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1、细胞工程CellEngineeringChapter4、动物细胞培养工程动物细胞培养工程41概述概述42生产用动物细胞系生产用动物细胞系43培养液和培养环境培养液和培养环境44动物细胞培养工艺动物细胞培养工艺45动物细胞培养过程的放大与优化动物细胞培养过程的放大与优化46动物细胞代谢工程动物细胞代谢工程47动物细胞工程产品制备及质控动物细胞工程产品制备及质控48动物细胞工程表达产品的应用动物细胞工程表达产品的应用41概述概述411定义：定义：动物细胞培养工程：是指以工业化为目的，应用动动物细胞培养工程：是指以工业化为目的，应用动物细胞培养的基本原理，研究生物活细胞为主体的生物细胞培养的基本原理
2、，研究生物活细胞为主体的生物反应过程，解决动物细胞培养过程中带有共性和特物反应过程，解决动物细胞培养过程中带有共性和特性的工程技术问题的一门应用性科学技术。它依托三性的工程技术问题的一门应用性科学技术。它依托三部分技术，细胞培养技术（基础）、生化工程技术部分技术，细胞培养技术（基础）、生化工程技术（过渡）和生物反应器设计（生产技术）。它是大规（过渡）和生物反应器设计（生产技术）。它是大规模生产基因工程药物，单抗和疫苗等生物工程产品的模生产基因工程药物，单抗和疫苗等生物工程产品的关键技术。关键技术。412发展历程：发展历程：413动物细胞培养的特点与方法：动物细胞培养的特点与方法：A、动物细胞培
3、养的主要特点动物细胞培养的主要特点动物细胞对营养要求高动物细胞对营养要求高血清来源受限，质量不稳，研发无血清来源受限，质量不稳，研发无血清培养液；血清培养液；动物细胞对培养环境适应性差动物细胞对培养环境适应性差生长慢，时间长，生长用动物细胞生长慢，时间长，生长用动物细胞需驯化；需驯化；动物细胞培养对环境条件要求严格动物细胞培养对环境条件要求严格pH，混合气体（混合气体（O2、CO2、N2）；）；动物细胞培养过程易产生污染动物细胞培养过程易产生污染要求苛刻；要求苛刻；各种细胞长期培养易变异各种细胞长期培养易变异需监测其形态、生长、表达过程；需监测其形态、生长、表达过程；绝大多数的哺乳类动物细胞具
4、贴壁依赖性生绝大多数的哺乳类动物细胞具贴壁依赖性生长特征长特征需载体。需载体。附、植物细胞特性与细胞培养附、植物细胞特性与细胞培养与微生物比较，植物细胞大；与微生物比较，植物细胞大；悬浮培养时，植物细胞易结团，悬浮培养时，植物细胞易结团，2mm，浓度高、粘度大，浓度高、粘度大，分泌粘多糖（硅油降低粘度），产生泡沫，需消泡；分泌粘多糖（硅油降低粘度），产生泡沫，需消泡；细胞有壁，易受剪切力高的装置损伤；细胞有壁，易受剪切力高的装置损伤；与微生物细胞相比，生长慢，周期长，分批与微生物细胞相比，生长慢，周期长，分批2-3周，半连周，半连续与连续续与连续2-3周；周；与微生物细胞比较，需光、好气，与微
5、生物细胞比较，需光、好气，CO2/O2比要控制；比要控制；单细胞单细胞3-5天分裂，天分裂，1周小细胞团成愈伤组织，可转移至分周小细胞团成愈伤组织，可转移至分化培养基上；化培养基上；植物悬浮细胞生长与增殖可分为：植物悬浮细胞生长与增殖可分为：延迟、对数生长、直线生长、减缓、静止、衰亡期；延迟、对数生长、直线生长、减缓、静止、衰亡期；B、动物细胞培养工程的方法动物细胞培养工程的方法悬浮培养：螺旋桨或平桨搅拌通用发酵罐悬浮培养：螺旋桨或平桨搅拌通用发酵罐适应淋巴细胞、骨髓瘤细胞等适应淋巴细胞、骨髓瘤细胞等方方法法单层培养单层培养滚瓶法：间歇接触培养液和空气滚瓶法：间歇接触培养液和空气固定化培养固定
6、化培养微珠微珠微载体培养微载体培养比表面积大比表面积大中空纤维中空纤维414动物细胞培养工程技术现状与展望动物细胞培养工程技术现状与展望A、70%生物技术产品使用动物细胞生产；生物技术产品使用动物细胞生产；B、生产技术、工艺条件改变明显：生产技术、工艺条件改变明显：培养方式：从固着贴壁式变为悬浮式、从间歇式变培养方式：从固着贴壁式变为悬浮式、从间歇式变为悬浮连续式；为悬浮连续式；培养介质：用动物血清变为无血清无蛋白培养液；培养介质：用动物血清变为无血清无蛋白培养液；生物反应器控制：从黑箱式到计算机到人工智能。生物反应器控制：从黑箱式到计算机到人工智能。C、中国与美国动物细胞工程技术比较（见表）
7、中国与美国动物细胞工程技术比较（见表）中国，实验室规模中国，实验室规模流加工艺：产量高易放大、操作简单，流加工艺：产量高易放大、操作简单，美国，产业美国，产业如如Genentech、IDEC、化规模生产化规模生产MedImmune、Merk公司，公司，蛋白质公司蛋白质公司连续灌注工艺：适合不稳定产品、连续灌注工艺：适合不稳定产品、培养利用低、操作复杂、培养利用低、操作复杂、产品回收大，如：产品回收大，如：Genzyme、GeneticInstitute、Bayer公司公司中中国国美美国国批式培养批式培养（batch）2-100L中试规模中试规模产业化手段；产业化手段；12000L工业反应器工业
8、反应器流加培养流加培养（fedbatch）5-500L中试规模中试规模产业化手段；产业化手段；12000L工业反应器工业反应器灌注培养灌注培养（perfusion）5-30L中试规模中试规模产业化手段；产业化手段；12000L工业反应器工业反应器D、动物细胞培养工程技术是当今生物制药领域最重要动物细胞培养工程技术是当今生物制药领域最重要的关键技术之一；的关键技术之一；（10000L规模、规模、g/L级）级）E、大规模动物细胞培养生产中还存在问题需要解决：大规模动物细胞培养生产中还存在问题需要解决：去除培养环境中外源因子的污染去除培养环境中外源因子的污染在线检测与工艺控制，如在线检测与工艺控制，
9、如O2限定与溶解限定与溶解CO2尝试累尝试累积的控制新细胞生物反应器系统的开发利用积的控制新细胞生物反应器系统的开发利用42生产用动物细胞系生产用动物细胞系421生产用动物细胞发展：生产用动物细胞发展：生产用动物细胞生产用动物细胞是指按生产条件是指按生产条件选择、驯化，适于大量培养，用于生产制备生选择、驯化，适于大量培养，用于生产制备生物制品的动物细胞。它经历了原代细胞、二倍物制品的动物细胞。它经历了原代细胞、二倍体细胞、连续细胞系、融合细胞和重组细胞的体细胞、连续细胞系、融合细胞和重组细胞的历史演化。历史演化。422生产用动物细胞的来源生产用动物细胞的来源423常用生产用动物细胞的特性（参见
10、下表）常用生产用动物细胞的特性（参见下表）424生产用动物细胞库生产用动物细胞库生产用动物细胞库生产用动物细胞库:是指为保证生产用动是指为保证生产用动物细胞有稳定和高水平的质量和生物安全性，物细胞有稳定和高水平的质量和生物安全性，能够长期、稳定地生产出符合要求的高质量能够长期、稳定地生产出符合要求的高质量生物制品的储蓄系统。目前，已经制定有三生物制品的储蓄系统。目前，已经制定有三级细胞库系统相应保存管理措施（档案和技术级细胞库系统相应保存管理措施（档案和技术标准）。标准）。bu425生产用动物细胞代谢工程优化改造生产用动物细胞代谢工程优化改造A、原因：原因：与原核细胞、酵母细胞、昆虫细与原核细
11、胞、酵母细胞、昆虫细胞相比，动物细胞表达的外源蛋白质最接近胞相比，动物细胞表达的外源蛋白质最接近天然构想，是生物自身的生长代谢特性并非天然构想，是生物自身的生长代谢特性并非最佳，为提高培养细胞活性和单位细胞的产最佳，为提高培养细胞活性和单位细胞的产率，延长培养周期，必须采用代谢工程方法率，延长培养周期，必须采用代谢工程方法优化改选宿主细胞，对细胞自身的遗传特性优化改选宿主细胞，对细胞自身的遗传特性进行功利性修饰。进行功利性修饰。B、代谢工程（代谢工程（metabolicengineering）：）：是通过是通过DNA重组技术和分子生物学手重组技术和分子生物学手段改变酶系功能或物质转动功能，以改
12、段改变酶系功能或物质转动功能，以改进细胞某些方面的代谢活性，进行精确进细胞某些方面的代谢活性，进行精确目标的遗传操作。目标的遗传操作。C、具体优化改选措施：具体优化改选措施：构构建建在在无无血血清清、无无蛋蛋白白条条件件下下增增殖殖的的细细胞胞株株，实实现现无无血血清清无无蛋蛋白白培培养养；（血血清清是是基基本本添添加加物物，但但含含未未确确定定成成分分，如如有有毒毒的的多多胺胺氧氧化化酶酶，成成本本高高，来来源源少少，易易污染）污染）敲敲除除或或引引入入动动物物细细胞胞的的乳乳酸酸脱脱氢氢酶酶和和谷谷氨氨酰酰胺胺合合成成酶酶，减减少少代代谢谢产产物物乳乳酸酸和和氨氨的的产产生，以改变细胞能量
13、代谢途径；生，以改变细胞能量代谢途径；引引入入粘粘附附因因子子纤纤粘粘连连蛋蛋白白、层层粘粘连连蛋蛋白白、胶原或玻璃粘连蛋白，促进细胞贴壁性；胶原或玻璃粘连蛋白，促进细胞贴壁性；构建抗细胞凋亡工程细胞系，增强细胞对构建抗细胞凋亡工程细胞系，增强细胞对恶劣培养条件的抵抗力。（参见下图）恶劣培养条件的抵抗力。（参见下图）将细胞周期蛋白激酶（将细胞周期蛋白激酶（CDK）抑制蛋白抑制蛋白基因基因p21和和p27引入细胞，获得细胞周期引入细胞，获得细胞周期增殖控制的表型，通过调控细胞增殖周增殖控制的表型，通过调控细胞增殖周期达到调控细胞增殖目的；（参见下图）期达到调控细胞增殖目的；（参见下图）导入外源性
14、糖基转移酶基因，改变细胞导入外源性糖基转移酶基因，改变细胞的糖链合成能力，改善重组蛋白糖基化的糖链合成能力，改善重组蛋白糖基化修饰。修饰。43培养液培养液与培养与培养环境环境431动物细胞动物细胞培养条件培养条件432动物细胞培养液和添加剂动物细胞培养液和添加剂433无血清无蛋白培养无血清无蛋白培养优点：化学组分明确，批次间重复性优点：化学组分明确，批次间重复性好，易检测，适合特定过程；好，易检测，适合特定过程；缺点：比较贵，针对性强。缺点：比较贵，针对性强。434动物细胞培养用生物反应器动物细胞培养用生物反应器【习题习题】1、名词解释，并简要说明它们间关系：、名词解释，并简要说明它们间关系：单抗与疫苗单抗与疫苗 发酵罐与生物反应器发酵罐与生物反应器 CHOCHO、HNKHNK与与Vero Vero 生长因子与贴附因子生长因子与贴附因子 2、简述生产用动物细胞系的来源及特点？、简述生产用动物细胞系的来源及特点？3、从多个方面比较动植物细胞与微生物细胞培养特、从多个方面比较动植物细胞与微生物细胞培养特性、条件与方式？性、条件与方式？
