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1、离心技术离心技术1离离 心心 技技 术术 离离心心是是利利用用旋旋转转运运动动的的离离心心力力，以以及及物物质质的的沉沉降降系系数数或或浮浮力力密密度度的的差差别别进进行行分分离离、浓浓缩缩和和提提纯纯的的一一项项操操作作技技术。术。2主主 要要 内内 容容离心的基本原理离心的基本原理离心设备的分类离心设备的分类离心机的选择离心机的选择离心技术应用实例离心技术应用实例3一、离心的基本原理一、离心的基本原理利用转子高速旋转时所产生的强大离心力，加快利用转子高速旋转时所产生的强大离心力，加快颗粒的沉降速度，把样品中不同沉降系数的或浮颗粒的沉降速度，把样品中不同沉降系数的或浮力密度差的物质分离开。力
2、密度差的物质分离开。4离心力离心力离离心心力力（F）：当当离离心心机机转转子子以以一一定定的的角角速速度度（弧弧度度/秒秒）旋旋转转，颗粒的旋转半径为颗粒的旋转半径为r（厘米）时，颗粒所受的向外的力即离心力。（厘米）时，颗粒所受的向外的力即离心力。5: : 旋转角速度旋转角速度 r r：旋转体离旋转轴的距离：旋转体离旋转轴的距离相相对对离离心心力力（RCFRCF）：又又称称分分离离因因数数，是是衡衡量量离离心心程程度度的的参参数数，是是指指在在离离心心力力场场中中，作作用用于于颗颗粒粒的的离离心心力力相相当当于于地地球球引引力力的的倍倍数数，单单位位是是重重力力加加速速度度g g（980cm/
3、980cm/秒秒2 2）。RCF=RCF=2 2r/980 = 4r/980 = 42 2n n2 2r/3600*980 = 1.119*10r/3600*980 = 1.119*10-5-5n n2 2r r低低速速离离心心时时常常以以每每分分钟钟的的转转数数rpm（即即n）来来作作为为离离心心力力单单位；而高速离心则以位；而高速离心则以g表示。表示。相对离心力相对离心力n n：转子每分钟的转数（：转子每分钟的转数（rpmrpm）6Dole&CotziasDole&CotziasDole&CotziasDole&Cotzias制作了转子速制作了转子速制作了转子速制作了转子速度和半径相对度和
4、半径相对度和半径相对度和半径相对应的离心力列应的离心力列应的离心力列应的离心力列线图线图线图线图半径半径相对离心力相对离心力转数转数7沉降系数沉降系数 Sedimentation coefficient (S)离心沉降和重力沉降只是对沉降的作用力不同，离心沉降离心沉降和重力沉降只是对沉降的作用力不同，离心沉降的速度的速度v其中其中S即为沉降系数。即为沉降系数。S表示单位离心场中粒子的移动速度。表示单位离心场中粒子的移动速度。 r1:离心前粒子距离转轴的距离离心前粒子距离转轴的距离 r2:离心后粒子距离转轴的距离离心后粒子距离转轴的距离8 S S在实际应用时常在在实际应用时常在1010-13-1
5、3秒左右，故把秒左右，故把沉降系数沉降系数1010-13-13秒称为一个秒称为一个SvedbergSvedberg单位，简单位，简写写S S，量纲为秒，量纲为秒。9 样品颗粒的大小样品颗粒的大小 形状形状 密度密度 溶剂的粘度、密度溶剂的粘度、密度 离心加速度离心加速度沉降系数沉降系数蛋白质的相对分子量越大，沉降系数越大。蛋白质的相对分子量越大，沉降系数越大。蛋白质的相对分子量越大，沉降系数越大。蛋白质的相对分子量越大，沉降系数越大。1011沉降速度沉降速度 sedimentation velocity(1)(1)定义：定义： 指在强大的离心作用下，单位时间内物指在强大的离心作用下，单位时间内
6、物质运动的距离。质运动的距离。 r r： 球形粒子的半径球形粒子的半径 d d： 球形粒子的直径球形粒子的直径： 流体介质的粘度流体介质的粘度 p p：粒子的密度：粒子的密度m m：介质的密度：介质的密度12p p p p-m m m m=0 =0 =0 =0 即即即即p p p p=m m m m V=0 S=0 V=0 S=0 V=0 S=0 V=0 S=0 粒子平衡粒子平衡粒子平衡粒子平衡p p p p-m m m m0 0 0 0 即即即即p p p pm m m m V0 S0 V0 S0 V0 S0 V0 S0 粒子沉降粒子沉降粒子沉降粒子沉降p p p p-m m m m0 0
7、0 0 即即即即p p p pm m m m V0 S0 V0 S0 V0 S0 V0 Smpmpmpm事先配成较平缓的连续密度的梯度溶液事先配成较平缓的连续密度的梯度溶液事先配成较平缓的连续密度的梯度溶液事先配成较平缓的连续密度的梯度溶液 不能用角式转头、只能用水平式转头不能用角式转头、只能用水平式转头不能用角式转头、只能用水平式转头不能用角式转头、只能用水平式转头 不能用刹车不能用刹车不能用刹车不能用刹车可用来分离核酸、蛋白质及核糖体亚基等成分。可用来分离核酸、蛋白质及核糖体亚基等成分。可用来分离核酸、蛋白质及核糖体亚基等成分。可用来分离核酸、蛋白质及核糖体亚基等成分。46( (三三).)
8、.等密度离心法等密度离心法1 1原理原理 预先配制介质的密度梯度（包含了被分离样品中所有预先配制介质的密度梯度（包含了被分离样品中所有粒子的密度），样品铺在梯度液粒子的密度），样品铺在梯度液顶上或混合顶上或混合, ,离心开始后离心开始后, , 梯度液受离心力的作用逐渐形成底浓而管顶稀的密度梯度梯度液受离心力的作用逐渐形成底浓而管顶稀的密度梯度, ,与此同时原来分布均匀的样品粒子也发生重新分布与此同时原来分布均匀的样品粒子也发生重新分布。各种。各种颗粒移动到与它们各自密度恰好相等的位置上形成区带。颗粒移动到与它们各自密度恰好相等的位置上形成区带。特点：特点：特点：特点：（1 1 1 1）与样品粒
9、子的密度有关）与样品粒子的密度有关）与样品粒子的密度有关）与样品粒子的密度有关（2 2 2 2）与样品粒子的大小和其他参数无关）与样品粒子的大小和其他参数无关）与样品粒子的大小和其他参数无关）与样品粒子的大小和其他参数无关 （3 3 3 3）转速、温度不变）转速、温度不变）转速、温度不变）转速、温度不变, , , ,则延长离心时间也则延长离心时间也则延长离心时间也则延长离心时间也不改变这些粒子的成带位置。不改变这些粒子的成带位置。不改变这些粒子的成带位置。不改变这些粒子的成带位置。472 2. .注意点注意点：离心时间要长离心时间要长 可用角式转头或水平式转头可用角式转头或水平式转头粒子密度相
10、近或相等时不宜用粒子密度相近或相等时不宜用 密度梯度溶液中要包含所有粒子密度密度梯度溶液中要包含所有粒子密度 不能用刹车不能用刹车收集区带的方法收集区带的方法收集区带的方法收集区带的方法：用注射器和滴管由离心管上部吸出用注射器和滴管由离心管上部吸出用注射器和滴管由离心管上部吸出用注射器和滴管由离心管上部吸出; ; ; ;有针刺穿离心管底部滴出有针刺穿离心管底部滴出有针刺穿离心管底部滴出有针刺穿离心管底部滴出; ; ; ;用针刺穿离心管区带部份的管壁，把样品区带用针刺穿离心管区带部份的管壁，把样品区带用针刺穿离心管区带部份的管壁，把样品区带用针刺穿离心管区带部份的管壁，把样品区带抽出抽出抽出抽出
11、; ; ; ;用一根细管插入离心管底，泵入超过梯度介质最用一根细管插入离心管底，泵入超过梯度介质最用一根细管插入离心管底，泵入超过梯度介质最用一根细管插入离心管底，泵入超过梯度介质最大密度的取代液，将样品和梯度介质压出，用自大密度的取代液，将样品和梯度介质压出，用自大密度的取代液，将样品和梯度介质压出，用自大密度的取代液，将样品和梯度介质压出，用自动部分收集器收集动部分收集器收集动部分收集器收集动部分收集器收集. . . .48分离法分离法速度区带离心法速度区带离心法平衡密度梯度离心法平衡密度梯度离心法原理原理沉降与颗粒质量成正比，以物沉降与颗粒质量成正比，以物质沉降速度的不同进行分离质沉降速
12、度的不同进行分离沉降与颗粒的密度成正比，以物质沉降与颗粒的密度成正比，以物质的浮密度不同进行分离的浮密度不同进行分离介质介质密度小，如蔗糖、甘油、聚蔗密度小，如蔗糖、甘油、聚蔗糖，蔗糖浓度糖，蔗糖浓度10% 67%，密度，密度11.3286预制梯度，不连续预制梯度，不连续密度大，如密度大，如CsCl,Cs2SO4，CsCl浓度浓度01355，密度为，密度为11.9025，自成，自成连续梯度连续梯度离心力场离心力场强，离心速度高，使被分离物强，离心速度高，使被分离物质易沉降质易沉降稍强，速度相对低，使稍强，速度相对低，使CsCl形成梯形成梯度，建立沉降扩散平衡度，建立沉降扩散平衡离心过程离心过程
13、样品向离心管底沉降样品向离心管底沉降不论样品起始时在什么位置，离心不论样品起始时在什么位置，离心中样品停留于介质的等密度部位中样品停留于介质的等密度部位离心时间离心时间较短，一般为几小时到几十小较短，一般为几小时到几十小时时较长，十几小时到数天较长，十几小时到数天速度速度速度速度区带法区带法区带法区带法与等密度离心法的比较与等密度离心法的比较与等密度离心法的比较与等密度离心法的比较49密度梯度离心操作步骤密度梯度离心操作步骤1 1、梯度制备、梯度制备2 2、样品的装入和离心、样品的装入和离心3 3、取出梯度、取出梯度4 4、梯度的分析、梯度的分析50四四. . 密度梯度溶液的制备密度梯度溶液的
14、制备( ( ( (一一一一).).).).梯度材料的选择原则梯度材料的选择原则梯度材料的选择原则梯度材料的选择原则: : : :1 1 1 1、与被分离的生物材料、与被分离的生物材料、与被分离的生物材料、与被分离的生物材料不发生反应不发生反应不发生反应不发生反应。2 2 2 2、可达到要求的密度范围可达到要求的密度范围可达到要求的密度范围可达到要求的密度范围, , , ,且在所要求的密范围内且在所要求的密范围内且在所要求的密范围内且在所要求的密范围内, , , ,粘度低粘度低粘度低粘度低, , , ,渗渗渗渗透压低透压低透压低透压低, , , ,离子强度和离子强度和离子强度和离子强度和 pHp
15、HpHpH变化较小。变化较小。变化较小。变化较小。3 3 3 3、不会对离心设备发生、不会对离心设备发生、不会对离心设备发生、不会对离心设备发生腐蚀腐蚀腐蚀腐蚀作用。作用。作用。作用。4 4 4 4、容易纯化容易纯化容易纯化容易纯化, , , ,价格便宜或容易回收。价格便宜或容易回收。价格便宜或容易回收。价格便宜或容易回收。5 5 5 5、浓度便于测定浓度便于测定浓度便于测定浓度便于测定, , , ,如具有折光率。如具有折光率。如具有折光率。如具有折光率。6 6 6 6、对于分析超速离心工作来说、对于分析超速离心工作来说、对于分析超速离心工作来说、对于分析超速离心工作来说, , , ,它的物理
16、性质它的物理性质它的物理性质它的物理性质, , , ,热力学性质热力学性质热力学性质热力学性质应该是应该是应该是应该是已知已知已知已知的。的。的。的。5152常用的梯度材料：常用的梯度材料：糖类糖类: : 蔗糖、甘油、聚蔗糖蔗糖、甘油、聚蔗糖(Ficoll)(Ficoll)、右糖右糖酐、糖原酐、糖原 无机无机盐类盐类:CsCl(:CsCl(氯化铯氯化铯) )、RbCl(RbCl(氯化铷氯化铷) )、NaClNaCl、KBrKBr等等 有机有机碘化物碘化物: :三碘苯甲酰匍萄糖胺等三碘苯甲酰匍萄糖胺等 硅硅溶胶溶胶: : 如如PercollPercoll。蛋白质蛋白质: :如牛血清白蛋白如牛血清
17、白蛋白重水重水 非非水溶性有机物水溶性有机物: :如氟代碳等如氟代碳等 53 ( (二二).).梯度材料的应用范围梯度材料的应用范围 1.1.蔗糖蔗糖: : 水溶性大水溶性大 性质稳定性质稳定 渗透压较高渗透压较高 最高密度可达最高密度可达1.33g/ml,1.33g/ml, 价格低价格低 容易制备容易制备, , 常用于细胞器、病毒、常用于细胞器、病毒、RNARNA分离的梯度材料分离的梯度材料 有较大的渗透压有较大的渗透压, ,不宜用于细胞的分离不宜用于细胞的分离。 54 2. 2.聚蔗糖聚蔗糖: : 商品名商品名Ficoll, Ficoll, 渗透压低渗透压低 粘度却特别高粘度却特别高, ,
18、为此常与泛影葡胺混合使用为此常与泛影葡胺混合使用 以降低粘度以降低粘度 用于分离各种细胞用于分离各种细胞包括血细胞、成纤维细包括血细胞、成纤维细 胞、肿瘤细胞、鼠肝细胞胞、肿瘤细胞、鼠肝细胞 55 3. 3.氯化铯氯化铯: : 离子性介质离子性介质 水溶性大水溶性大 最高密度可达最高密度可达1.91g/ml1.91g/ml 重金属盐类重金属盐类, ,在离心时形成的梯度有较在离心时形成的梯度有较 好的分辨率好的分辨率 被广泛地用于被广泛地用于DNADNA、质粒、病毒和脂蛋、质粒、病毒和脂蛋 白的分离白的分离 价格较贵价格较贵 564 4. .卤化盐类卤化盐类: :KBrKBr和和NaClNaCl
19、可用于脂蛋白分离可用于脂蛋白分离KIKI和和NaINaI可用于可用于RNARNA分离分离, ,其分辨率高于铯盐其分辨率高于铯盐 NaINaI梯度可分离天然或变性的梯度可分离天然或变性的DNADNA。 575.Percoll5.Percoll: :SiOSiO2 2胶体外面包了一层聚乙烯吡咯酮胶体外面包了一层聚乙烯吡咯酮渗透压低渗透压低对生物材料的影响小对生物材料的影响小颗粒稳定颗粒稳定在冷却和冻融情况下还是稳定的在冷却和冻融情况下还是稳定的 粘度高粘度高在酸性在酸性pHpH和高离子强度下不稳定和高离子强度下不稳定用于细胞、细胞器和病毒的分离用于细胞、细胞器和病毒的分离 离心机使用的注意事项离心
20、机使用的注意事项使用各种离心机时，必须事先在天平上精密地平衡离使用各种离心机时，必须事先在天平上精密地平衡离使用各种离心机时，必须事先在天平上精密地平衡离使用各种离心机时，必须事先在天平上精密地平衡离心管和其内容物。心管和其内容物。心管和其内容物。心管和其内容物。离心管装液不可超过管容量的离心管装液不可超过管容量的离心管装液不可超过管容量的离心管装液不可超过管容量的2/32/32/32/3，尤其是角转子。，尤其是角转子。，尤其是角转子。，尤其是角转子。在低温下离心时，转头需预冷。在低温下离心时，转头需预冷。在低温下离心时，转头需预冷。在低温下离心时，转头需预冷。离心过程中不得随意打开离心机盖。
21、离心过程中不得随意打开离心机盖。离心过程中不得随意打开离心机盖。离心过程中不得随意打开离心机盖。每个转头各有其最高允许转速和使用累积限时，使用转每个转头各有其最高允许转速和使用累积限时，使用转每个转头各有其最高允许转速和使用累积限时，使用转每个转头各有其最高允许转速和使用累积限时，使用转头时要查阅说明书，不得过速使用。头时要查阅说明书，不得过速使用。头时要查阅说明书，不得过速使用。头时要查阅说明书，不得过速使用。58普通制备离心机的选择普通制备离心机的选择（1 1） 过滤式离心机过滤式离心机（2 2） 沉降式离心机沉降式离心机（3 3） 分离式离心机分离式离心机五、离心机的选择五、离心机的选择
22、59超速离心机的选择超速离心机的选择估算离心力和离心时间估算离心力和离心时间超离心方法的选择超离心方法的选择转子、离心管的选择转子、离心管的选择梯度、介质的选择梯度、介质的选择60超速离心法超速离心法6162分析性超速离心机分析性超速离心机椭圆形的转子椭圆形的转子一套真空系统一套真空系统一套光学系统一套光学系统分析性超速离心主要是为了研究生物大分子的沉降分析性超速离心主要是为了研究生物大分子的沉降分析性超速离心主要是为了研究生物大分子的沉降分析性超速离心主要是为了研究生物大分子的沉降特性和结构，而不是专门收集某一特定组份。因此特性和结构，而不是专门收集某一特定组份。因此特性和结构，而不是专门收
23、集某一特定组份。因此特性和结构，而不是专门收集某一特定组份。因此它使用了特殊的转子和检测手段，以便连续监视物它使用了特殊的转子和检测手段，以便连续监视物它使用了特殊的转子和检测手段，以便连续监视物它使用了特殊的转子和检测手段，以便连续监视物质在一个离心场中的沉降过程。质在一个离心场中的沉降过程。质在一个离心场中的沉降过程。质在一个离心场中的沉降过程。63分析室：容量为分析室：容量为分析室：容量为分析室：容量为1 1 1 1毫升毫升毫升毫升, , , ,呈扇形排列在转子中。其有上下二个呈扇形排列在转子中。其有上下二个呈扇形排列在转子中。其有上下二个呈扇形排列在转子中。其有上下二个平面的石英窗平面
24、的石英窗平面的石英窗平面的石英窗, , , ,离心机中装有的光学系统可保证在整个离心离心机中装有的光学系统可保证在整个离心离心机中装有的光学系统可保证在整个离心离心机中装有的光学系统可保证在整个离心期间都能观察小室中正在沉降的物质期间都能观察小室中正在沉降的物质期间都能观察小室中正在沉降的物质期间都能观察小室中正在沉降的物质, , , , 通过对紫外光的吸收通过对紫外光的吸收通过对紫外光的吸收通过对紫外光的吸收或折射率的不同对沉降物进行监视。或折射率的不同对沉降物进行监视。或折射率的不同对沉降物进行监视。或折射率的不同对沉降物进行监视。641.1.1.1.测定生物大分子的相对分子重量测定生物大
25、分子的相对分子重量测定生物大分子的相对分子重量测定生物大分子的相对分子重量3.3.3.3.分析生物大分子的构象变化分析生物大分子的构象变化分析生物大分子的构象变化分析生物大分子的构象变化 2. 2. 2. 2.生物大分子的纯度估计生物大分子的纯度估计生物大分子的纯度估计生物大分子的纯度估计应用范围应用范围65内容回顾内容回顾离心的基本原理离心的基本原理离心的基本原理离心的基本原理离心力离心力离心力离心力相对离心力相对离心力相对离心力相对离心力沉降系数沉降系数沉降系数沉降系数沉降速度沉降速度沉降速度沉降速度沉降时间沉降时间沉降时间沉降时间离心设备的分类离心设备的分类离心设备的分类离心设备的分类转
26、速：低速、中速、高速转速：低速、中速、高速转速：低速、中速、高速转速：低速、中速、高速转子：角转子、水平转子、垂直转子等转子：角转子、水平转子、垂直转子等转子：角转子、水平转子、垂直转子等转子：角转子、水平转子、垂直转子等用途：实验室用、工厂用用途：实验室用、工厂用用途：实验室用、工厂用用途：实验室用、工厂用离心形式：离心过滤、离心沉降、离心分离离心形式：离心过滤、离心沉降、离心分离离心形式：离心过滤、离心沉降、离心分离离心形式：离心过滤、离心沉降、离心分离66离心分离法离心分离法离心分离法离心分离法差速离心法差速离心法差速离心法差速离心法速率区带离心法速率区带离心法速率区带离心法速率区带离心
27、法 等密度离心法等密度离心法等密度离心法等密度离心法密度梯度溶液的制备密度梯度溶液的制备密度梯度溶液的制备密度梯度溶液的制备梯度溶液的选择原则梯度溶液的选择原则梯度溶液的选择原则梯度溶液的选择原则1 1 1 1、与被分离的生物材料不发生反应。、与被分离的生物材料不发生反应。、与被分离的生物材料不发生反应。、与被分离的生物材料不发生反应。2 2 2 2、可达到要求的密度范围；、可达到要求的密度范围；、可达到要求的密度范围；、可达到要求的密度范围；3 3 3 3、不会对离心设备发生腐蚀作用。、不会对离心设备发生腐蚀作用。、不会对离心设备发生腐蚀作用。、不会对离心设备发生腐蚀作用。4 4 4 4、容
28、易纯化、容易纯化、容易纯化、容易纯化, , , ,价格便宜或容易回收。价格便宜或容易回收。价格便宜或容易回收。价格便宜或容易回收。5 5 5 5、浓度便于测定、浓度便于测定、浓度便于测定、浓度便于测定, , , ,如具有折光率。如具有折光率。如具有折光率。如具有折光率。6 6 6 6、物理性质、物理性质、物理性质、物理性质, , , ,热力学性质应该是已知的。热力学性质应该是已知的。热力学性质应该是已知的。热力学性质应该是已知的。67常用的梯度材料常用的梯度材料常用的梯度材料常用的梯度材料蔗糖蔗糖蔗糖蔗糖聚蔗糖聚蔗糖聚蔗糖聚蔗糖氯化铯氯化铯氯化铯氯化铯硅溶胶硅溶胶硅溶胶硅溶胶离心机使用的注意事
29、项离心机使用的注意事项离心机使用的注意事项离心机使用的注意事项平衡离心管和其内容物。平衡离心管和其内容物。平衡离心管和其内容物。平衡离心管和其内容物。离心管装液不可超过管容量的离心管装液不可超过管容量的离心管装液不可超过管容量的离心管装液不可超过管容量的2/32/32/32/3，尤其是角转子。，尤其是角转子。，尤其是角转子。，尤其是角转子。在温下离心时，转头需预冷。在温下离心时，转头需预冷。在温下离心时，转头需预冷。在温下离心时，转头需预冷。离心过程中不得随意离开离心机盖。离心过程中不得随意离开离心机盖。离心过程中不得随意离开离心机盖。离心过程中不得随意离开离心机盖。转头不得过速使用。转头不得过速使用。转头不得过速使用。转头不得过速使用。68谢谢！69
