链，还原剂还原二硫键。其变成伸展的肽链，还原剂还原二硫键。 3. 3. 脱除变性剂，加入氧化剂使伸展的肽链折叠成正确的脱除变性剂，加入氧化剂使伸展的肽链折叠成正确的脱除变性剂，加入氧化剂使伸展的肽链折叠成正确的脱除变性剂，加入氧化剂使伸展的肽链折叠成正确的空间结构。空间结构。空间结构。空间结构。包含体复性的方法包含体复性的方法1. 1. 稀释、透析稀释、透析2.
20、2. 含二硫键的蛋白复性含二硫键的蛋白复性（1 1 1 1）空气氧化法；（）空气氧化法；（）空气氧化法；（）空气氧化法；（2 2 2 2）加入氧化）加入氧化）加入氧化）加入氧化- - - -还原转换试剂还原转换试剂还原转换试剂还原转换试剂（3 3 3 3）用还原试剂或亚硫酸钠）用还原试剂或亚硫酸钠）用还原试剂或亚硫酸钠）用还原试剂或亚硫酸钠/ / / /连四硫酸钠使变性蛋白磺连四硫酸钠使变性蛋白磺连四硫酸钠使变性蛋白磺连四硫酸钠使变性蛋白磺化化化化 以保护巯基以保护巯基以保护巯基以保护巯基（4 4 4 4）加入二硫苏糖醇）加入二硫苏糖醇）加入二硫苏糖醇）加入二硫苏糖醇3. 3. 封闭蛋白的疏水
21、簇封闭蛋白的疏水簇4. 4.凝胶过滤层析复性凝胶过滤层析复性5. 5. 小分子添加剂小分子添加剂6. 6.加入分子伴侣加入分子伴侣7. 7. 人工分子伴侣人工分子伴侣第八节、质量控制第八节、质量控制一、原材料的质量控制一、原材料的质量控制 原材料的质量控制是确保编码药品的原材料的质量控制是确保编码药品的DNADNA序列的正确性，重组微生物来自序列的正确性，重组微生物来自单一克隆，所用质粒纯而稳定，以保单一克隆，所用质粒纯而稳定，以保证产品质量的安全性和一致性。证产品质量的安全性和一致性。 根据质量控制要求应了解以下根据质量控制要求应了解以下根据质量控制要求应了解以下根据质量控制要求应了解以下
22、特性：特性：特性：特性： 1 1 1 1 、明确目的基因的来源、克隆经过，、明确目的基因的来源、克隆经过，、明确目的基因的来源、克隆经过，、明确目的基因的来源、克隆经过，并以限制性内切酶酶切图谱并以限制性内切酶酶切图谱并以限制性内切酶酶切图谱并以限制性内切酶酶切图谱 和核苷酸序列予以确证和核苷酸序列予以确证和核苷酸序列予以确证和核苷酸序列予以确证2 2、应提供表达载体的名称、结构、应提供表达载体的名称、结构、应提供表达载体的名称、结构、应提供表达载体的名称、结构、遗传特性及各组成部分（如复制子、遗传特性及各组成部分（如复制子、遗传特性及各组成部分（如复制子、遗传特性及各组成部分（如复制子、启动
23、子）的来源与功能，构建中所启动子）的来源与功能，构建中所启动子）的来源与功能，构建中所启动子）的来源与功能，构建中所用位点的酶切图谱，抗生素抗性标用位点的酶切图谱，抗生素抗性标用位点的酶切图谱，抗生素抗性标用位点的酶切图谱，抗生素抗性标记物；记物；记物；记物；3 3 3 3、应提供宿主细胞的名称、来源、传、应提供宿主细胞的名称、来源、传、应提供宿主细胞的名称、来源、传、应提供宿主细胞的名称、来源、传代历史、检定结果及其生物学特性；代历史、检定结果及其生物学特性；代历史、检定结果及其生物学特性；代历史、检定结果及其生物学特性；4 4 4 4、须阐明载体引入宿主细胞的方法及、须阐明载体引入宿主细胞
24、的方法及、须阐明载体引入宿主细胞的方法及、须阐明载体引入宿主细胞的方法及载体在宿主细胞与载体结合后的遗传载体在宿主细胞与载体结合后的遗传载体在宿主细胞与载体结合后的遗传载体在宿主细胞与载体结合后的遗传稳定性；稳定性；稳定性；稳定性；提供插入基因与表达载体两侧端控提供插入基因与表达载体两侧端控提供插入基因与表达载体两侧端控提供插入基因与表达载体两侧端控制区内的核苷酸序列，详细叙述在生制区内的核苷酸序列，详细叙述在生制区内的核苷酸序列，详细叙述在生制区内的核苷酸序列，详细叙述在生产过程中启动与控制基因在宿主细胞产过程中启动与控制基因在宿主细胞产过程中启动与控制基因在宿主细胞产过程中启动与控制基因在
25、宿主细胞中表达的方法及水平等。中表达的方法及水平等。中表达的方法及水平等。中表达的方法及水平等。二、培养过程的质量控制二、培养过程的质量控制 在工程菌的贮存中，要求种子克隆在工程菌的贮存中，要求种子克隆在工程菌的贮存中，要求种子克隆在工程菌的贮存中，要求种子克隆纯而稳定；纯而稳定；纯而稳定；纯而稳定； 在培养过程中，要求工程菌所含在培养过程中，要求工程菌所含在培养过程中，要求工程菌所含在培养过程中，要求工程菌所含的质粒稳定，始终无突变；的质粒稳定，始终无突变；的质粒稳定，始终无突变；的质粒稳定，始终无突变； 在重复生产发酵中，工程菌表达在重复生产发酵中，工程菌表达在重复生产发酵中，工程菌表达在
26、重复生产发酵中，工程菌表达稳定；稳定；稳定；稳定； 始终能排除外源微生物污染。始终能排除外源微生物污染。始终能排除外源微生物污染。始终能排除外源微生物污染。 生产基因工程产品应有种子批系统，并生产基因工程产品应有种子批系统，并生产基因工程产品应有种子批系统，并生产基因工程产品应有种子批系统，并证明种子批不含有致癌因子，无细菌、证明种子批不含有致癌因子，无细菌、证明种子批不含有致癌因子，无细菌、证明种子批不含有致癌因子，无细菌、病毒、真菌和支原体等污染，并由原始病毒、真菌和支原体等污染，并由原始病毒、真菌和支原体等污染，并由原始病毒、真菌和支原体等污染，并由原始种子批建立生产用工作细胞库。种子批
27、建立生产用工作细胞库。种子批建立生产用工作细胞库。种子批建立生产用工作细胞库。 原始种子批须确证克隆基因原始种子批须确证克隆基因原始种子批须确证克隆基因原始种子批须确证克隆基因DNADNADNADNA序列，序列，序列，序列，详细叙述种子批来源、方式、保存及预详细叙述种子批来源、方式、保存及预详细叙述种子批来源、方式、保存及预详细叙述种子批来源、方式、保存及预计使用期，保存与复苏时宿主载体表达计使用期，保存与复苏时宿主载体表达计使用期，保存与复苏时宿主载体表达计使用期，保存与复苏时宿主载体表达系统的稳定性。系统的稳定性。系统的稳定性。系统的稳定性。 对生产种子，应详细叙述细胞生长与产品对生产种子
28、，应详细叙述细胞生长与产品对生产种子，应详细叙述细胞生长与产品对生产种子，应详细叙述细胞生长与产品生成的方法和材料，并控制微生物污染；生成的方法和材料，并控制微生物污染；生成的方法和材料，并控制微生物污染；生成的方法和材料，并控制微生物污染；提供培养生产浓度与产量恒定性数据，依提供培养生产浓度与产量恒定性数据，依提供培养生产浓度与产量恒定性数据，依提供培养生产浓度与产量恒定性数据，依据宿主细胞据宿主细胞据宿主细胞据宿主细胞- - - -载体系统稳定性，确定最高载体系统稳定性，确定最高载体系统稳定性，确定最高载体系统稳定性，确定最高允许传种代数；允许传种代数；允许传种代数；允许传种代数； 在培养
29、过程中，应测定被表达基因分子的在培养过程中，应测定被表达基因分子的在培养过程中，应测定被表达基因分子的在培养过程中，应测定被表达基因分子的完整性及宿主细胞长期培养后的基因型特完整性及宿主细胞长期培养后的基因型特完整性及宿主细胞长期培养后的基因型特完整性及宿主细胞长期培养后的基因型特征；依宿主细胞征；依宿主细胞征；依宿主细胞征；依宿主细胞- - - -载体稳定性与产品恒定载体稳定性与产品恒定载体稳定性与产品恒定载体稳定性与产品恒定性，规定持续培养时间，并定期评价细胞性，规定持续培养时间，并定期评价细胞性，规定持续培养时间，并定期评价细胞性，规定持续培养时间，并定期评价细胞系统和产品。系统和产品。
30、系统和产品。系统和产品。 培养周期结束时，应监测宿主细胞培养周期结束时，应监测宿主细胞培养周期结束时，应监测宿主细胞培养周期结束时，应监测宿主细胞- - - -载体载体载体载体系统的特性，如质粒拷贝数、宿主细胞系统的特性，如质粒拷贝数、宿主细胞系统的特性，如质粒拷贝数、宿主细胞系统的特性，如质粒拷贝数、宿主细胞中表达载体存留程度，含插入基因载体中表达载体存留程度，含插入基因载体中表达载体存留程度，含插入基因载体中表达载体存留程度，含插入基因载体的酶切图谱等。的酶切图谱等。的酶切图谱等。的酶切图谱等。 三、纯化工艺过程的质量控制三、纯化工艺过程的质量控制三、纯化工艺过程的质量控制三、纯化工艺过程
31、的质量控制uuu 产品要有足够的生理和生物学试验产品要有足够的生理和生物学试验产品要有足够的生理和生物学试验产品要有足够的生理和生物学试验数据，确证提纯物分子批间保持一致数据，确证提纯物分子批间保持一致数据，确证提纯物分子批间保持一致数据，确证提纯物分子批间保持一致性；外源蛋白质、性；外源蛋白质、性；外源蛋白质、性；外源蛋白质、DNADNADNADNA与热源质控制与热源质控制与热源质控制与热源质控制在规定限度以下。在规定限度以下。在规定限度以下。在规定限度以下。uuu在精制过程中能清除宿主细胞蛋白质、在精制过程中能清除宿主细胞蛋白质、在精制过程中能清除宿主细胞蛋白质、在精制过程中能清除宿主细胞
32、蛋白质、核酸、糖类、病毒、培养基成分及精核酸、糖类、病毒、培养基成分及精核酸、糖类、病毒、培养基成分及精核酸、糖类、病毒、培养基成分及精制工序本身引入的化学物质，并有检制工序本身引入的化学物质，并有检制工序本身引入的化学物质，并有检制工序本身引入的化学物质，并有检测方法。测方法。测方法。测方法。四、目标产品的质量控制四、目标产品的质量控制 基因工程药物的质量控制主要包基因工程药物的质量控制主要包基因工程药物的质量控制主要包基因工程药物的质量控制主要包括以下几项要求括以下几项要求括以下几项要求括以下几项要求: : : :产品的鉴别、纯度、产品的鉴别、纯度、产品的鉴别、纯度、产品的鉴别、纯度、活性
33、、安全性、稳定性和一致性。活性、安全性、稳定性和一致性。活性、安全性、稳定性和一致性。活性、安全性、稳定性和一致性。它需要利用生物化学、免疫学、微它需要利用生物化学、免疫学、微它需要利用生物化学、免疫学、微它需要利用生物化学、免疫学、微生物学、细胞生物学和分子生物学生物学、细胞生物学和分子生物学生物学、细胞生物学和分子生物学生物学、细胞生物学和分子生物学等多学科的理论与技术所建立的鉴等多学科的理论与技术所建立的鉴等多学科的理论与技术所建立的鉴等多学科的理论与技术所建立的鉴定方法。定方法。定方法。定方法。产品的鉴别产品的鉴别产品的鉴别产品的鉴别 常用的鉴定方法常用的鉴定方法常用的鉴定方法常用的鉴
34、定方法: : : : 电泳方法电泳方法电泳方法电泳方法: SDS-PAGE: SDS-PAGE: SDS-PAGE: SDS-PAGE、等电聚焦、等电聚焦、等电聚焦、等电聚焦、免疫电泳免疫电泳免疫电泳免疫电泳 免疫学方法免疫学方法免疫学方法免疫学方法: : : : 放射免疫放射免疫放射免疫放射免疫(RIA)(RIA)(RIA)(RIA)、酶联免、酶联免、酶联免、酶联免疫疫疫疫(ELISA)(ELISA)(ELISA)(ELISA) 受体结合试验受体结合试验受体结合试验受体结合试验 高效液相色谱高效液相色谱高效液相色谱高效液相色谱(HPLC)(HPLC)(HPLC)(HPLC)、肽图分析法、肽图
35、分析法、肽图分析法、肽图分析法、末端序列分末端序列分末端序列分末端序列分 析、圆二色谱、核磁析、圆二色谱、核磁析、圆二色谱、核磁析、圆二色谱、核磁共振共振共振共振 肽图分析肽图分析肽图分析肽图分析 肽图分析是用酶法或化学法降解目肽图分析是用酶法或化学法降解目肽图分析是用酶法或化学法降解目肽图分析是用酶法或化学法降解目的蛋白质，对生成的肽段进行分离分的蛋白质，对生成的肽段进行分离分的蛋白质，对生成的肽段进行分离分的蛋白质，对生成的肽段进行分离分析。它是检测蛋白质一级结构最有效析。它是检测蛋白质一级结构最有效析。它是检测蛋白质一级结构最有效析。它是检测蛋白质一级结构最有效的方法，该技术灵敏高效是对
36、基因工的方法，该技术灵敏高效是对基因工的方法，该技术灵敏高效是对基因工的方法，该技术灵敏高效是对基因工程药物的分子结构和遗传稳定性进行程药物的分子结构和遗传稳定性进行程药物的分子结构和遗传稳定性进行程药物的分子结构和遗传稳定性进行评价和验证的首选方法。常用评价和验证的首选方法。常用评价和验证的首选方法。常用评价和验证的首选方法。常用HPLCHPLCHPLCHPLC、毛细管电泳。毛细管电泳。毛细管电泳。毛细管电泳。 氨基酸成分分析氨基酸成分分析氨基酸成分分析氨基酸成分分析 50505050个氨基酸较理想个氨基酸较理想个氨基酸较理想个氨基酸较理想 部分氨基酸序列分析部分氨基酸序列分析部分氨基酸序列
37、分析部分氨基酸序列分析 N NN N端端端端15151515个氨基酸可作为重组蛋白质和多肽个氨基酸可作为重组蛋白质和多肽个氨基酸可作为重组蛋白质和多肽个氨基酸可作为重组蛋白质和多肽的重要鉴定指标。的重要鉴定指标。的重要鉴定指标。的重要鉴定指标。 重组蛋白质浓度测定和相对分子量的测定重组蛋白质浓度测定和相对分子量的测定重组蛋白质浓度测定和相对分子量的测定重组蛋白质浓度测定和相对分子量的测定 蛋白质二硫键分析蛋白质二硫键分析蛋白质二硫键分析蛋白质二硫键分析 测定方法有：对氯汞苯甲酸法等测定方法有：对氯汞苯甲酸法等测定方法有：对氯汞苯甲酸法等测定方法有：对氯汞苯甲酸法等 5 5 5 5，5 5 5
38、5- - - -二硫基双二硫基双二硫基双二硫基双-2-2-2-2-硝基苯甲酸法硝基苯甲酸法硝基苯甲酸法硝基苯甲酸法 纯度分析纯度分析纯度分析纯度分析 蛋白质含量测定蛋白质含量测定蛋白质含量测定蛋白质含量测定 SDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGE、等电聚焦、各种、等电聚焦、各种、等电聚焦、各种、等电聚焦、各种HPLCHPLCHPLCHPLC、 毛细管电泳毛细管电泳毛细管电泳毛细管电泳 杂质杂质杂质杂质 蛋白类杂质蛋白类杂质蛋白类杂质蛋白类杂质 残留宿主细胞蛋白残留宿主细胞蛋白残留宿主细胞蛋白残留宿主细胞蛋白 采用免疫分析的方法采用免疫分析的方法采用免疫分析的方法采用免
39、疫分析的方法非蛋白类杂质非蛋白类杂质非蛋白类杂质非蛋白类杂质 病毒、细菌等微生物、热原、病毒、细菌等微生物、热原、病毒、细菌等微生物、热原、病毒、细菌等微生物、热原、内毒素、致敏源及内毒素、致敏源及内毒素、致敏源及内毒素、致敏源及DNADNADNADNA。 常用检测方法：常用检测方法：常用检测方法：常用检测方法：l ll内毒素：内毒素：内毒素：内毒素： 鲎试剂、家兔热原法鲎试剂、家兔热原法鲎试剂、家兔热原法鲎试剂、家兔热原法l ll宿主细胞蛋白宿主细胞蛋白宿主细胞蛋白宿主细胞蛋白 ：免疫分析、：免疫分析、：免疫分析、：免疫分析、SDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGE、
40、CECECECEl ll其它蛋白杂质其它蛋白杂质其它蛋白杂质其它蛋白杂质 ：免疫分析、：免疫分析、：免疫分析、：免疫分析、SDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGE、 HPLCHPLCHPLCHPLC、CECECECEl ll残余残余残余残余DNA DNA DNA DNA ：DNADNADNADNA杂交、紫外光谱、蛋白结合杂交、紫外光谱、蛋白结合杂交、紫外光谱、蛋白结合杂交、紫外光谱、蛋白结合l ll蛋白变异蛋白变异蛋白变异蛋白变异 ：肽谱、：肽谱、：肽谱、：肽谱、HPLCHPLCHPLCHPLC、 IEFIEFIEFIEF、 CECECECEl ll甲酰蛋氨酸甲酰蛋氨酸
41、甲酰蛋氨酸甲酰蛋氨酸 ：肽谱、：肽谱、：肽谱、：肽谱、HPLCHPLCHPLCHPLC、 IEFIEFIEFIEF、 CECECECEl ll蛋氨酸氧化：肽谱、蛋氨酸氧化：肽谱、蛋氨酸氧化：肽谱、蛋氨酸氧化：肽谱、HPLCHPLCHPLCHPLC、 质谱、氨基酸分质谱、氨基酸分质谱、氨基酸分质谱、氨基酸分析析析析l ll产物变性或聚和脱氨基产物变性或聚和脱氨基产物变性或聚和脱氨基产物变性或聚和脱氨基 ： SDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGE、IEFIEFIEFIEF、HPLCHPLCHPLCHPLC、 CECECECE、质谱、凝胶过滤、质谱、凝胶过滤、质谱、凝胶过滤、质谱、凝胶过滤
