第二章 细胞生物学研究方法 第一节 细胞形态结构的观察方法•一、光学显微镜技术•二、电子显微镜技术•三、扫描隧道显微镜 光学显微镜技术基本参数分辨率 R=0.61λ/N．．A放大率N．．A：数值孔径：数值孔径 •1. 构成：• ①照明系统• ②光学放大系统• ③机械装置•2. 原理：经物镜形成倒立实像，经目镜放大成虚像普通光学显微镜介绍普通光学显微镜介绍 光路图 Figure 9-11a Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)肾的尿道横切面，用苏木精-伊红染 色或“H&E染色”（hematoxylin and eosin stain、H&E stain）苏木精：嗜碱性结构染成蓝紫色伊红：嗜酸性结构染成粉红色 Figure 9-11b Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)植物根横切面，番红番红──快绿快绿染 色适用于高等植物根，茎，叶的染色木质化的细胞壁及核呈红色，薄壁细胞，细胞质等呈绿色 几种特殊的光学显微镜•相差显微镜技术把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。
在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处1.环形光阑（annular diaphragm）：位于光源与聚光器之间2.相位板（annular phaseplate）：物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ 用途：观察未经染色的玻片标本 干涉显微镜干涉显微镜 （DIC）•1952年Nomarski发明，利用两组平面偏振光的干涉，加强影像的明暗效果，能显示结构的三维立体投影标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强 倒置显微镜倒置显微镜•物镜（下）与照明系统颠倒（上）；•用于观察培养的活细胞，通常具有相差或DIC物镜，有的还具有荧光装置 暗视野显微镜暗视野显微镜•聚光镜中央有挡光片，照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野背景是黑的，物体边缘是亮的•可观察 4~200nm的微粒子，分辨率比普通显微镜高50倍 荧光显微镜•特点：光源为短波光；•有两个特殊的滤光片；•照明方式通常为落射式 Figure 9-14 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 普通光学显微镜（普通光学显微镜（A）和荧光显微镜）和荧光显微镜(B)的光路图的光路图。
vIndirect immunofluorescence lebeled Tchnique. To study the location of a specific protein within the cell by using of fluorescent antibody (antigen-antibody couple).GFP can be used to study dynamic processes as they occur in a living cell. Figure 9-18 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)Indirect immunocytochemistry 图中图中, DNA 为蓝色为蓝色 ，微管为绿色，微管为绿色•用于观察能激发出荧光的结构，包括免疫组化、原位杂交等用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断 Figure 9-15 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)细胞有丝分裂细胞有丝分裂, DNA 为蓝色为蓝色 ，微管为绿色，中心体为红色，微管为绿色，中心体为红色 2024/9/624荧光显微镜 Fluorescence Microscopy Laser Confocal Scanning Light Microscopy（（LCSM）） 激光扫描共焦显微镜的原理图 A.激光束（光源）经双色镜反射后，通过物镜汇聚到样品某一焦点；B.从焦点发射的荧光(样品一般须经免疫荧光标记)经透镜汇聚成像，被检测器检出；C. 通过样品其它部位的激光即激光发出的荧光不会聚焦成像，因而检测器不能检出。
In the late 1950s M.Minsky of MIT免疫荧光技术（免疫荧光技术（A）和激光共焦显微镜技术）和激光共焦显微镜技术(B)的比较的比较 2024/9/626Slide 40x活细胞图像4－维分析激光共焦显微镜 LSCM 激光共聚焦扫描显微境激光共聚焦扫描显微境 •用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描•能显示细胞样品的立体结构•分辨力是普通光学显微镜的3倍•用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像 LCSM Image of a Xenopus Melanophore microtubule cytoskeleton (green) and the nucleus (blue) http://www.itg.uiuc.edu/ 2024/9/630活细胞内分子图像追踪 电子显微镜•透射电子显微镜•扫描电子显微镜 透射电子显微镜Transmission Electron Microscopy•以电子束作光源，电磁场作透镜电子束波长与加速电压(通常50~120KV)的平方根成反比•由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成。
•分辨力0.2nm，放大倍数可达百万倍•用于观察超微结构（小于0.2µm） 电子显微镜光成像原理电子显微镜光成像原理 A.透射电子显微镜剖面图B. 透射电子显微镜电子成像原理图 分辨本领光 源透 镜真 空成像原理光学显微镜200nm可见光 (波长400～700nm)玻璃透镜不要求真空利用样本对光的吸收形成明暗反差和颜色变化电子显微镜 接近0.1nm电子束(波长0.01～0.9nm)电磁透镜1.33×10-3～1.33×10-5Pa利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差电子显微镜与光学显微镜的基本区别电子显微镜与光学显微镜的基本区别 Transmission Electron MicroscopyA. The comparison of the lens systems of LM and TEM •20世纪60年代问世，用来观察标本表面结构•分辨力为6~10nm，由于人眼的分辨力（区别荧光屏上距离最近两个光点的能力）为0.2mm，扫描电镜的有效放大倍率为0.2mm/10nm=20000X扫描电子显微镜扫描电子显微镜人类红细胞人类红细胞 扫描隧道显微镜扫描隧道显微镜•原理：根据隧道效应设计，当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（2mV~2V），针尖与样品之间形成隧道电流。
电流强度与针尖和样品间的距离有函数关系，将扫描过程中电流的变化转换为图像，即可显示出原子水平的凹凸形态•分辨率：横向为0.1~0.2nm，纵向可达0.001nm•用途：三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察 Fluorescence Resonance Energy Transfer，，FRET FRET技术是检测活体中生物大分子纳技术是检测活体中生物大分子纳米级距离和纳米级距离变化的有力工米级距离和纳米级距离变化的有力工具，可以检测某一细胞中两个蛋白是具，可以检测某一细胞中两个蛋白是否存在直接的相互作用否存在直接的相互作用 Fluorescence Recovery After Photobleaching，FRAP 荧光漂白恢复原理荧光漂白恢复原理: 利用高能量激光束的照射使特定的区域的荧光发生不可逆利用高能量激光束的照射使特定的区域的荧光发生不可逆的淬灭，通过非漂白区的荧光标记分子在膜上或胞浆中运动至光漂白区来完成的淬灭，通过非漂白区的荧光标记分子在膜上或胞浆中运动至光漂白区来完成光漂白区荧光的恢复光漂白区荧光的恢复FRAP 可以用于解决活细胞内包括蛋白定位，动力可以用于解决活细胞内包括蛋白定位，动力学以及与其他成分相互作用等一系列问题。
学以及与其他成分相互作用等一系列问题 vFreeze – Etching Fracture 冷冻蚀刻冷冻蚀刻Freeze –Fracture and Etching Replication冷冻断裂蚀刻复型冷冻断裂蚀刻复型 第二节第二节 细胞组分的分析方法细胞组分的分析方法一、 用离心技术分离细胞器与生物大分 子及其复合物二、 细胞内生物大分子的示踪技术、原位杂交三、 应用放射自显影技术等研究生物大分子在细胞内的合成动态和功能四、流式细胞技术、技术进展和功能 离心技术•差速离心•密度梯度离心 ——速度密度梯度离心：主要用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器 ——等密度梯度离心 The Fractionation and analysis for Cell' s contentsA.The technique of differential centrifugationStep-by-step procedure for the purification of organelles by differential centrifugation.S=(dx/dt)/2x =1×10-13sec.用差速离心分离各细胞组分。
用差速离心分离各细胞组分在细胞匀浆物中，较小的细胞组分需要更大的离心力才能使其沉淀 1000g, 10min, 20000g, 20min， 高速： 80,000g, 1hr, 150，000g, 3hr Subsequent purification by Density-Gradient Equilibrium Centrifugation Isolation, purification, and fractionation of proteinsv Selective Precipitationv (ammonium sulfate)v Liquid Column Chromatography （柱层析）（柱层析）v Ion-exchange Chromatographyv Gel Filtration Chromatography 又称排阻层析或分子筛方法，也叫做分子排阻层析（molecular-exclusion chromatography）：交联的聚糖(如葡聚糖sephadex或琼脂糖) v Affinity Chromatographyv Polyacrylamide Gel Electrophoresis 细胞内生物大分子的示踪技术、细胞内生物大分子的示踪技术、原位杂交、蛋白质研究技术原位杂交、蛋白质研究技术 •（一）细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类（一）细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类与脂质等的显示方法与脂质等的显示方法 1、、DNA的细胞分布的细胞分布--Feulgen法法 DNA经稀酸水解后产生的醛基，具有还原作用，可与无色品红结合形成紫红色化合物 2、RNA的细胞分布的细胞分布--Brachet法法 碱性的甲基绿-哌洛宁混合染料处理细胞后， 由于DNA、RNA对染料具有的亲和力不同，而使这两种染料对两类核酸具有了选择性。
DNA被甲基绿染成绿色，RNA被哌洛宁染成红色 原位杂交 vFluorescent in situ Hybridization (FISH) Isotope-labeled probe or Biotin-labeled probe G. Ezymatic Amplification of DNA by PCR用原位杂交技术显示Z13基因在受精后1天的斑马鱼胚胎的体节、眼和松果体中的表达（箭号）张博惠赠)鸭瘟病毒感染鸡胚成纤维细胞24小时后，用3H－尿嘧啶核苷脉冲标记10分钟的电镜放射自显影图片曝光时间90天，核仁（Nu）和细胞核的其它部位均有RNA合成SG： 银颗粒； N： 细胞核； Nu： 核仁； C： 细胞质丁明孝，翟中和） 应用放射自显影技术研究生物大应用放射自显影技术研究生物大分子在细胞内的合成动态分子在细胞内的合成动态 Autoradiograph of LM and TEM F. Nucleic acid hybridizationvDetermining the location of specific DNA v fragments in a gel by a Southern blot Immunoblot: Western-Blot 表面等离子共振表面等离子共振 surface plasmon resonance,SPR 流式细胞技术流式细胞分选仪工作原理。
流式细胞分选仪工作原理 （A）当含有单个细胞的液滴通过激光束时，带有不同荧光的细胞所在的液滴被充上正电荷、负电荷或不被充电因带有不同表面标志的细胞所带的电荷的不同，当液滴通过高压偏转板时，液滴发生偏转，从而达到将细胞分选的目的B）显示流式细胞仪分析处在不同时相的Hela细胞的实验结果（（2N：G1期，2N—4N：S期，4N：G2/M期） 2024/9/663流式细胞术 Flow Cytometry 第三节第三节 细胞培养、细胞工程与组细胞培养、细胞工程与组学研究技术学研究技术 CHO细胞的培养 细胞的培养细胞的培养 动物细胞培养动物细胞培养 类型：类型：原代培养细胞（primary culture cell） 继代培养细胞（sub-culture cell） 细胞株细胞株（cell strain） 细胞系细胞系（cell line） 植物细胞植物细胞 原生质体培养 （体细胞培养）类型类型： 单倍体细胞培养（花药培养） 非细胞体系非细胞体系（cell-free system） 细胞工程细胞工程 细胞融合（细胞融合（cell fusion）与细胞杂交与细胞杂交（cell hybridization）技术技术单克隆抗体单克隆抗体（monoclone antibody）技术技术 图细胞拆合与显微操作技术细胞拆合与显微操作技术物理法结合显微操作技术化学法结合离心技术制备核体（karyoplast）和胞质体（cytoplast）。
对细胞生命活动的研究成为当今生命科学发展的对细胞生命活动的研究成为当今生命科学发展的瓶颈瓶颈 2024/9/668Monoclonal antibody technologyØ小鼠脾（B淋巴细胞）X骨髓瘤细胞 Ø细胞融合ØHAT培养基H：hypoxanthine 次黄嘌呤A:aminopterin 氨基蝶呤：阻断核酸合成主通道T:thymine 胸腺嘧啶（突变肿瘤细胞：无胸腺嘧啶核苷激酶(TK,合成DNA旁路酶)和次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT,合成RNA旁路酶） Knockout Mice The technique used to generate knockout mice was developed in the late 1980s by Marlo Capecchi at the University of Utah. 实验分三步分三步∶ ∶◆◆构建重构建重组体；体；◆◆转基因敲除；基因敲除；◆◆筛选2024/9/672 Knockout miceMario Capecchi (Late 1980s) (University of Utah)embryonic stem cells in inner cell mass as target cells1/104 cells undergo a process of homologous recombination. 2024/9/674Exogenous and Endogenous RNAiLiposome-mediated TransfectionRNA 干扰 CRISPRs（clusters of regularly interspersed short palindromic Repeats)基因编辑技术是细菌中抵抗外来病毒或质粒的DNA元件，两个重复片段之间的序列来自于先前入侵者的遗传物质，CRISPR元件能被转录并加工成单独的RNA,能识别入侵者中相同的DNA序列，并导致CRISPR相关的Cas9内切酶剪切，这种RNA指导的DNA敲除已经广泛用于动植物、人等基因敲除和编辑中。
CRISPR/CAS9系统原理CRISPR/CAS9系统：基因组定点切割系统u定点：sgRNA，碱基互补配对u切割：CAS9蛋白，核酸内切酶 u无模板随机修复（NHEJ）读码框移位蛋白无表达Knockoutu有模板重组修复(HDR)精确插入碱基KnockinCRISPR/CAS9系统原理uGeneknockoutuGeneknockin CRISPR/CAS9VS RNAi参考文献：参考文献： Science. 2014 Jan 3;343(6166):84-7. doi: 10.1126/science.1247005Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.u与RNAi相比，CRISPR/CAS9在基因功能学研究中具有独到优势： Model organisms of study on cell biology 大肠杆菌与操纵子学说的建立及现代分子生物学的发展；豌豆和果蝇与遗传学定律的发现；酵母和海胆与对细胞周期调控机制的认识；线虫与对细胞凋亡机制的揭示；小鼠与哺乳动物功能基因组学的研究等等 2024/9/681细胞的系统生物学系统地研究并理解细胞的结构与行为 — 细胞的所有大分子 — 在整个机体中研究细胞的效应Cytomics细胞组学 2024/9/682 2024/9/683数字细胞 (Digital cell) （E-cell)活细胞的计算机模型，反映细胞内分子的互作网络http://www.e-cell.org/software/e-cell-systemE-Cell 计算机模拟细胞。
E-Cell Project 国际合作研究项目，旨在发展有关 的理论，技术，软件等平台，以获 得完整的细胞模型E-Cell System 细胞模拟软件系统，用于诸如生物 细胞那样复杂系统的高通量大规模 分析 2024/9/684 2024/9/685基因芯片 Gene Microarray 2024/9/686Cell Models for Research of Life Sciences1.Cell is the basic unit of life2.Cell has all the features of living things3. Cell has whole inherit material 4. Cell has whole regulation on gene expression5. The developments of modern techniques in researches THANKS! 。