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1、1.2 1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序补：原核细胞的基因结构补：原核细胞的基因结构非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子终止子终止子 RNA RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。并与其结合。 转录开始后，转录开始后，RNARNA聚合酶沿聚合酶沿DNADNA分子移动，并分子移动，并以以DNADNA分子的一条链为模板合成分子的一条链为模板合成RNARNA。 转录完毕后，转录完毕后，RNARNA链释放出来，紧接着链释放出
2、来，紧接着RNARNA聚聚合酶也从合酶也从DNADNA模板链上脱落下来。模板链上脱落下来。不能转录为信使不能转录为信使RNARNA，不能，不能 编码蛋白质。编码蛋白质。：能转录相应的信使：能转录相应的信使RNARNA，能，能 编码蛋白质编码蛋白质 编码区编码区非编码区非编码区原核原核细胞细胞的的 基因基因结构结构有调控遗传信息表达的核有调控遗传信息表达的核 苷酸序列，在该序列中，苷酸序列，在该序列中， 最重要的是位于编码区上最重要的是位于编码区上 游的游的RNARNA聚合酶结合位点。聚合酶结合位点。启动子启动子补：真核细胞的基因结构补：真核细胞的基因结构编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编
3、码区与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点内含子内含子 外显子外显子 能够编码蛋白质的序列叫做外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子 不能够编码蛋白质的序列叫做内不能够编码蛋白质的序列叫做内含子含子启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 内含子：内含子： 外显子：外显子： 真核真核细胞细胞的的 基因基因结构结构编码区编码区非编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用的核苷酸序列，：有调控作用的核苷酸序列， 包括位于编码区上游的包括位于编码区上游的RNARNA 聚合酶结合位
4、点。聚合酶结合位点。非编码序列：非编码序列：包括非编码区和内含子包括非编码区和内含子原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不同点不同点编码区是编码区是_的的编码区是间隔的、编码区是间隔的、_的的相同点相同点都由能够编码蛋白质的都由能够编码蛋白质的_和具和具有调控作用的有调控作用的_区组成的区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞与真核细胞的基因结构比较思思考考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？细胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续连续不连续不连续编码区编码区非编码非编码基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤基因工程的基本操作程序主要
5、包括四个步骤1 1、目的基因的获取、目的基因的获取2 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞4 4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定一、目的基因的获取一、目的基因的获取1 1、目的基因：主要是指、目的基因：主要是指 编码蛋白质的基因编码蛋白质的基因也可以是：也可以是： 3 3、获取目的基因的常用方法有哪些、获取目的基因的常用方法有哪些? ?（1 1）从基因文库中获取）从基因文库中获取（2 2）利用）利用PCRPCR技术扩增技术扩增（3 3）人工合成）人工合成请阅读请阅读P9P9第一和二两段第一和二两段一些具有调控作用的因子一些
6、具有调控作用的因子（1）从自然界中已有物种中分离出来从自然界中已有物种中分离出来 （2）用人工方法合成）用人工方法合成2、途径、途径(一)从基因文库中获取目的基因 将含有某种生物不同基因的许将含有某种生物不同基因的许多多DNA片断，导入到受体菌的群体中，片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库基因，称为基因文库基因文库基因文库 基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库（如（如:cDNA文库）文库）1.1.基因文库基因文库基因组基因组文库与文库与部分基部分基因文库因文库的关系的关系怎样从基因文库中得怎样从基因文库中得到我们
7、所需的目的基到我们所需的目的基因呢因呢? ?怎样从基因文库中找到我们所需要的目的基因怎样从基因文库中找到我们所需要的目的基因 根据目的基因的有关信息，例如，根据目的基因的有关信息，例如，根据基因的核苷酸序列、基因的功能、根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录基因在染色体上的位置、基因的转录产物产物mRNA，以及基因的表达产物蛋，以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。白质等特性来获取目的基因。基因文库的建立方法基因文库的建立方法提取某种生物的全部提取某种生物的全部DNADNA用适当的限制酶酶切用适当的限制酶酶切一定大小的一定大小的DNADNA片段片段将将DNA
8、DNA片段与运载体连接片段与运载体连接导入受体菌中储存导入受体菌中储存基因组文库基因组文库方法一：直接分离法方法一：直接分离法( (鸟枪法鸟枪法) )某种生物的单链某种生物的单链mRNAmRNA单链互补单链互补DNADNA双链双链cDNAcDNA片段片段导入受体菌中储存导入受体菌中储存与载体连接与载体连接cDNAcDNA文库文库反（逆）转录酶反（逆）转录酶DNADNA聚合酶聚合酶反转录法：反转录法：cDNAcDNA的合成流程图解的合成流程图解基因文库的构建方法之二基因文库的构建方法之二CDNA合成过程 第一步，反转录酶以第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与为模板合成一条与RNA互补互补的的
9、DNA单链，形成单链，形成RNA-DNA杂交分子。杂交分子。第二步，核酸酶第二步，核酸酶H使使RNA-DNA杂交分子中的杂交分子中的RNA链降链降解，使之变成单链的解，使之变成单链的DNA。第三步，以单链第三步，以单链DNA为模板，在为模板，在DNA聚合酶的作用下聚合酶的作用下合成另一条互补的合成另一条互补的DNA链，形成双链链，形成双链DNA分子。分子。 基因组文库和基因组文库和cDNA文库的主要区别文库的主要区别 文库类型文库类型文库类型文库类型 cDNA cDNA文库文库文库文库 基因组文库基因组文库基因组文库基因组文库 文库大小文库大小文库大小文库大小基因中启动子（具有启基因中启动子（
10、具有启基因中启动子（具有启基因中启动子（具有启动作用的动作用的动作用的动作用的DNADNA片段）片段）片段）片段）基因中内含子基因中内含子基因中内含子基因中内含子( (位于编位于编位于编位于编码蛋白质序列的非编码码蛋白质序列的非编码码蛋白质序列的非编码码蛋白质序列的非编码DNADNA片段）片段）片段）片段） 基因多少基因多少基因多少基因多少 物种间的基因交流物种间的基因交流物种间的基因交流物种间的基因交流小小大大无无有有无无有有某种生物的部分基因某种生物的部分基因 某种生物的全部基因某种生物的全部基因可以可以部分基因可以部分基因可以( (二二) )利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目
11、的基因 概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术的核酸合成技术 条件：条件：_ _ _ _ _ _ _. _ _ _.前提条件：前提条件：原理：原理：_方式：方式：以以_方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩增循为扩增循 环的次数）环的次数）结果：结果：选修选修3 P3 P1010聚合酶链式反应聚合酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段DNADNA复制复制DNA的两条链为模板、温度控制的两条链为模板、温度控制四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸一对引物一对引物DNADNA聚合酶聚合酶指数指数2 2n n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩
12、增使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增( (二二) )利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因一段已知目的基因的核苷酸序列一段已知目的基因的核苷酸序列过程：过程：a a、DNADNA变性变性（90-9590-95）：双链）：双链DNADNA模板模板 在热作用下，在热作用下，_断裂，形成断裂，形成_b b、退火、退火（复性复性55-6055-60）：系统温度降低，引）：系统温度降低，引 物与物与DNADNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部_。 c c、延伸、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，从酶的作用下，从 引物的引物的55端端33端端延伸，合成与
13、模板互补延伸，合成与模板互补 的的_。 氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链PCR技术扩增与技术扩增与DNA复制的比较复制的比较PCRPCR技术技术技术技术DNADNA复制复制复制复制相相相相同同同同点点点点原理原理原理原理原料原料原料原料条件条件条件条件不不不不同同同同点点点点解旋解旋解旋解旋方式方式方式方式场所场所场所场所酶酶酶酶结果结果结果结果碱基互补配对碱基互补配对四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸模板、原料、能量模板、原料、能量、酶、酶DNA在高温下变性解旋在高温下变性解旋解旋酶催化解旋酶催化体外复制体外复制细胞核内细胞核内热稳定的热稳定的DNA聚合酶聚合酶细胞内的细胞内的
14、DNA聚合酶聚合酶大量的大量的DNA片段片段形成整个形成整个DNA分子分子根据已知的氨基酸序列合成根据已知的氨基酸序列合成DNADNA法法 ： 根据已知蛋白质根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测的氨基酸序列，推测出相应的信使出相应的信使RNARNA序序列，然后按照碱基互列，然后按照碱基互补配对原则，推测出补配对原则，推测出它的结构基因的核苷它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。原料合成目的基因。蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测推测推测目的
15、基因目的基因化学合成化学合成（三）用化学方法直接人工合成（三）用化学方法直接人工合成1.1.用一定的用一定的_切割切割 质粒，使其出现一个切质粒，使其出现一个切 口，露出口，露出_。2.2.用用_切断目切断目 的基因，使其产生的基因，使其产生_ _ _。( (二二) )基因表达载体的构建基因表达载体的构建 核心核心3.3.将切下的目的基因片段插入质粒的将切下的目的基因片段插入质粒的_ _处，处， 再加入适量再加入适量_，形成了一个重组，形成了一个重组 DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端限制酶限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶相同相同
16、质粒质粒DNADNA分子分子限制酶处理限制酶处理一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒） 核心核心( (二二) )基因表达载体的构建基因表达载体的构建4.4.过程过程: :5.5.基因表达载体的组成：基因表达载体的组成：目的基因目的基因+ +启动子启动子+ +终止子终止子+ +标记基因标记基因它们有什么作用？它们有什么作用？( (三三) )将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞转化转化 方法方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞
17、动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法感受态细胞感受态细胞目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受体细胞内维持受体细胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达1 1、将目的基因导入植物细胞的方法：农杆菌转化法、将目的基因导入植物细胞的方法：农杆菌转化法（1 1）农杆菌介绍）农杆菌介绍（2 2）原理及适用范围）原理及适用范围( (三三) )将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞2 2、将目的基因导入动物细胞、将目的基因导入动物细胞（1）方法：显微注射法）方法：显
18、微注射法（2）程序：）程序：( (三三) )将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞n n3 3、将目的基因导入微生物细胞、将目的基因导入微生物细胞n n（1）思考：为什么选用微生物作为受体细胞？）思考：为什么选用微生物作为受体细胞？n n（2）方法：）方法：将目的基因导入受体细胞（动物细胞）显微注射法显微注射法( (四四) )目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定检查是否成功检查是否成功检测检测鉴定鉴定检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA检测目的基因是否翻译成
19、蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法方法方法方法方法方法DNADNA分子杂交分子杂交分子杂交分子杂交（注意与上不同之处）（注意与上不同之处）抗原抗体杂交抗原抗体杂交DNADNA分子杂交示意图分子杂交示意图 采用一定的技术手段，将两种生物的采用一定的技术手段，将两种生物的DNADNA分分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍
20、然是两条游离的单链。列的部位，仍然是两条游离的单链。 P P1515思考与探究思考与探究1）有关基因工程的叙述中，错误的是）有关基因工程的叙述中，错误的是（ ） A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、 限制性内切酶用于目的基因的获得限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、 人工合成目的基因不用限制性内切酶人工合成目的基因不用限制性内切酶A A练习练习2）有关基因工程的叙述正确的是）有关基因工程的叙述正确的是 （ ） A、限制酶只在获得目的基因时才用、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体、质粒都可作为运载体 D、蛋蛋白白质质的的结结构构可可为为合合成成目目的的基基因因提提供供资料资料D D练习练习3）基基因因工工程程是是在在DNA分分子子水水平平上上进进行行设设计计施施工工的的。在在基基因因操操作作的的基基本本步步骤骤中中，不不进进行行碱基互补配对的步骤是碱基互补配对的步骤是 （ ） A、人工合成目的基因、人工合成目的基因 B、目的基因与运载体结合、目的基因与运载体结合 C、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因的检测和表达、目的基因的检测和表达C C练习练习
