分子生物学研究方法上

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1、 第五章第五章 分子生物学研究方法（上）分子生物学研究方法（上）精选ppt 本章主要内容本章主要内容l 常常见见的的DNADNA操作技操作技术术l 基因克隆技基因克隆技术简术简介介l 蛋白蛋白质组质组学及研究技学及研究技术术精选ppt引言引言重重重重组组组组DNADNADNADNA技技技技术发术发术发术发展史上的重大事件展史上的重大事件展史上的重大事件展史上的重大事件(1)(1) 40404040年代，年代，年代，年代，解决了解决了解决了解决了遗传遗传遗传遗传的物的物的物的物质质质质基基基基础问题础问题础问题础问题。确定了确定了确定了确定了遗遗遗遗传传传传信息的携信息的携信息的携信息的携带带带

2、带者，即基因的分子者，即基因的分子者，即基因的分子者，即基因的分子载载载载体是体是体是体是DNADNADNADNA而不是蛋白而不是蛋白而不是蛋白而不是蛋白质质质质。(2)(2)50505050年代，年代，年代，年代，解决了基因的自我复制和世代交替解决了基因的自我复制和世代交替解决了基因的自我复制和世代交替解决了基因的自我复制和世代交替问题问题问题问题。建立了建立了建立了建立了DNADNADNADNA分子的双螺旋分子的双螺旋分子的双螺旋分子的双螺旋结结结结构模型，提出了半保留复制机构模型，提出了半保留复制机构模型，提出了半保留复制机构模型，提出了半保留复制机制。制。制。制。(3)(3)50505

3、050年代末至年代末至年代末至年代末至60606060年代，相年代，相年代，相年代，相继继继继提出了提出了提出了提出了“中心法中心法中心法中心法则则则则”和和和和操操操操纵纵纵纵子学子学子学子学说说说说, , , , 成功地破成功地破成功地破成功地破译译译译了了了了遗传遗传遗传遗传密密密密码码码码，充分，充分，充分，充分认识认识认识认识了了了了遗传遗传遗传遗传信息的流信息的流信息的流信息的流动动动动和表达途径。和表达途径。和表达途径。和表达途径。精选ppt从此，大从此，大肠肠杆菌就成了分子克隆中最常用的杆菌就成了分子克隆中最常用的转转化受体。化受体。1970年年Mandel和和Higa发现发现

4、，大，大肠肠杆菌杆菌细细胞胞经经适量适量氯氯化化钙处钙处理后，能有效地吸收理后，能有效地吸收噬菌体噬菌体DNA。1972年，年，Cohen等人又等人又报报道，道，经氯经氯化化钙处钙处理的大理的大肠肠杆菌杆菌细细胞同胞同样样能能够摄够摄取取质质粒粒DNA。精选ppt 基因工程的主要内容或步基因工程的主要内容或步基因工程的主要内容或步基因工程的主要内容或步骤骤骤骤 “ “ “ “分分分分-切切切切-连连连连-转转转转-筛筛筛筛”（1 1 1 1）从基因）从基因）从基因）从基因组组组组中中中中分离分离分离分离、或、或、或、或PCRPCRPCRPCR扩扩扩扩增、或人工合成增、或人工合成增、或人工合成增

5、、或人工合成带带带带有目的有目的有目的有目的基因的基因的基因的基因的DNADNADNADNA片段。片段。片段。片段。（2 2 2 2）用适当的限制）用适当的限制）用适当的限制）用适当的限制酶酶酶酶分分分分别别别别切割切割切割切割适当的适当的适当的适当的载载载载体分子和体分子和体分子和体分子和含有目的含有目的含有目的含有目的基因的基因的基因的基因的DNADNADNADNA分子。分子。分子。分子。（3 3 3 3）将目的基因）将目的基因）将目的基因）将目的基因连连连连接接接接到到到到载载载载体分子上，形成重体分子上，形成重体分子上，形成重体分子上，形成重组组组组DNADNADNADNA分子。分子。

6、分子。分子。（4 4 4 4）将重）将重）将重）将重组组组组DNADNADNADNA分子分子分子分子转转转转移移移移到适当的受体到适当的受体到适当的受体到适当的受体细细细细胞中并增殖。胞中并增殖。胞中并增殖。胞中并增殖。（5 5 5 5）筛选筛选筛选筛选重重重重组转组转组转组转化子，化子，化子，化子，扩扩扩扩增目的基因。再将目的基因克隆增目的基因。再将目的基因克隆增目的基因。再将目的基因克隆增目的基因。再将目的基因克隆到表达到表达到表达到表达载载载载体上，体上，体上，体上，导导导导入受体入受体入受体入受体细细细细胞，使表达目的胞，使表达目的胞，使表达目的胞，使表达目的产产产产物。物。物。物。精

7、选ppt基因工程技基因工程技术术区区别别于其它技于其它技术术的的根本特征根本特征：具：具有跨越天然物种屏障、把来自任何生物的基因有跨越天然物种屏障、把来自任何生物的基因置于毫无置于毫无亲缘亲缘关系的新的寄主生物关系的新的寄主生物细细胞之中的胞之中的能力。能力。19621962年年Arber Arber 发现发现限制性核酸内切限制性核酸内切酶酶，19671967年年GellertGellert发现发现了了 DNA DNA 连连接接酶酶。精选ppt重重组组DNADNA实验实验中常中常见见的主要工具的主要工具酶酶 酶酶 类类 功功能能限制性核酸内切限制性核酸内切酶酶识别识别并在特定位点切开并在特定位

8、点切开DNADNADNADNA连连接接酶酶通通过过磷酸二磷酸二酯键酯键把两个或多个把两个或多个DNADNA片段片段连连接成一个接成一个DNADNA分子分子DNADNA聚合聚合酶酶I I（大（大肠肠杆菌）杆菌）按按55到到33方向加入新的核苷酸，方向加入新的核苷酸，补补平平DNADNA双双链链中的缺口中的缺口反反转录转录酶酶按照按照RNARNA分子中的碱基序列，根据碱基互分子中的碱基序列，根据碱基互补补原原则则合成合成DNADNA链链多核苷酸激多核苷酸激酶酶把磷酸基把磷酸基团团加到多聚核苷酸加到多聚核苷酸链链的的5-OH5-OH末端（末端（进进行末端行末端标记标记实验实验或用来或用来进进行行DN

9、ADNA的的连连接接末端末端转转移移酶酶在双在双链链核酸的核酸的33末端加上多聚末端加上多聚单单核苷酸核苷酸DNADNA外切外切酶酶IIIIII从从DNADNA链链的的33末端逐个切除末端逐个切除单单核苷酸核苷酸噬菌体噬菌体DNADNA外切外切酶酶从从DNADNA链链的的55末端逐个切除末端逐个切除单单核苷酸核苷酸碱性磷酸碱性磷酸酯酯酶酶切除位于切除位于DNADNA链链55或或33末端的磷酸基末端的磷酸基团团 科学家已几乎能随心所欲地把任何科学家已几乎能随心所欲地把任何DNADNA分子切割成一系列不分子切割成一系列不连续连续的片段，的片段，再利用凝胶再利用凝胶电电泳技泳技术术将将这这些片段按照

10、分子量大小逐一分开，以供下一步研究。些片段按照分子量大小逐一分开，以供下一步研究。 精选ppt1 DNA1 DNA操作技操作技术术 DNADNA分子的切割与分子的切割与连连接接 核酸分子核酸分子杂杂交交 凝胶凝胶电电泳泳 细细胞胞转转化化 核酸序列分析核酸序列分析 基因的人工合成基因的人工合成 基因的定点突基因的定点突变变 PCRPCR扩扩增增 基因敲除基因敲除精选ppt1.1 1.1 核酸的凝胶核酸的凝胶电电泳泳原理：原理：种种类类：琼琼脂糖脂糖（agaroseagarose）凝胶凝胶电电泳；泳； 聚丙聚丙烯酰烯酰胺胺（polyacrylamidepolyacrylamide）凝胶凝胶电电泳

11、泳用途：用途：鉴鉴定重定重组组DNADNA分子分子 蛋白蛋白质质与核酸相互作用与核酸相互作用 DNA DNA分型分型 DNA DNA核苷酸序列分析核苷酸序列分析 限制限制酶酶酶酶切片段分析切片段分析 限制限制酶酶酶酶切作切作图图精选ppt 琼琼脂糖凝胶脂糖凝胶电电泳泳琼琼脂糖凝胶分辨脂糖凝胶分辨DNADNA片段的范片段的范围为围为0.2 - 50kb0.2 - 50kb之之间间精选ppt 聚丙聚丙烯酰烯酰胺凝胶胺凝胶电电泳泳聚丙聚丙烯酰烯酰胺凝胶胺凝胶分辨范分辨范围为围为1-10001-1000个碱基个碱基对对精选ppt凝胶凝胶类类型及型及浓浓度度分离分离DNA片段的大小范片段的大小范围围（b

12、p） 0.3%琼琼脂糖脂糖50 0001 000 0.7%琼琼脂糖脂糖20 0001 000 1.4%琼琼脂糖脂糖6 000300 4.0%聚丙聚丙烯酰烯酰胺胺1 000100 10.0%聚丙聚丙烯酰烯酰胺胺50025 20.0%聚丙聚丙烯酰烯酰胺胺501 凝胶的分辨能力同凝胶凝胶的分辨能力同凝胶类类型和型和浓浓度有关，凝胶度有关，凝胶浓浓度的高低影响凝胶介度的高低影响凝胶介质质孔隙的大小，孔隙的大小，浓浓度越高，度越高，孔隙越小，其分辨能力就越孔隙越小，其分辨能力就越强强。反之，。反之，浓浓度降低，度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就随之减弱。孔隙就增大，其分辨能力也就随之减弱。 精选ppt1

13、.2 1.2 转转基因方法基因方法1.2.1 1.2.1 细细菌菌转转基因的方法基因的方法 (1)(1)结结合（合（conjugationconjugation） (2) (2)转转化（化（transformationtransformation）( (常常规转规转化、化、电转电转化等化等) ) (3) (3)转转染（染（transfectiontransfection） (4) (4)转导转导（transductiontransduction）1.2.2 1.2.2 动动物物转转基因的方法基因的方法 (1) (1)显显微注射法：包括微注射法：包括细细胞核内和胞核内和细细胞胞质质内注射。内注射

14、。 (2) (2)电导转电导转基因法基因法 (3) (3)逆逆转录转录病毒介病毒介导导法法 (4) (4)胚胎干胚胎干细细胞介胞介导导法法 (5) (5)精子精子载载体法体法1.2.3 1.2.3 植物植物转转基因的方法基因的方法 (1)Ti (1)Ti质质粒介粒介导导 (2) (2)电转电转化法化法 (3) (3)基因基因枪枪法法精选ppt1.3.1 1.3.1 放射性同位素技放射性同位素技术术同位素：同位素：原子序数相同而原子序数相同而质质量不同的元素。量不同的元素。 放射性同位素放射性同位素 同位素可分同位素可分为稳为稳定同位素和不定同位素和不稳稳定同位素，后者又称定同位素，后者又称为为

15、放射性同位素。不放射性同位素。不稳稳定同位定同位素原子核素原子核结结构不构不稳稳定，易自定，易自发产发产生衰生衰变变，产产生生-射射线线、-射射线线和和-射射线线等，同等，同时时从不从不稳稳定同位素定同位素变变成成稳稳定同位素。在分子生物学研究中，得到定同位素。在分子生物学研究中，得到应应用用的是放射性同位素。的是放射性同位素。1.3 1.3 核酸的分子核酸的分子杂杂交交精选ppt 放射性的衰放射性的衰变类变类型型-射射线线：带带正正电电荷的高速粒子流荷的高速粒子流-射射线线：带负电带负电荷的荷的粒子流粒子流-射射线线：光子流：光子流 分子生物学研究中常用的放射性同位素及其性分子生物学研究中常

16、用的放射性同位素及其性质质元素名称元素名称 半衰期半衰期 12.112.1年年 57005700年年 14.314.3天天 87.187.1天天 5.85.8年年14147 7N + N + 1 10 0n n 14146 6C + C + 1 11 1H H14146 6C C 14147 7N + N + 0 0-1-1e e 2382389292U U 2062068282Pb + 8Pb + 84 42 2He + 6He + 60 0-1-1e (te (t1/2 1/2 = 4.510= 4.5109 9a)a)精选ppt 放射性放射性强强度的探度的探测测（1 1）盖革）盖革计计数

17、器（数器（Geiger counter tuberGeiger counter tuber），），闪闪烁计烁计数器。数器。（2 2）放射自）放射自显显影：影：X-X-光乳胶片覆盖于光乳胶片覆盖于样样品，在品，在黑暗中，黑暗中，-70-70，曝光。，曝光。 放射性分子的制放射性分子的制备备：核物理，化学，生化反：核物理，化学，生化反应应，生化分离技生化分离技术术精选ppt 核酸分子的放射性同位素核酸分子的放射性同位素标记应标记应用用举举例例 利用切口平移技利用切口平移技术术制制备备DNADNA放射性探放射性探针针精选ppt1.3.2 1.3.2 分子分子杂杂交交类类型型 根据根据鉴鉴定定对对象不

18、同，可将分子象不同，可将分子杂杂交法分交法分为为3 3种种类类型：型：Southern杂交由E.M.Southern于1975年创立。SouthernSouthern杂杂交：交：将将将将DNADNADNADNA分子从分子从分子从分子从电电电电泳凝胶泳凝胶泳凝胶泳凝胶转转转转移至移至移至移至杂杂杂杂交交交交滤滤滤滤膜上，膜上，膜上，膜上，然后与核酸探然后与核酸探然后与核酸探然后与核酸探针进针进针进针进行行行行杂杂杂杂交。交。交。交。NorthernNorthernNorthernNorthern杂杂交交：将将将将RNARNARNARNA分子从分子从分子从分子从电电电电泳凝胶泳凝胶泳凝胶泳凝胶转转

19、转转移至移至移至移至杂杂杂杂交交交交滤滤滤滤膜上，膜上，膜上，膜上，然后与核酸探然后与核酸探然后与核酸探然后与核酸探针进针进针进针进行行行行杂杂杂杂交。交。交。交。WesternWesternWesternWestern杂杂交交：将蛋白将蛋白将蛋白将蛋白质质质质从从从从电电电电泳凝胶中泳凝胶中泳凝胶中泳凝胶中转转转转移到移到移到移到杂杂杂杂交交交交滤滤滤滤膜上，膜上，膜上，膜上，然后同放射性同位素然后同放射性同位素然后同放射性同位素然后同放射性同位素125125125125I I I I标记标记标记标记的特定蛋白的特定蛋白的特定蛋白的特定蛋白质进质进质进质进行反行反行反行反应应应应。精选ppt

20、1.3.3 1.3.3 核酸分子核酸分子杂杂交交复性（退火）：复性（退火）：在一定条件在一定条件下下变变性的两条性的两条单链单链重新重新结结合合为为双双链链的的过过程程杂杂交：交：来源不同的两条来源不同的两条单链单链结结合合为为双双链链分子的分子的过过程。程。核酸探核酸探针针：指序列或功能特指序列或功能特性已知的性已知的标记标记分子，分子，为为双双链链或或单链单链，长长度通常度通常为为几十至几十至几百几百bp,bp,包括包括DNADNA探探针针、RNARNA探探针针和和cDNAcDNA探探针针。 若退火的核酸来自若退火的核酸来自不同的生物有机体，不同的生物有机体，则则所形成的双所形成的双链链分

21、子就被分子就被称称为为杂杂种核酸分子种核酸分子。 精选ppt （1 1）SouthernSouthern杂杂交（交（SouthernSouthern印迹）：印迹）：用适用适当的限制当的限制酶酶消化待消化待测测DNADNA，电电泳后，将凝胶浸于泳后，将凝胶浸于碱性溶液中以碱性溶液中以变变性性DNADNA，再，再经经毛毛细细作用将作用将变变性的性的DNADNA从凝胶中从凝胶中转转移至移至杂杂交膜上并固定，然后与放交膜上并固定，然后与放射性同位素射性同位素标记标记的核酸探的核酸探针杂针杂交，再交，再经经放射自放射自显显影影显显示示杂杂交交结结果。果。该该技技术术可有效地分析基因可有效地分析基因结结构

22、构或或检测检测待待测测DNADNA样样本中是否含有特定的序列。本中是否含有特定的序列。精选ppt1)1)电电泳泳: :将已将已酶酶切的待切的待检检DNADNA样样品品进进行行琼琼脂糖凝胶脂糖凝胶电电泳。泳。2)2)转转膜膜: :将分离的核酸将分离的核酸样样品品转转移到移到滤滤膜上（印迹膜上（印迹转转移）。移）。3)3)杂杂交交: :将将滤滤膜与膜与标记标记的的DNADNA或或RNARNA探探针进针进行行杂杂交。交。印迹法：印迹法：凝胶印迹法、斑点和狭凝胶印迹法、斑点和狭线线印迹法、菌落和印迹法、菌落和噬菌斑印迹法。噬菌斑印迹法。杂杂交膜：交膜：尼尼龙滤龙滤膜、硝酸膜、硝酸纤维纤维素素滤滤膜等。

23、膜等。精选ppt放射自显影DNA印迹转移探针杂交杂杂交模式交模式图图精选ppt 某作者用人的一放射性某作者用人的一放射性DNADNA探探针针与鼠基因与鼠基因组组DNADNA进进行行杂杂交，在所得到的交，在所得到的杂杂交交图谱图谱中，第中，第1 1泳道的点泳道的点样处样处有一略呈拖尾状的放射性有一略呈拖尾状的放射性杂杂交斑点；第交斑点；第2 2泳道泳道呈呈较长较长的弥散形的弥散形杂杂交交带带；第；第3 3泳道有泳道有3 3条条较较清晰的清晰的杂杂交条交条带带，上下两条，上下两条带带的的显显色程度相当，中色程度相当，中间间的条的条带带显显色最深，色最深，约约分分别为别为其上下两其上下两侧侧条条带带

24、的两倍。的两倍。试试分分析上述析上述实验结实验结果。果。例例题题：精选ppt SouthernSouthern杂杂交交应应用用举举例例环环状芽状芽孢孢杆菌基因启杆菌基因启动动子的分离与子的分离与鉴鉴定定精选ppt环环状芽状芽孢孢杆菌杆菌C-2C-2基因启基因启动动子探子探针针与重与重组组DNADNA分子的斑点分子的斑点杂杂交交（2 2）斑点）斑点杂杂交交（Dot blotDot blot）：直接将）：直接将DNADNA样样品点在品点在滤滤膜上使之成膜上使之成为为斑点，斑点，变变性并固定，与探性并固定，与探针杂针杂交，放射交，放射自自显显影。影。精选ppt检测检测检测检测重重重重组组组组体克隆的

25、菌落体克隆的菌落体克隆的菌落体克隆的菌落杂杂杂杂交技交技交技交技术术术术（3 3）菌落原位）菌落原位杂杂交交（Hybridization in situ)Hybridization in situ)：又分又分为为菌落菌落杂杂交和空斑交和空斑杂杂交。在交。在杂杂交膜上接种交膜上接种转转化子化子细细胞，裂解胞，裂解以以释释放待放待检检DNADNA，变变性并固定性并固定DNADNA，与探，与探针杂针杂交，放射自交，放射自显显影。影。用于用于鉴鉴定阳性重定阳性重组组体。体。精选ppt（4 4）组织组织原位原位杂杂交交（Tissue in situ hybridizationTissue in situ

26、 hybridization）：）： 指指组织组织或或细细胞的原位胞的原位杂杂交。交。经经适当适当处处理后，使理后，使细细胞通透胞通透性增加，性增加，让让探探针进针进入入细细胞内与胞内与DNADNA或或RNARNA杂杂交，以确定探交，以确定探针针互互补补序列在胞内的空序列在胞内的空间间位置。位置。Localization of RNA精选ppt1.4 1.4 聚合聚合酶酶链链式反式反应应(Polymerase Chain Reaction(Polymerase Chain Reaction，PCRPCR） PCRPCR技技术简术简史史1.4.1 PCR1.4.1 PCR原理原理 PCRPCR是

27、一种体外无性是一种体外无性扩扩增增DNADNA的的实验实验技技术术。待。待扩扩增增DNADNA片段片段经经高温高温变变性成性成为单链为单链后，在低温后，在低温（如（如5252）下与寡聚核苷酸引物退火，然后在中温下）下与寡聚核苷酸引物退火，然后在中温下以每一条以每一条单链为单链为模板，由多聚模板，由多聚酶酶催化延伸引物催化延伸引物链链，分，分别别合成一条新合成一条新链链。经过经过解解链链、退火和、退火和链链延伸等多个循延伸等多个循环环反反应应，原，原DNADNA片段就可得到大量片段就可得到大量扩扩增。增。注注: : TaqTaq来自来自Thermus aquaticusThermus aquat

28、icus PCRPCR仪仪精选ppt1.4.2 PCR1.4.2 PCR反反应应体系体系 Tmplate DNATmplate DNA DNA Primers DNA Primers dNTPs dNTPs Taq DNA Polymerase Taq DNA Polymerase 10 Buffer 10 Buffer1.4.3 1.4.3 基本反基本反应应步步骤骤 1 1个循个循环环包括包括高温高温变变性、低温退火和中温延伸性、低温退火和中温延伸反反应应。经经n n次循次循环环后后, , 一个一个DNADNA分子可分子可扩扩增增为为2 2n n个分子。个分子。精选ppt 模板模板DNADN

29、A的的变变性：模板性：模板DNADNA经经加加热热至至9494左右左右一定一定时间时间后，使模板后，使模板DNADNA双双链链解离，使之成解离，使之成为单为单链链，以便与引物，以便与引物结结合。合。精选pptPrimer 1Primer 2535533 模板模板DNADNA与引物的退火与引物的退火( (复性复性) )：模板：模板DNADNA经经加加热热变变性成性成单链单链后，温度降至后，温度降至5555左右，引物与模板左右，引物与模板DNADNA单链单链上的互上的互补补序列配序列配对结对结合。合。335精选pptPrimer 1Primer 253553533Taq DNAPolymerase

30、 引物的延伸：引物的延伸：DNADNA模板模板-引物引物结结合物在合物在TaqTaq DNA DNA聚聚合合酶酶的作用下，以的作用下，以dNTPdNTP为为反反应应原料，靶序列原料，靶序列为为模板，模板，按碱基配按碱基配对对原原则则，合成一条新的与模板，合成一条新的与模板DNADNA互互补补的的链链。精选ppt 一般每完成一个循一般每完成一个循环环需需2-42-4分分钟钟，2-32-3小小时时就能就能将待将待扩扩增目的基因增目的基因扩扩增放大几百万倍。增放大几百万倍。1 1个个PCRPCR循循环产环产生生2 2条双条双链链分子分子精选pptPCR的基本原理模板DNA精选pptPCR的基本原理P

31、CR反应条件PCR过程PCR的特点引物1引物2精选pptPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点引物1引物2Taq酶Taq酶精选pptPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点第1轮结束精选pptPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点TaqTaqTaqTaq精选pptPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点第2轮结束精选pptPCR反应条件PCR过程PCR的特点重复30轮后230=1,073,741,824第第1 1轮扩轮扩增增第第2 2轮扩轮扩增增第第3 3轮扩轮扩增增第第4 4轮扩轮扩增增第第5 5轮扩轮扩增增第第6 6轮扩轮扩增增精选ppt

32、电电泳分析泳分析PCR设备精选ppt电电泳分析泳分析精选ppt（3 3）PCRPCR的的应应用用 反向反向PCRPCR：扩扩增已知序列旁增已知序列旁侧侧的未知的未知DNADNA序列序列 锚锚定定PCR:PCR: 用于用于测测定基因定基因结结构构 不不对对称称PCR:PCR: 用于用于扩扩增某一增某一单链单链模板模板 RT-PCR(RT-PCR(逆逆转录转录-PCR):-PCR): 逆逆转录联转录联合合PCRPCR以以扩扩增增cDNAcDNA 复合复合PCR:PCR: 用多用多对对引物同引物同时扩时扩增几条增几条DNADNA片段片段 易易错错PCRPCR：引入引入错错配配碱基，碱基，导导致随机突

33、致随机突变变 荧荧光定量光定量PCR:PCR: 用于估用于估计计模板模板DNADNA的的浓浓度度 免疫免疫PCRPCR：扩扩增抗原增抗原- -抗体复合物上的抗体复合物上的DNADNA分子分子 原位原位PCRPCR：在在组织组织或或细细胞胞标标本片上直接本片上直接进进行行PCRPCR 微生物微生物PCR:PCR: 用于微生物的用于微生物的鉴鉴定和分定和分类类精选ppt 设计设计引物引物应应遵循以下原遵循以下原则则：引物引物长长度：度：15-30bp15-30bp，常，常为为20nt20nt左右。左右。引物引物扩扩增跨度：以增跨度：以200-500bp200-500bp为为宜。宜。引物碱基：引物碱

34、基：G+CG+C含量以含量以40-60%40-60%为为宜。避免宜。避免5 5个以上个以上相同碱基的成串排列。相同碱基的成串排列。引物内部引物内部应应避免出避免出现现出出现现二二级结级结构，避免两条引构，避免两条引物物间间互互补补。引物引物33末端碱基，末端碱基，应应与模板与模板单链单链严严格格配配对对。引物中具有或能引物中具有或能够够加上合适的加上合适的酶酶切位点。切位点。特异性：与数据特异性：与数据库库中的其它序列无明中的其它序列无明显显同源性。同源性。精选pptpPICZpPICZ物理物理图谱图谱 定向克隆定向克隆应应用用举举例例精选pptPrimer F：5- GCT GAA TTCG

35、AA TTC ATG GGC AAC TCA GCG CTC GAC CTT - 3Primer R：5- TGT TCT AGATCT AGA TTA GAC GTT ACC GGC GGC GCC AGT - 3 上、下游引物的上、下游引物的55端分端分别设别设有有1 1个个EcoEcoR R 和和1 1个个XbaXba 酶酶切位点（黑切位点（黑体字母表示）及体字母表示）及3 3个保个保护护碱基。碱基。 定向克隆定向克隆应应用用举举例例-PCR-PCR引物引物设计设计粗毛栓菌粗毛栓菌热热激蛋白激蛋白cDNA PCRcDNA PCR扩扩增增-引物引物设计设计: :精选ppt5CTTCCACG

36、ACGCTATC-/-GAGAGATTCGCCTGCA 35CTTCCACGACGCTATC-/-GAGAGATTCGCCTGCA 3 关于关于PCRPCR引物引物设计设计例例题题1 1：根据以下根据以下cDNAcDNA编码编码区片段的两末端已知序列，区片段的两末端已知序列，如何如何设计设计下游引物，以下游引物，以扩扩增增该该cDNAcDNA片段。片段。例例题题2:2: 如何利用网如何利用网络络技技术术和和DNADNA分析分析软软件件设计简设计简并引并引物物, , 以以PCRPCR扩扩增某蛋白的增某蛋白的cDNA?cDNA?演示演示: : (1) (1)登登录录NCBINCBI等网站等网站,

37、,收集有关收集有关cDNAcDNA序列信息序列信息; ; (2) (2)利用利用DNADNA分析分析软软件件( (如如,DNAman,DNAman等等) )对对所收集所收集的的cDNAcDNA序列序列进进行比行比对对分析分析, ,利用最保守序列利用最保守序列设计设计引物。引物。 再再论论cDNAcDNA精选ppt3838种种MnPMnP同工同工酶酶cDNAcDNA序序列的同源性比列的同源性比较较右右侧侧1 1列符号表示相列符号表示相应应的的cDNAcDNA序列在序列在GenBankGenBank中的中的登登录录号号精选ppt 核核酸序列分析酸序列分析: : 即核酸一即核酸一级结级结构的构的测测

38、定。定。 MaxamMaxam、GilbertGilbert的化学的化学测测定法和定法和SangerSanger的的酶酶法。法。1.5 1.5 核苷酸序列分析核苷酸序列分析精选ppt酶酶法法测测序序(Sanger) 化学化学测测序法序法(Maxam-Gilbert) 待待测测DNA片段片段 待待测测DNA片段片段 次克隆次克隆 5-末端末端标记标记 筛选筛选重重组组子子 链链分离分离 限制限制酶酶切切 模板增殖与模板增殖与纯纯化化 纯纯化化标记标记的的ss-DNA 与引物退火与引物退火 定序反定序反应应 定序反定序反应应 聚丙聚丙烯酰烯酰胺凝胶胺凝胶电电泳泳 真空干燥真空干燥 放射自放射自显显

39、影影 阅读阅读序列和序列和计计算机算机录录入入 核苷酸序列的分析与比核苷酸序列的分析与比较较精选ppt1.5.1 Sanger1.5.1 Sanger双脱氧核苷酸双脱氧核苷酸链终链终止法止法 （1 1）原理：）原理：双脱氧（双脱氧（2，3）-核苷酸可以象核苷酸可以象2-脱氧核苷脱氧核苷酸那酸那样样直接直接掺掺入新合成的入新合成的DNA链链中，但因中，但因3 端不具端不具OH基，基，DNA链链合成至此合成至此终终止。由于双脱氧核苷酸在每个止。由于双脱氧核苷酸在每个DNA分子分子中中掺掺入的位置不同，故可根据不同入的位置不同，故可根据不同长长度的度的DNA片段片段测测定出定出核苷酸序列。核苷酸序列

40、。精选pptdsDNAdsDNA变变性性与与1 1条条标记标记引物退火引物退火在在4 4个反个反应应管中分管中分别别加入加入dNTPdNTP和和1 1种双脱氧核苷酸种双脱氧核苷酸DNADNA聚合反聚合反应应反反应产应产物物变变性性电电泳泳凝胶干燥凝胶干燥放射自放射自显显影影序列序列读读取。取。（2 2）步）步骤骤双双脱脱氧氧核核苷苷酸酸链链终终止止法法测测序序示示意意图图精选ppt 双双脱氧核苷酸脱氧核苷酸链终链终止法止法测测序序(Sanger(Sanger法法) )原理原理精选pptDNA sequencing gel showing the separation of fragments

41、in the four sequencing reactions (one per lane). 精选ppt序列序列读读取方法取方法1 1）每一条每一条带带都代表一条以双脱氧核苷酸都代表一条以双脱氧核苷酸结结尾的尾的单单链链核苷酸片段。核苷酸片段。2 2）从凝胶的正极往从凝胶的正极往负负极端直接极端直接读读取的序列，取的序列，为为从从的新合成的的新合成的单链单链序列序列; ; 而从而从负负极往极往正极直接正极直接读读取的序列，取的序列，则为则为上述序列的反向序上述序列的反向序列列( ( 方向方向为为 ) )。模板序列。模板序列则为则为上述序列上述序列的互的互补补序列。序列。 精选ppt思考思考

42、题题： 假假定定某某一一基基因因克克隆隆的的部部分分序序列列为为5 5TCACGTAAGT3TCACGTAAGT3，试试根根据据SangerSanger序序列列分分析析方方法法原原理理画画出出测测定定上上述述序序列列的的放放射射自自显显影影示示意意图图，并并对对示意示意图图作必要的作必要的标标注和解注和解释释。精选ppt 1.5.2 DNA1.5.2 DNA序列序列测测定的自定的自动动化化 使用自使用自动测动测序序仪仪, ,使得模板制使得模板制备备自自动动化、定序反化、定序反应应自自动动化、化、凝胶凝胶电电泳自泳自动动化、核苷酸序列化、核苷酸序列阅读阅读与与计计算机算机输输入自入自动动化。化。

43、精选ppt DNA DNA序列分析自序列分析自动动化包括两个方面的内容化包括两个方面的内容: :一一是指是指“分析反分析反应应”的自的自动动化化; ;另一方面另一方面则则是指是指“读读片片过过程程”的自的自动动化。化。优优点：点：i. i. 四个反四个反应应系系统统可合并点可合并点样样，大大，大大节节省制省制胶和胶和 点点样时间样时间。ii.ii.可同可同时读时读出多个出多个样样品核苷酸序品核苷酸序列，不需干燥凝胶和放射自列，不需干燥凝胶和放射自显显影。影。iii.iii.可可连续电连续电泳，泳，可可读读出出较较多的核苷酸序列。多的核苷酸序列。缺点：缺点：无法保留原始无法保留原始记录记录, ,

44、 四个反四个反应产应产物点在一条物点在一条道上道上, ,相互相互间间会会发发生干生干扰扰, , 导导致致读读序序时时分辨率下降。分辨率下降。 DNADNA序列序列测测定的自定的自动动化化精选ppt 荧荧光素光素标记标记核苷酸核苷酸应应用用举举例例精选pptIn DNA sequencing using dideoxynucleotides labeled with fluorescent dyes, all four ddNTPs are added to the same tube, and during primer extension, all combinations of chain

45、s are produced.精选ppt精选pptAutomated DNA sequencing using fluorescent dyes, one for each base精选ppt1.6 1.6 基因文基因文库库的建立的建立 克隆（克隆（cloneclone）：）：作名作名词词用，是指具有相同用，是指具有相同DNADNA分分子的一个群体或基因型相同的一个生物群体。作子的一个群体或基因型相同的一个生物群体。作动动词词用，指用，指“进进行克隆行克隆”或或“去克隆去克隆”，将一特定，将一特定DNADNA顺顺序插入一个序插入一个载载体分子。体分子。 亚亚克隆（次克隆，二克隆（次克隆，二级级

46、克隆，克隆，sub-clonesub-clone）：）：是指是指从已从已经经克隆在克隆在载载体中的一个大片段中取出体中的一个大片段中取出较较小的小的DNADNA片段再片段再进进行克隆的方法。行克隆的方法。 基因文基因文库库(gene library):(gene library):包括基因包括基因组组文文库库和和cDNAcDNA文文库库。 YACYAC和和BACBAC文文库库精选ppt 基因工程基本操作步基因工程基本操作步骤骤：“分、切、分、切、连连、转转、筛筛”基因基因组组文文库库的构建步的构建步骤骤精选ppt1.6.1 1.6.1 基因基因组组文文库库 基因基因组组文文库库: 含有某种生物

47、全部含有某种生物全部遗传遗传信息的重信息的重组组DNADNA分子的克隆分子的克隆总总体。体。 基因基因组组文文库库的的规规模模：N = N = lnln（1p1p）/ /lnln（1-f1-f） 上式中，上式中，N N：克隆数；：克隆数；p p：某：某DNADNA片段在基因文片段在基因文库库中出中出现现的的概率；概率；f f：插入片段的平均大小与基因：插入片段的平均大小与基因组组大小的比大小的比值值。精选ppt1.6.2 cDNA1.6.2 cDNA文文库库 从一定生从一定生长阶长阶段的某种段的某种细细胞或胞或组织组织分离得到的分离得到的总总mRNAmRNA反反转录转录成成总总cDNAcDNA

48、，插入到克隆，插入到克隆载载体，然后再将体，然后再将cDNAcDNA重重组组子子转转移移到宿主到宿主细细胞中胞中进进行增殖。通行增殖。通过过上述方法所上述方法所获获得的无性繁殖系得的无性繁殖系即即为为cDNAcDNA文文库库。cDNAcDNA文文库库构建步构建步骤骤精选ppt 与与cDNAcDNA克隆或文克隆或文库库构建有关的几个构建有关的几个问题问题 l cDNAcDNA的概念：的概念：第一第一链链cDNAcDNA；cDNAcDNA基因；基因；cDNAcDNA编码编码序列。序列。l mRNAmRNA质质量的量的检测检测：根据根据甲甲醛变醛变性胶性胶电电泳泳的的rRNArRNA的的带带型型进进

49、行判定。行判定。l mRNAmRNA的的纯纯化化：0ligo0ligo（dTdT）- -纤维纤维素柱素柱层层析；抗生析；抗生物素蛋白物素蛋白磁珠吸附法磁珠吸附法。 生物素生物素标记标记0ligo0ligo（dTdT）。l cDNAcDNA重重组组子的形成子的形成：在在cDNAcDNA双双链链末端或添加同聚末端或添加同聚物物单链单链尾巴，或添加含适当限制尾巴，或添加含适当限制酶酶识别识别序列的序列的“接接头头”（linkerlinker），以便与适当），以便与适当载载体重体重组组。精选pptTrametes gallicaTrametes gallica总总RNARNA的甲的甲醛变醛变性性电电泳

50、泳mRNAmRNA质质量的量的检测检测精选pptmRNAmRNA的的纯纯化化Promega PolyPromega PolyPromega PolyPromega Poly（ATATATAT） tract mRNA tract mRNA tract mRNA tract mRNA Isolation SystemIsolation SystemIsolation SystemIsolation System分分分分离离离离Poly(A)RNAPoly(A)RNAPoly(A)RNAPoly(A)RNA：将将将将用用生物素生物素标记标记的的OligoOligoOligoOligo（dT)dT)d

51、T)dT)与与与与总总总总RNARNARNARNA共共共共温育；加入包被有抗温育；加入包被有抗温育；加入包被有抗温育；加入包被有抗生物素蛋白的微磁球；生物素蛋白的微磁球；生物素蛋白的微磁球；生物素蛋白的微磁球；用磁用磁用磁用磁场场场场吸附吸附吸附吸附Oligo(dT)-mRNAOligo(dT)-mRNAOligo(dT)-mRNAOligo(dT)-mRNA。精选pptcDNA文库构建图解精选ppt1.7 1.7 分子分子标记标记技技术术 遗传标记遗传标记: : 是基因型的特殊的易于是基因型的特殊的易于识别识别的表的表现现形式，形式，它是生物分它是生物分类类学、学、遗传遗传学、育种学、物种起

52、源与学、育种学、物种起源与进进化等研究化等研究的主要技的主要技术术指指标标之一。包括形之一。包括形态标记态标记、细细胞学胞学标记标记、生化、生化标标记记和分子和分子标记标记等。等。 分子分子标记标记: : 分子分子标记标记指能反映生物个体或种群之指能反映生物个体或种群之间间基基因因组组DNADNA差异的差异的DNADNA序列序列。分子。分子标记标记广泛存在于基因广泛存在于基因组组的各个的各个区域，数量大，多区域，数量大，多态态性高。分子性高。分子标记标记大多以大多以电电泳泳谱带谱带的形式的形式表表现现出来。是出来。是继继形形态标记态标记、细细胞胞标记标记和生化和生化标记标记之后之后发发展起展起

53、来的一种新的来的一种新的较为较为理想的直接从理想的直接从DNADNA水平上水平上进进行行遗传遗传分析的分析的遗传标记遗传标记。 应应用用 种种质资质资源研究、品源研究、品质纯质纯度度鉴鉴定、构建定、构建遗传连锁图遗传连锁图、基因定位基因定位标记辅标记辅助助选择选择、比、比较较基因基因组组研究、基因克隆（研究、基因克隆（图图位位克隆）、生物起源、克隆）、生物起源、进进化、医学及法医学等。化、医学及法医学等。精选ppt 现现现现有的有的有的有的DNADNADNADNA分子分子分子分子标记标记标记标记技技技技术术术术大体上可分大体上可分大体上可分大体上可分为为为为2 2 2 2类类类类，一一一一类类

54、类类是以分子是以分子是以分子是以分子杂杂杂杂交交交交为为为为基基基基础础础础的分子的分子的分子的分子标记标记标记标记，其代表性，其代表性，其代表性，其代表性技技技技术术术术是是是是RFLPRFLPRFLPRFLP；另一另一另一另一类类类类是以是以是以是以PCRPCRPCRPCR为为为为基基基基础础础础的分子的分子的分子的分子标记标记标记标记，如如如如RAPDRAPDRAPDRAPD、SCARSCARSCARSCAR、SSRSSRSSRSSR、SSLPSSLPSSLPSSLP、ISSRISSRISSRISSR、AFLPAFLPAFLPAFLP、STSSTSSTSSTS、ESTESTESTEST、

55、SSCPSSCPSSCPSSCP和和和和SNPSNPSNPSNP等。等。等。等。 每种分子每种分子每种分子每种分子标记标记标记标记技技技技术术术术都有其都有其都有其都有其优优优优缺点，可根据缺点，可根据缺点，可根据缺点，可根据实实实实验验验验材料和研究目的的不同灵活材料和研究目的的不同灵活材料和研究目的的不同灵活材料和研究目的的不同灵活选选选选用。用。用。用。 DNADNA分子分子标记类标记类型型精选ppt 主要的主要的DNADNA分子分子标记标记英文英文英文英文缩缩缩缩写写写写 英文名称英文名称英文名称英文名称 中文名称中文名称中文名称中文名称RFLPRFLPRFLPRFLP Restric

56、tion fragment length polymorphism Restriction fragment length polymorphism Restriction fragment length polymorphism Restriction fragment length polymorphism 限制性片段限制性片段限制性片段限制性片段长长长长度多度多度多度多态态态态性性性性STSSTSSTSSTS Sequence tagged site Sequence tagged site Sequence tagged site Sequence tagged site 序列序列序列

57、序列标签标签标签标签位点位点位点位点RAPDRAPDRAPDRAPD Random amplified polymorphic DNA Random amplified polymorphic DNA Random amplified polymorphic DNA Random amplified polymorphic DNA 随机随机随机随机扩扩扩扩增多增多增多增多态态态态性性性性DNADNADNADNASCARSCARSCARSCAR Sequence-characterized amplified region Sequence-characterized amplified reg

58、ion Sequence-characterized amplified region Sequence-characterized amplified region 序列特异性序列特异性序列特异性序列特异性扩扩扩扩增区增区增区增区AFLPAFLPAFLPAFLP Amplified fragment length polymorphism Amplified fragment length polymorphism Amplified fragment length polymorphism Amplified fragment length polymorphism 扩扩扩扩增片断增片断增

59、片断增片断长长长长度多度多度多度多态态态态性性性性SSRSSRSSRSSR Simple sequence repeat Simple sequence repeat Simple sequence repeat Simple sequence repeat 简单简单简单简单序列重复序列重复序列重复序列重复SSLPSSLPSSLPSSLP Simple sequence length polymorphism Simple sequence length polymorphism Simple sequence length polymorphism Simple sequence lengt

60、h polymorphism 简单简单简单简单序列序列序列序列长长长长度多度多度多度多态态态态性性性性ISSRISSRISSRISSR Inter-simple sequence repeats Inter-simple sequence repeats Inter-simple sequence repeats Inter-simple sequence repeats 间简单间简单间简单间简单序列重复序列重复序列重复序列重复SSCPSSCPSSCPSSCP Single-strand conformation polymorphism Single-strand conformation

61、polymorphism Single-strand conformation polymorphism Single-strand conformation polymorphism 单链单链单链单链构象多构象多构象多构象多态态态态性性性性SNPSNPSNPSNP Simple nucleotide polymorphism Simple nucleotide polymorphism Simple nucleotide polymorphism Simple nucleotide polymorphism 单单单单核苷酸多核苷酸多核苷酸多核苷酸多态态态态性性性性精选ppt(1) RFLP

62、(1) RFLP (限制性片段限制性片段长长度多度多态态性性) ) 不同个体基因不同个体基因不同个体基因不同个体基因组组组组内的核苷酸序列因某种原因内的核苷酸序列因某种原因内的核苷酸序列因某种原因内的核苷酸序列因某种原因产产产产生碱基突生碱基突生碱基突生碱基突变变变变后，改后，改后，改后，改变变变变了某种限制性内切了某种限制性内切了某种限制性内切了某种限制性内切酶酶酶酶的剪的剪的剪的剪切位点，切位点，切位点，切位点，导导致致酶酶切片段的大小切片段的大小发发生生变变化，化，这这种种变变化可以通化可以通过过与特定探与特定探针进针进行行杂杂交而得到交而得到检测检测，从，从而可比而可比较较不同品种或个

63、体的不同品种或个体的DNADNA水平的差异水平的差异。这这这这些限制性片段在不同个体些限制性片段在不同个体些限制性片段在不同个体些限制性片段在不同个体间间间间呈呈呈呈现现现现的多的多的多的多态态态态性性性性现现现现象称象称象称象称为为为为限制片段限制片段限制片段限制片段长长长长度多度多度多度多态态态态性。性。性。性。RFLPRFLPRFLPRFLP被称被称被称被称为为为为第一代分子第一代分子第一代分子第一代分子标记标记标记标记。 精选ppt同一物种不同生同一物种不同生态态型之型之间间DNADNA的的趋趋异性的异性的RFLPRFLPGAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGGAATTCCT

64、TAAGEcoRIEcoRIEcoRI生生态态型型A的的DNA:基因基因A生生态态型型B的的DNA:GAATTCCTTAAGGGATTCCCTAAGGAATTCCTTAAGEcoRIEcoRI从每个生态型分离的DNA分别用EcoRI限制酶切割琼脂糖凝胶电泳后作Southern杂交与放射性同位素标记的基因A克隆杂交放射自显影照片AT.GCto取代(a)(b)精选ppt提取DNA酶切DNA凝胶电泳分开DNA 片段DNA 转移到滤膜上与放射性标记探针杂交,显示特异的DNA 片段RFLPRFLP基本步基本步骤骤精选ppt DNA“DNA“指指纹纹”（DNA finger-printDNA finger

65、-print）: :利用重复序列利用重复序列中的中的“核心序列核心序列”作探作探针针，与，与经经内切内切酶酶酶酶切的切的DNADNA片段片段进进行行SouthernSouthern印迹印迹杂杂交，每个人各有自己的交，每个人各有自己的杂杂交交带带型，如同每个型，如同每个人各有自己的指人各有自己的指纹图纹图形一形一样样。精选ppt精选ppt(2) (2) (2) (2) STSSTS（sequence-tagged sitesequence-tagged site）序列序列标签标签位点位点 为为已知核苷酸序列的已知核苷酸序列的DNADNA片段，是基因片段，是基因组组中任中任何何单单拷拷贝贝的短的短

66、DNADNA序列，序列，长长度在度在100100500bp500bp之之间间。任何任何DNADNA序列，只要知道它在基因序列，只要知道它在基因组组中的位置，都中的位置，都能被用作能被用作STSSTS标签标签。STSSTS是基因是基因组组中中较较短的用于定位短的用于定位的序列。的序列。 精选ppt(3) (3) (3) (3) RAPD(RAPD(Random amplified polymorphic DNA) Random amplified polymorphic DNA) Random amplified polymorphic DNA) Random amplified polymor

67、phic DNA) 随机随机随机随机扩扩扩扩增多增多增多增多态态态态性性性性DNADNADNADNA 是是一种一种建立在建立在PCRPCR基基础础之上的可之上的可对对整个未知序整个未知序列的基因列的基因组进组进行多行多态态性分析的分子性分析的分子标记标记方法。以方法。以若干条人工合成的随机引物若干条人工合成的随机引物( ( 通常通常为为10nt), 10nt), 对对所所研究的基因研究的基因组组DNADNA进进行行PCR PCR 扩扩增。增。扩扩增增产产物物经琼经琼脂脂糖或聚丙糖或聚丙烯酰烯酰胺凝胶胺凝胶电电泳分离、溴化乙泳分离、溴化乙锭锭染色后，染色后，在紫外透在紫外透视仪视仪上上检测检测多

68、多态态性。一般一条引物可性。一般一条引物可扩扩增增6-126-12条条DNADNA片段。片段。RAPDRAPD不涉及印迹不涉及印迹杂杂交、放射性交、放射性自自显显影等技影等技术术，因此，因此简简便易行。便易行。精选ppt(4) SCAR(4) SCAR(4) SCAR(4) SCAR ( ( ( (Sequence-characterized amplified Sequence-characterized amplified Sequence-characterized amplified Sequence-characterized amplified region) region) re

69、gion) region) 序列特异性序列特异性序列特异性序列特异性扩扩扩扩增区增区增区增区 基于基于基于基于RAPDRAPDRAPDRAPD的分子的分子的分子的分子标记标记标记标记技技技技术术术术，其基本流程，其基本流程，其基本流程，其基本流程为为为为，先，先，先，先进进进进行行行行RAPDRAPDRAPDRAPD分析，然后将目分析，然后将目分析，然后将目分析，然后将目标标标标RAPDRAPDRAPDRAPD片段回收、克隆和片段回收、克隆和片段回收、克隆和片段回收、克隆和测测测测序，再根据所序，再根据所序，再根据所序，再根据所测测测测序列序列序列序列设计设计设计设计特定引物，此引物通常特定引

70、物，此引物通常特定引物，此引物通常特定引物，此引物通常包含原包含原包含原包含原RAPDRAPDRAPDRAPD引物，引物，引物，引物，长长长长度度度度为为为为20-24bp20-24bp20-24bp20-24bp，再用此新引物，再用此新引物，再用此新引物，再用此新引物对对对对所研究的基因所研究的基因所研究的基因所研究的基因组进组进组进组进行行行行PCRPCRPCRPCR扩扩扩扩增，从而可把与原增，从而可把与原增，从而可把与原增，从而可把与原RAPDRAPDRAPDRAPD片段相片段相片段相片段相对应对应对应对应的的的的单单单单一位点一位点一位点一位点鉴鉴鉴鉴定出来。定出来。定出来。定出来。

71、精选ppt(5) (5) (5) (5) AFLP(AFLP(Amplified fragment length Amplified fragment length Amplified fragment length Amplified fragment length polymorphism) polymorphism) polymorphism) polymorphism) 扩扩扩扩增片断增片断增片断增片断长长长长度多度多度多度多态态态态性性性性 是一种基于是一种基于PCRPCR反反应应以以选择选择性性扩扩增基因增基因组组DNADNA限限制性片段的制性片段的DNADNA指指纹纹技技术术，基

72、因，基因组组DNADNA先用限制性内先用限制性内切切酶酶切割（限制性片段由切割（限制性片段由2 2种种酶酶切割切割产产生，一种是生，一种是罕罕见见切割切割酶酶，一种是常用切割，一种是常用切割酶酶），然后将双），然后将双链链接接头连头连接到接到DNADNA片段的末端，接片段的末端，接头头序列和相序列和相邻邻的限制的限制性位点序列，作性位点序列，作为为引物引物结结合位点。合位点。AFLPAFLP结结合了合了RFLPRFLP和和PCRPCR技技术术特点，具有特点，具有RFLPRFLP技技术术的可靠性和的可靠性和PCRPCR技技术术的高效性。的高效性。精选ppt(6) (6) (6) (6) SSRS

73、SR或或STR STR （Simple Sequence RepeatsSimple Sequence Repeats，SSRSSR）简单简单序列重复序列重复, ,又称微又称微卫卫星星DNA ( Microsatellite DNA ( Microsatellite DNA )DNA )或短串或短串联联重复序列（重复序列（short tandem repeatsshort tandem repeats，STRSTR） 是一是一类类由几个核苷酸（一般由几个核苷酸（一般为为2-62-6个）个）为为重复重复单单位簇集而成的位簇集而成的长长达几十个核苷酸的串达几十个核苷酸的串联联重复序列，广重复序列，

74、广泛分布于真核生物基因泛分布于真核生物基因组组中，具有高度多中，具有高度多态态性。性。微微卫卫星在星在结结构上的最大特点是其两端序列构上的最大特点是其两端序列较较保守。人保守。人们们根根据微据微卫卫星重复序列两端的特定短序列星重复序列两端的特定短序列设计设计引物，用来引物，用来PCRPCR扩扩增重复序列本身，增重复序列本身，从而揭示微从而揭示微卫卫星的多星的多态态性。性。SSRSSR被称被称为继为继RFLPRFLP之后的之后的第二代分子第二代分子第二代分子第二代分子遗传标记遗传标记遗传标记遗传标记。精选ppt(7) SSLP (Simple sequence length polymorphi

75、sm) (7) SSLP (Simple sequence length polymorphism) (7) SSLP (Simple sequence length polymorphism) (7) SSLP (Simple sequence length polymorphism) 简单简单简单简单序列序列序列序列长长长长度多度多度多度多态态态态性性性性 根据串根据串根据串根据串联联联联重复排列的微重复排列的微重复排列的微重复排列的微卫卫卫卫星基序两星基序两星基序两星基序两侧侧侧侧的的的的单单单单一序列一序列一序列一序列设计设计设计设计引物，引物，引物，引物，对对对对微微微微卫卫卫卫星序

76、列星序列星序列星序列进进进进行行行行PCRPCRPCRPCR扩扩扩扩增，由微增，由微增，由微增，由微卫卫卫卫星基星基星基星基序重复数目的序重复数目的序重复数目的序重复数目的变变变变异而异而异而异而产产产产生多生多生多生多态态态态性。性。性。性。精选ppt(8) ISSR(8) ISSR(8) ISSR(8) ISSR (inter-simple sequence repeats)(inter-simple sequence repeats)(inter-simple sequence repeats)(inter-simple sequence repeats)间间间间简单简单简单简单序列重复

77、序列重复序列重复序列重复 根据基因根据基因根据基因根据基因组组组组中广泛存在的微中广泛存在的微中广泛存在的微中广泛存在的微卫卫卫卫星序列星序列星序列星序列设计设计设计设计通通通通用引物用引物用引物用引物对对对对基因基因基因基因组组组组DNADNADNADNA进进进进行行行行PCRPCRPCRPCR扩扩扩扩增，引物可以是微增，引物可以是微增，引物可以是微增，引物可以是微卫卫卫卫星基序本身。星基序本身。星基序本身。星基序本身。ISSRISSRISSRISSR保留了保留了保留了保留了SSLPSSLPSSLPSSLP的的的的优优优优点，同点，同点，同点，同时还时还时还时还有效地克服了有效地克服了有效地

78、克服了有效地克服了SSLPSSLPSSLPSSLP标记标记标记标记中引物中引物中引物中引物设计设计设计设计困困困困难难难难的缺点。的缺点。的缺点。的缺点。精选ppt(9) SSCP(Single-strand conformation (9) SSCP(Single-strand conformation (9) SSCP(Single-strand conformation (9) SSCP(Single-strand conformation polymorphism) polymorphism) polymorphism) polymorphism) 单链单链单链单链构象多构象多构象多构

79、象多态态态态性性性性 单链单链单链单链DNADNADNADNA在非在非在非在非变变变变性聚丙性聚丙性聚丙性聚丙烯酰烯酰烯酰烯酰胺凝胶中的迁移率取决于其胺凝胶中的迁移率取决于其胺凝胶中的迁移率取决于其胺凝胶中的迁移率取决于其分子量和空分子量和空分子量和空分子量和空间间间间构象。双构象。双构象。双构象。双链链链链DNADNADNADNA经变经变经变经变性后，再性后，再性后，再性后，再进进进进行非行非行非行非变变变变性胶性胶性胶性胶电电电电泳，在非泳，在非泳，在非泳，在非变变变变性胶中，性胶中，性胶中，性胶中，单链单链单链单链DNADNADNADNA可形成二可形成二可形成二可形成二级结级结级结级结构

80、，而构，而构，而构，而该结该结该结该结构又构又构又构又与其碱基序列有关。通与其碱基序列有关。通与其碱基序列有关。通与其碱基序列有关。通过电过电过电过电泳，不同的泳，不同的泳，不同的泳，不同的单链单链单链单链DNADNADNADNA被分离，被分离，被分离，被分离，单单单单链链链链DNADNADNADNA在凝胶中的位置差异反映了其序列在凝胶中的位置差异反映了其序列在凝胶中的位置差异反映了其序列在凝胶中的位置差异反映了其序列组组组组成的差异，从而成的差异，从而成的差异，从而成的差异，从而呈呈呈呈现单链现单链现单链现单链构象多构象多构象多构象多态态态态性。性。性。性。SSCPSSCPSSCPSSCP可

81、用于可用于可用于可用于检测检测检测检测点突点突点突点突变变变变。 PCR-SSCP PCR-SSCP PCR-SSCP PCR-SSCP是将是将是将是将PCRPCRPCRPCR与与与与SSCPSSCPSSCPSSCP相相相相结结结结合的用于合的用于合的用于合的用于检测检测检测检测PCRPCRPCRPCR产产产产物物物物DNADNADNADNA片段中的点突片段中的点突片段中的点突片段中的点突变变变变的技的技的技的技术术术术，其步，其步，其步，其步骤为骤为骤为骤为，用一，用一，用一，用一对对对对引物引物引物引物对对对对基因基因基因基因组组组组DNADNADNADNA进进进进行行行行扩扩扩扩增，增，

82、增，增，PCRPCRPCRPCR产产产产物物物物变变变变性后，再性后，再性后，再性后，再经经经经非非非非变变变变性胶性胶性胶性胶电电电电泳，尽而泳，尽而泳，尽而泳，尽而检检检检测单链测单链测单链测单链点突点突点突点突变变变变。该该该该技技技技术术术术在人在人在人在人类遗传类遗传类遗传类遗传病和癌症的点突病和癌症的点突病和癌症的点突病和癌症的点突变变变变位点的位点的位点的位点的检测检测检测检测中曾中曾中曾中曾发挥发挥发挥发挥重要作用。重要作用。重要作用。重要作用。 精选ppt(10) SNP(Simple nucleotide polymorphism)(10) SNP(Simple nucle

83、otide polymorphism)(10) SNP(Simple nucleotide polymorphism)(10) SNP(Simple nucleotide polymorphism)单单单单核核核核苷酸多苷酸多苷酸多苷酸多态态态态性性性性 在基因在基因在基因在基因组组组组水平上由水平上由水平上由水平上由单单单单个核苷酸的个核苷酸的个核苷酸的个核苷酸的变变变变异所引起的异所引起的异所引起的异所引起的DNADNADNADNA序列的多序列的多序列的多序列的多态态态态性，只涉及到性，只涉及到性，只涉及到性，只涉及到单单单单个碱基的个碱基的个碱基的个碱基的变变变变异异异异( ( ( (转

84、换转换转换转换或或或或颠换颠换颠换颠换) ) ) )，也可由碱基的插入或缺失所致。被称，也可由碱基的插入或缺失所致。被称，也可由碱基的插入或缺失所致。被称，也可由碱基的插入或缺失所致。被称为为为为第第第第三代分子三代分子三代分子三代分子遗传标记遗传标记遗传标记遗传标记。精选ppt SNPSNP检测检测方法方法: : 测测序、序、RFLPRFLP、SSCPSSCP、等位基因特、等位基因特异的寡聚核苷酸异的寡聚核苷酸杂杂交交(ASO)(ASO)、基因芯片技、基因芯片技术术等。等。 PCR-PCR-PCR-PCR-SSCPSSCPSSCPSSCP的的的的应应应应用用用用举举举举例例例例 PCRPCR

85、扩扩增不同增不同样样本的本的DNADNA片片段；段；PCRPCR产产物的物的变变性；非性；非变变性凝胶性凝胶电电泳；根据泳；根据单链单链单链单链构象多构象多构象多构象多态态态态性性性性检测检测检测检测点突点突点突点突变变变变。 SNPSNP技技术术的的应应用：用：用于构建高密度用于构建高密度遗传连锁图谱遗传连锁图谱；进进行致病基因以及人行致病基因以及人类类起源、迁移、起源、迁移、进进化的研究；化的研究；用于家畜用于家畜遗传遗传育种研究以及育种研究以及遗传图谱遗传图谱和物理和物理图谱图谱的的绘绘制。制。 精选ppt99.9%的一致性，0.1的差异 从志愿从志愿者身上取得者身上取得了了DNADNA

86、样样本，本，这这些志愿者些志愿者分分别别是欧洲、是欧洲、非洲和中国非洲和中国人的后裔。人的后裔。 精选ppt2.1 RACE 2.1 RACE 技技术术（rapid amplification of cDNA ends, rapid amplification of cDNA ends, cDNAcDNA末端的快速末端的快速扩扩增）增） RACERACE是根据已知序列以是根据已知序列以PCRPCR快速快速扩扩增增cDNAcDNA的的55和和33末端序末端序列的列的技技术术。可分。可分为为3-RACE3-RACE和和5-RACE5-RACE两种两种。3- RACE3- RACE和和5- 5- R

87、ACERACE都需先将都需先将mRNAmRNA反反转录为转录为第一第一链链cDNAcDNA。在。在3- RACE3- RACE中，中，cDNAcDNA的合成起始于的合成起始于mRNAmRNA的的ploy(A)ploy(A)尾，由含有尾，由含有oligo(dT)oligo(dT)的接的接头头引物引引物引发发合成第一合成第一链链cDNAcDNA，然后用，然后用3-3-锚锚定引物和一个定引物和一个55基因特异性基因特异性引物（引物（gene specific primer, GSPgene specific primer, GSP）进进行行扩扩增，可得到增，可得到cDNAcDNA的的33末端序列。在

88、末端序列。在5- RACE5- RACE中，先用一个中，先用一个GSPGSP引引发发第一第一链链cDNAcDNA的的合成，然后在第一合成，然后在第一链链cDNAcDNA的的33端加上人工端加上人工锚锚定序列，最后用定序列，最后用55锚锚定引物和定引物和GSPGSP下游引物下游引物进进行行扩扩增，得到增，得到cDNAcDNA的的55末端序列。最末端序列。最后，从后，从2 2个有相互重叠序列的个有相互重叠序列的33和和 5-RACE 5-RACE产产物中物中获获得全得全长长cDNAcDNA，或者通，或者通过过分析分析RACERACE产产物序列，合成相物序列，合成相应应引物引物, ,再再扩扩增出全增

89、出全长长cDNAcDNA。 意意义义：根据已得到的不完整的：根据已得到的不完整的cDNAcDNA序列序列设计设计引物引物对对mRNAmRNA的的33端和端和55端端进进行行扩扩增，可增，可获获得全得全长长的的cDNAcDNA克隆。克隆。 2 2 基因克隆技基因克隆技术简术简介介精选ppt5- GACTCGAGTCGACATCGA(T)17 - 3 Xho I Sal I Cla IOligo(dT) adaptor primerAAAAAAAAAAATCGATGTCGACTCGAGTC-3TTTTTTTTTTTAGCTACAGCTGAGCTCAG-5reverse transcriptionP

90、CRAAAAAAAAAATCGATGTCGACTCGAGTC-3TTTTTTTTTTAGCTACAGCTGAGCTCAG-5GSPadaptor primerAAAAAAAAAA-3TTTTTTTTTTTAGCTACAGCTGAGCTCAG-5mRNARE siteRE siteRE sitedigest with restriction enzymes and clone3-3-RACERACE精选pptGSP1AAAAAAAAAA-31. reverse transcription3. Anneal primersand do PCRmRNARE siteRE sitedigest wit

91、h restriction enzymes and clone5-capremove RNA and GSP1CCCCC2. terminal transferase+ dCTP3-CCCCC5-GACTCGAGTCGACATCGA(G)17-3 Xho I Sal I Cla I5-GACTCGAGTCGACATCGAGGGGG-3GSP2 CCCCC5-GACTCGAGTCGACATCGAGGGGGadaptor primer5-5-RACERACE精选ppt2.2 2.2 图图位克隆法（位克隆法（map-based cloningmap-based cloning）与染色体）与染色体步移

92、（步移（genomic DNA Walkinggenomic DNA Walking）(1) (1) 图图位克隆法（位克隆法（map-based clonigmap-based clonig）, ,定位克隆定位克隆（positional cloningpositional cloning） 首先，将目的基因定位到某个染色体的特定位首先，将目的基因定位到某个染色体的特定位点，并在其两点，并在其两侧侧确定确定紧紧密密连锁连锁的的RFLPRFLP或或RAPDRAPD分子分子标标记记。其次。其次, ,利用与目的基因最利用与目的基因最紧紧密密连锁连锁的一的一对对分子分子标标记记作探作探针针，通，通过过染

93、色体步移技染色体步移技术术将位于将位于这这两个两个标记标记之之间间的基因片段克隆并分离出来。最后的基因片段克隆并分离出来。最后, ,根据基因功根据基因功能互作原理能互作原理鉴鉴定目的基因。定目的基因。 是分离未知性状目的基因的一种好方法。从理是分离未知性状目的基因的一种好方法。从理论论上上说说，所有具有某种表，所有具有某种表现现型的基因都可以通型的基因都可以通过该过该方法克隆得到。方法克隆得到。 精选ppt(a)构构建建起起始始克克隆隆的的限限制制图图；(b)亚亚克克隆隆B-H限限制制片片段段；(c)用用放放射射性性标标记记B-H片片段段作作探探针针筛筛选选一一步步克克隆隆；(d)构构建建一一

94、步步克克隆隆的的限限制制图图；(e)亚亚克克隆隆H-E片片段段；(f)放放射射性性标标记记H-E片片段段作作探探针针筛筛选选二二步步克克隆隆。如如此此反反复复重重复复多多次次，直直至至获获得得目目的的克克隆隆。图图中中B，E，H分分别别代代表表核核酸酸内内切切限限 制制 酶酶 BamHI、 EcoRI和和Hind。RELP克隆克隆目的目的基因基因起始克隆起始克隆E H BBHBHHE32P(a)(b)(c)(d)(e)32P(f)目的基因克隆目的基因克隆多次重复多次重复(a) (c)步步骤骤，逐，逐步逼近目的基因步逼近目的基因精选ppt(2) (2) 染色体步移染色体步移(chromosome

95、 walking)(chromosome walking) 是根据已知的是根据已知的DNADNA序列得到其序列得到其侧侧翼序列的技翼序列的技术术。用第一用第一个重个重组组子克隆插入片段中的一段子克隆插入片段中的一段DNADNA序列作序列作为为探探针针，（通，（通过过杂杂交法或交法或PCRPCR法，如反向法，如反向PCRPCR）从文）从文库库中中筛查筛查第二个重第二个重组组子克子克隆，隆，该该克隆插入片段含有与探克隆插入片段含有与探针针重叠的序列和染色体重叠的序列和染色体DNADNA的的其它序列。再用新得的插入片段的末端部分作其它序列。再用新得的插入片段的末端部分作为为探探针针，去，去进进一步一步筛查筛查文文库库。重复以上操作，得到的插入片段序列。重复以上操作，得到的插入片段序列长长度逐度逐步延伸，最后可以步延伸，最后可以“步移步移”到待克隆的到待克隆的DNADNA序列。序列。精选pptContigs are linked by sequencing the ends of large DNA fragments精选ppt谢谢谢谢！精选ppt