第四章核酸化学

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1、第四章第四章 核酸化学核酸化学 主要内容：主要内容： 主要介绍碱基、核苷、核苷酸和核酸的结构、主要介绍碱基、核苷、核苷酸和核酸的结构、性质和功能，核酸的分离、提纯、鉴定等。性质和功能，核酸的分离、提纯、鉴定等。核蛋白核蛋白 磷酸磷酸 核苷核苷 碱基碱基 戊糖戊糖 蛋白质蛋白质 核酸是由几十个甚至几千万个核酸是由几十个甚至几千万个核苷酸核苷酸聚聚合而成的合而成的具有一定空间结构具有一定空间结构的大分子化合物。的大分子化合物。 核酸核酸核苷酸核苷酸 一、核酸的概念和重要性一、核酸的概念和重要性 （一）核酸的概念（一）核酸的概念 核酸英文名核酸英文名nucleic acid（NA） 1868年瑞士年

2、瑞士F. Miescher（米歇尔）发现了核酸。米歇尔）发现了核酸。（二）核酸的重要性（二）核酸的重要性 二、核酸的类别、分布和组成二、核酸的类别、分布和组成 （一）类别（一）类别 nucleic acid ribonucleic acid, RNA deoxyribonucleic acid, DNA （二）分布（二）分布 （三）组成（三）组成 1碱基（碱基（base）：）：又称含氮碱又称含氮碱 （1）嘧啶碱（）嘧啶碱（pyrimidine, Py） （2）嘌呤碱（）嘌呤碱（purine, Pu） 其它嘌呤（核酸的代谢产物）：其它嘌呤（核酸的代谢产物）：黄嘌呤、次黄嘌呤、尿酸等黄嘌呤、次黄嘌

3、呤、尿酸等 （3）修饰碱基（）修饰碱基（modified base）：）： 也称稀有碱基（也称稀有碱基（minor base） （4 4）碱基的性质）碱基的性质 一般的物理性质一般的物理性质 互变异构现象互变异构现象 uracil酮式 uracil烯醇式 碱基的紫外吸收碱基的紫外吸收 最大吸收峰在最大吸收峰在260nm附近附近 碱基的解离碱基的解离 2 2戊糖（戊糖（pentosepentose） （1 1）结构）结构 D核糖核糖D2脱氧核糖脱氧核糖D2O甲基核糖甲基核糖（2 2）性质）性质 氧化反应氧化反应 碱水解碱水解 2-核苷酸3-核苷酸 混合物 颜色反应颜色反应 D-核糖浓HCl 绿色

4、（苔黑酚法）FeCl3D-2-脱氧核糖 蓝色（二苯胺法）H+3磷酸（磷酸（phosphoric acid） 三、核苷、核苷酸三、核苷、核苷酸 （一）核苷（一）核苷（nucleosidenucleoside） 1 1核苷的结构核苷的结构 核苷：含核苷：含N N苷，苷，-苷苷 核苷中戊糖与碱基的连接方式：核苷中戊糖与碱基的连接方式： 腺嘌呤核苷（adenosine）胞嘧啶脱氧核苷（deoxycytidne）核苷核苷 核糖核苷（核苷）：核糖核苷（核苷）：A、G、C、U 脱氧核糖核苷（脱氧核苷）：脱氧核糖核苷（脱氧核苷）：dA、dG、dC、dT 命名，简写符号命名，简写符号 天然核苷：一般为反式构象天

5、然核苷：一般为反式构象 2修饰核苷（修饰核苷（modified nucleoside）： 也称稀有核苷（也称稀有核苷（minor nucleoside） 修饰核苷包括三种情况修饰核苷包括三种情况: （1）由）由修饰碱基修饰碱基和糖组成的核苷和糖组成的核苷 （2）由非修饰碱基和）由非修饰碱基和2O甲基核糖甲基核糖组成的核苷组成的核苷 （3）由碱基与糖）由碱基与糖连接方式特殊连接方式特殊的核苷的核苷 （1）（2）（3）() 还有一些核苷，它们的碱基不是嘌呤环，但可还有一些核苷，它们的碱基不是嘌呤环，但可把它们看作是鸟苷的衍生物，如把它们看作是鸟苷的衍生物，如Y核苷、核苷、Q核苷。核苷。 修饰核苷的

6、简写符号修饰核苷的简写符号 少数修饰核苷用单字符号如少数修饰核苷用单字符号如D、I；但大多数修饰但大多数修饰核苷是将碱基取代基、取代位置和取代数目写在核苷单字核苷是将碱基取代基、取代位置和取代数目写在核苷单字符号的左边，用小写英文字母代表取代基。符号的左边，用小写英文字母代表取代基。 取代基用下列小写英文字母表示取代基用下列小写英文字母表示 :甲基甲基m 乙酰基乙酰基ac 氨基氨基n 甲硫基甲硫基ms 羟基羟基o或或h 硫基硫基s 异戊烯基异戊烯基i 羧基羧基c 例：例：注意：注意：例例: 2O甲基腺苷甲基腺苷 Am 含修饰核糖的核苷即含修饰核糖的核苷即2O甲基核苷的表示方法，甲基核苷的表示方

7、法，在核苷符号的右下方注上一个小写在核苷符号的右下方注上一个小写m。3核苷的性质核苷的性质 （1）物理性质）物理性质 （2）互变异构现象）互变异构现象 （3）紫外吸收：）紫外吸收：OD260 （4）两性解离）两性解离 AdeACytCGuaGpKa 4.13.634.44.13.31.6（二）核苷酸（二）核苷酸（nucleotide, Nt） 1核苷酸的结构核苷酸的结构 （1）（核糖）核苷酸（）（核糖）核苷酸（ribonucleotide）：）： 2，3，5一核糖核苷酸一核糖核苷酸(2AMP)(3AMP)(5AMP)3，5一脱氧核糖核苷酸一脱氧核糖核苷酸Deoxyadenosine 3 mon

8、phosphate (3 dAMP)Deoxyadenosine 5 monphosphate (5 dAMP)（2）脱氧（核糖）核苷酸（）脱氧（核糖）核苷酸（deoxyribonucleotide）：）：2 2核苷酸的性质核苷酸的性质 （1）一般物理性质）一般物理性质 （2）互变异构现象）互变异构现象 （3）紫外吸收）紫外吸收 4 4种单核苷酸吸收光谱的标准比值种单核苷酸吸收光谱的标准比值 250/260 280/260 290/2602.07.02.07.02.07.05CMP0.460.842.100.991.550.305AMP0.850.800.220.150.030.0035UMP

9、0.740.730.380.400.030.035GMP1.221.150.680.680.400.28光密度光密度 比值比值pH核苷酸核苷酸 A260：样品在样品在260nm处的吸收值处的吸收值 E260：所测核苷酸的摩尔消光系数所测核苷酸的摩尔消光系数 C： 核苷酸样品的浓度（核苷酸样品的浓度（mg/ml） 核苷酸核苷酸(mg) = Mr N V胞嘧啶核苷酸的解离胞嘧啶核苷酸的解离 （4）核苷酸的两性解离和等电点）核苷酸的两性解离和等电点 4种核苷酸的解离曲线种核苷酸的解离曲线 可在可在pH2.05.0之间分离各种核苷酸之间分离各种核苷酸 pH3.5时各核苷酸所带电荷时各核苷酸所带电荷 核

10、苷酸核苷酸 磷酸基电荷磷酸基电荷 碱基的电荷碱基的电荷 净电荷净电荷 AMP1+0.540.46GMP1+0.050.95CMP1+0.840.16UMP1+01（三）核苷酸的重要衍生物（三）核苷酸的重要衍生物 1ATP类的高能磷酸化合物类的高能磷酸化合物 AMPADPATP2环状核苷酸环状核苷酸 细胞内细胞内 :ATP cAMP + PPi 磷酸二酯酶磷酸二酯酶 5AMP 腺苷酸环化酶腺苷酸环化酶 （AC） 3核苷多磷酸类核苷多磷酸类 四、四、DNA的结构的结构 （一）（一）DNA的一级结构的一级结构 1DNA分子中核苷酸的连接方式分子中核苷酸的连接方式 RNA简写方法：线条式、文字式简写方

11、法：线条式、文字式 2DNA分子中核苷酸的排列顺序分子中核苷酸的排列顺序 英国英国Sanger 1975年加减法，年加减法，1977年末端终止法年末端终止法 美国美国Maxam和和Gilbert 1977年化学断裂法年化学断裂法 （1）酶法（双脱氧法、末端终止法）酶法（双脱氧法、末端终止法） （2）化学法（化学断裂法）化学法（化学断裂法） 利用多核苷酸激酶将利用多核苷酸激酶将3232P P标记在标记在DNADNA的的55末端，末端，用特异的化学试剂修饰用特异的化学试剂修饰DNADNA分子中的不同碱基，然分子中的不同碱基，然后用特异的试剂在特异的地方断裂，产生长短不后用特异的试剂在特异的地方断裂

12、，产生长短不同的同的DNADNA片段，再进行电泳，放射自显影，即可读片段，再进行电泳，放射自显影，即可读出出DNADNA序列。序列。（二）（二）DNA的二级结构的二级结构 1提出提出DNA双螺旋结构模型的根据双螺旋结构模型的根据 （1）x光衍射分析光衍射分析 20世纪世纪40年代年代Astbury 1952年年M.Wilkins （2）DNA碱基组成的定量分析碱基组成的定量分析 20世纪世纪40年代年代chargaff规则规则 DNA碱基组成有种的特异性，但没有组织、器官特异性。碱基组成有种的特异性，但没有组织、器官特异性。 A=T；G=C；A+G=T+C 2DNA双螺旋结构模型（双螺旋结构模

13、型（doublehelical structure） 1953年年Watson和和Crick提出了提出了DNA双螺旋结构。双螺旋结构。 （3）碱基、糖、磷酸的位置。）碱基、糖、磷酸的位置。 DNA双螺旋结构要点：双螺旋结构要点： （1）两条反向平行的多核苷）两条反向平行的多核苷 酸链，右手双螺旋。酸链，右手双螺旋。 （4）双螺旋的直径，螺距。）双螺旋的直径，螺距。 （2 2）大沟（深沟）大沟（深沟） 小沟（浅沟）小沟（浅沟） （5）碱基配对）碱基配对 （6）碱基的序列）碱基的序列 稳定稳定DNA双螺旋结构的化学键双螺旋结构的化学键 （1）互补碱基对之间的氢键）互补碱基对之间的氢键 （2）碱基堆

14、积力（）碱基堆积力（basestacking forces） （3）磷酸基上的负电荷与介质中的阳离子之间形成的离子键）磷酸基上的负电荷与介质中的阳离子之间形成的离子键 3DNA双螺旋的种类双螺旋的种类 Watson Crick DNA双螺旋结构（双螺旋结构（B型型DNA） 当当DNA钠盐纤维钠盐纤维相对湿度相对湿度和和盐的种类盐的种类改变时，改变时，DNA的构象发生改变。的构象发生改变。 不同不同DNA纤维的空间结构纤维的空间结构 类型类型结晶状态结晶状态ANa盐，相对湿度盐，相对湿度75%时结晶时结晶BNa盐，相对湿度盐，相对湿度92%时结晶时结晶C锂盐，相对湿度锂盐，相对湿度66%时结晶时

15、结晶ADNA： 与与BDNA相同处：相同处：与与BDNA不同点不同点 :（1）螺体宽而短，直径）螺体宽而短，直径2.55nm；11个核苷酸一圈，螺距个核苷酸一圈，螺距2.46nm。 （2）碱基的倾角大一些：倾角）碱基的倾角大一些：倾角19。 ADNA：RNA分子中的双螺旋区；分子中的双螺旋区；DNARNA杂交分子。杂交分子。 ADNA和和BDNA之间可以相互转换，推测在转录时，之间可以相互转换，推测在转录时，DNA分子发生分子发生BA的转变。的转变。 反向的两条多核苷酸链，右手螺旋。反向的两条多核苷酸链，右手螺旋。C型型DNA的一些数据与的一些数据与B型型DNA很相似。很相似。 CDNA：4D

16、NA双螺旋的研究进展双螺旋的研究进展 （1）ZDNA 1979年美国年美国ARich等人发现了左旋等人发现了左旋DNA（左手左手DNA双螺旋结构）双螺旋结构）晶体晶体X光衍射分析光衍射分析 d(Cp Gp Cp Gp Cp Gp)ZDNA的特点的特点 ZDNA的生物功能：的生物功能：与基因表达、基因调控有关。与基因表达、基因调控有关。 （2）三螺旋）三螺旋DNA （3）四螺旋）四螺旋DNA DNA 双链线状双链线状 双链环状双链环状 单链线状：动物病毒单链线状：动物病毒MVM 单链环状：噬菌体单链环状：噬菌体X174 真核细胞染色体真核细胞染色体DNA 噬菌体噬菌体T2，T5，T7，P22 E

17、Coli染色体染色体DNA 线粒体线粒体DNA 叶绿体叶绿体DNA 多瘤病毒多瘤病毒DNA，病毒病毒SV40DNA 噬菌体噬菌体和和X174的复制型的复制型 （三）（三）DNA的三级结构的三级结构 噬菌体噬菌体T2DNA长约长约50m Ecoli DNA 长约长约1mm 人生殖细胞人生殖细胞DNA长约长约1m 双链环状双链环状DNA（double stranded cyclic DNA, DSCDNA） : 双链环状双链环状DNA在自然界是广泛存在的，如一些病毒在自然界是广泛存在的，如一些病毒DNA、一些噬菌体一些噬菌体DNA、细菌质粒细菌质粒DNA、线粒体和叶线粒体和叶绿体绿体DNA等。等。

18、 1共价闭合环状共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA, cccDNA）的的超螺旋超螺旋结构（结构（superhelical structure） 形成超螺旋的基础形成超螺旋的基础: DNA双螺旋的扭曲形成超螺旋双螺旋的扭曲形成超螺旋 （superhelix）负超螺旋负超螺旋 正超螺旋正超螺旋超螺旋超螺旋DNA的性质的性质 结构紧密，粘度较低，浮力密度大，沉降速度快。结构紧密，粘度较低，浮力密度大，沉降速度快。变变性性2开环开环DNA（open circular DNA, ocDNA）也称松环也称松环DNA（relaxed circular DNA,

19、rcDNA）+3连环连环DNA（Catenanes DNA） 单体单体二聚体二聚体（四）真核细胞染色体（四）真核细胞染色体DNA结构结构 1重复序列重复序列 （repeated sequence ） （1）高度重复序列（）高度重复序列（highly repeated sequence） 卫星卫星DNA（satellite DNA） 基因组（基因组（genome）主体主体DNA（bulk DNA） 卫星卫星DNA（satellite DNA） （2）中度重复序列（）中度重复序列（moderately repeated sequence） （3）单一序列（）单一序列（unique sequence

20、） 2 2回文结构（回文结构（palindromicpalindromic structure structure） (1) (1) 回文结构回文结构 回文结构也称反向重复（回文结构也称反向重复（inverted repeats）(2) (2) 发夹形和十字形发夹形和十字形五、五、RNA的结构的结构 （一）（一）RNA的类别的类别 1核糖体核糖体RNA（ribosomal RNA, rRNA） 2转移转移RNA（transfer RNA, tRNA） 3信使信使RNA（messenger RNA, mRNA） 4其它类别的其它类别的RNA （1）病毒）病毒RNA（Viral RNA, rRNA

21、） （2）核内）核内RNA（nuclear RNA, nRNA） 不均一核不均一核RNA（heterogeneous nuclear RNA,HnRNA） 小分子核小分子核RNA（small nuclear RNA, sn RNA） 小分子核仁小分子核仁RNA（small nucleolar RNA, sno RNA） 染色体染色体RNA（chromosomal RNA, ch RNA） （3）线粒体）线粒体RNA（mitochondrial RNA, mit RNA） （4）叶绿体）叶绿体RNA（chloroplast RNA, chlRNA或或ctRNA） （二）（二）RNA的一级结构的一

22、级结构 1RNA分子中核苷酸之间的连接方式分子中核苷酸之间的连接方式3,5磷酸二酯键磷酸二酯键 2RNA分子中核苷酸的排列顺序分子中核苷酸的排列顺序 酵母酵母tRNAAla小片段重叠法小片段重叠法 直接阅读法（直读法）直接阅读法（直读法） 19651965年年3几类几类RNA的一级结构的一级结构 （1） tRNA的一级结构的一级结构 tRNA一级结构的共同点一级结构的共同点: Mr较小（较小（Mr25000），），沉降常数沉降常数4S。 各种各种tRNA的链长很接近，一般在的链长很接近，一般在7393个核苷酸之间。个核苷酸之间。 tRNA分子中约分子中约20多个位置上的核苷酸是保守的（不变和半

23、不变的）多个位置上的核苷酸是保守的（不变和半不变的） 各种各种tRNA的的3一端为一端为CCA；5一端大多数为一端大多数为pG，少数为少数为pC。 tRNA分子中含有较多的修饰成分。分子中含有较多的修饰成分。 （2）rRNA的一级结构的一级结构 原核生物核糖体原核生物核糖体 70S50S30S5S rRNA， 23S rRNA34种蛋白质种蛋白质16S rRNA21种蛋白质种蛋白质真核生物核糖体真核生物核糖体 80S60S40S5SrRNA，5.8SrRNA，28SrRNA49种蛋白质种蛋白质18SrRNA33种蛋白质种蛋白质（3）mRNA的一级结构的一级结构 真核生物真核生物mRNA的一级结

24、构可用下式表示的一级结构可用下式表示 :5 帽子帽子 5非密码区非密码区 密码区密码区3 非密码区非密码区 polyA 5cap：m7G(5)pppNmp 5cap cap0: m7G(5)pppNp cap1: m7G(5)pppNmpNp cap2: m7G(5)pppNmpNmpNp 5cap的功能的功能 (1) (1) 防止防止mRNAmRNA被核酸酶降解。被核酸酶降解。(2) (2) 为为mRNAmRNA翻译活性所必需。翻译活性所必需。(3) (3) 与蛋白质合成的正确起始有关。与蛋白质合成的正确起始有关。3polyA : polyA的残基数的残基数20200个，或更多。个，或更多。

25、polyA的功能的功能 (1) (1) 保护保护mRNAmRNA，免受核酸外切酶的作用。免受核酸外切酶的作用。(2) (2) 与翻译有关，没有与翻译有关，没有polyApolyA翻译活性降低。翻译活性降低。(3) (3) 与与mRNAmRNA从细胞核转移到细胞质有关。从细胞核转移到细胞质有关。RNA前体前体 成熟成熟RNA（有功能的有功能的RNA） 断裂、修剪、修饰断裂、修剪、修饰 （三）（三）RNA的二级结构的二级结构 大多数天然大多数天然RNA是一条单链，通过自身回折形成部分螺旋区，是一条单链，通过自身回折形成部分螺旋区，部分非螺旋区。部分非螺旋区。 少数病毒少数病毒RNA如水稻矮缩病毒、

26、呼肠孤病毒、伤瘤病毒等如水稻矮缩病毒、呼肠孤病毒、伤瘤病毒等RNA是双链螺旋，类似于是双链螺旋，类似于DNA的双螺旋结构。的双螺旋结构。 RNA中双螺旋结构稳定的因素主要是碱基堆中双螺旋结构稳定的因素主要是碱基堆积力，其次是氢键。积力，其次是氢键。 1tRNA的二级结构的二级结构 （1）aa接受臂（接受臂（amino acid arm） （2）二氢尿嘧啶环）二氢尿嘧啶环 （dihydrouridine loop, DHU loop） （3）反密码环（）反密码环（anticodon loop） （4）额外环（）额外环（extra loop） （5）TC环（环（TC loop） 1980年牛心线粒

27、体年牛心线粒体tRNAser只有只有63个核苷酸，个核苷酸，沉降常数沉降常数3S，缺少缺少D环和环和D臂，呈二叶草型。臂，呈二叶草型。 近年来发现近年来发现2种线虫线粒体种线虫线粒体tRNA也不是标也不是标准的三叶草结构。准的三叶草结构。 2rRNA的二级结构的二级结构 3mRNA的二级结构的二级结构 （四）（四）RNA的三级结构的三级结构 tRNA的三级结构的三级结构 六、核酸酶类六、核酸酶类包括核酸水解酶、合成酶、连接酶等。包括核酸水解酶、合成酶、连接酶等。 （一）核酸水解酶的分类（一）核酸水解酶的分类 1底物：核糖核酸酶（底物：核糖核酸酶（ribonuclease, RNase） 脱氧核

28、糖核酸酶（脱氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease, DNase） 2作用方式：核酸内切酶（作用方式：核酸内切酶（endonuclease）3按磷酸二酯键断裂的方式按磷酸二酯键断裂的方式 4其它：如双链酶、单链酶等其它：如双链酶、单链酶等 核酸外切酶（核酸外切酶（exonuclease）（二）核糖核酸酶类（二）核糖核酸酶类 1牛胰核糖核酸酶（牛胰核糖核酸酶（pancreatic ribonuclease, 简称简称RNase A或或RNase I） 2核糖核酸酶核糖核酸酶T1（ribonuclease T1，简称简称RNase T1） 3核糖核酸酶核糖核酸酶T2（ribonuclea

29、se T2，简称简称RNase T2） 主要作用点为主要作用点为Ap残基，水解速度残基，水解速度AUGC AUCGAG（三）脱氧核糖核酸酶（三）脱氧核糖核酸酶 1牛胰脱氧核糖核酸酶牛胰脱氧核糖核酸酶 （pancreatic deoxyribonuclease简称简称DNase I） 2牛脾脱氧核糖核酸酶牛脾脱氧核糖核酸酶 （spleen deoxyribonuclease, 简称简称DNase II） 3限制性内切酶（限制性内切酶（restriction endonuclease） 简称限制酶简称限制酶 限制性内切酶主要降解外源的未经特殊修饰的限制性内切酶主要降解外源的未经特殊修饰的DNA，对

30、自身起了保护作用。对自身起了保护作用。发现概况发现概况: （1）限制性内切酶的特征）限制性内切酶的特征 具有严格的碱基专一性，有专一的识别顺序、切点具有严格的碱基专一性，有专一的识别顺序、切点 粘性未端，平整末端粘性未端，平整末端 （2）限制性内切酶的命名）限制性内切酶的命名 ECoRI （3）限制性内切酶举例）限制性内切酶举例 （四）非专一性核酸酶类（四）非专一性核酸酶类（nonspecific nuclease） 介绍二种外切酶介绍二种外切酶 1蛇毒磷酸二酯酶（蛇毒磷酸二酯酶（venom phosphodiesterase） 5 核苷酸核苷酸蛇毒磷酸二酯酶对末端磷酸基有严格的要求蛇毒磷酸二

31、酯酶对末端磷酸基有严格的要求 寡核苷酸寡核苷酸 水解速度水解速度 最快最快较慢，水解速度降低较慢，水解速度降低10倍倍最慢，几乎不作用，水解速最慢，几乎不作用，水解速度再降低度再降低100倍倍 橘青霉磷酸二酯酶专一性：橘青霉磷酸二酯酶专一性：与蛇毒磷酸二酯酶相同与蛇毒磷酸二酯酶相同 2牛脾磷酸二酯酶牛脾磷酸二酯酶 对末端磷酸基的要求与蛇毒磷酸二酯酶相反对末端磷酸基的要求与蛇毒磷酸二酯酶相反 +3核苷酸核苷酸（五）磷酸单酯酶（五）磷酸单酯酶 将单核苷酸或寡核苷酸末端的磷酸单酯键切开，将单核苷酸或寡核苷酸末端的磷酸单酯键切开，得到磷酸和其它产物得到磷酸和其它产物 1特异性磷酸单酯酶特异性磷酸单酯酶

32、 2非特异性磷酸单酯酶非特异性磷酸单酯酶 磷酸基无论在磷酸基无论在3或或5位，都能水解，如位，都能水解，如E. Coli磷酸单酯酶磷酸单酯酶 （1） 磷酸基连在磷酸基连在5位才能水解，如牛精液位才能水解，如牛精液5核苷酸酶核苷酸酶 （2） 磷酸基连在磷酸基连在3位才能水解，如麦芽位才能水解，如麦芽3一核苷酸酶一核苷酸酶 七、核酸的性质和最常用的研究方法七、核酸的性质和最常用的研究方法 （一）一般性质：分子大小、性状、溶解度。（一）一般性质：分子大小、性状、溶解度。 分子大小：分子大小：DNA Mr 1061010或更大或更大性状：性状： DNA为白色纤维状固体，而为白色纤维状固体，而RNA为白

33、色粉末。为白色粉末。 溶解度：溶解度：DNA和和RNA均不溶于一般的有机溶剂，微溶于水，均不溶于一般的有机溶剂，微溶于水， 但它们的钠盐在水中溶解度较大。但它们的钠盐在水中溶解度较大。 RNA Mr 104106或更大或更大 （二）粘度（二）粘度 （三）酸碱性质（三）酸碱性质 （四）紫外吸收（四）紫外吸收 由于核酸中碱基的共轭双键，所以对紫外有强烈吸由于核酸中碱基的共轭双键，所以对紫外有强烈吸收，最大吸收峰在收，最大吸收峰在260260nmnm附近，利用这一特性可进行核酸附近，利用这一特性可进行核酸的定量测定。的定量测定。 1紫外分光光度法紫外分光光度法 首先根据首先根据A260/A280的比

34、值判断核酸样品的纯度的比值判断核酸样品的纯度纯纯DNA：A260/A280=1.8 纯纯RNA：A260/A280=2.0（若样品中含有杂蛋白或苯酚，则（若样品中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明显降低）比值明显降低）纯的核酸样品可根据纯的核酸样品可根据260nm的光吸收值算出其含量的光吸收值算出其含量若若260nm光吸收值为光吸收值为1相当于相当于50g/ml双螺旋双螺旋DNA或相当于或相当于40g/ml单链单链DNA或或RNA或相当于或相当于20g/ml寡核苷酸。寡核苷酸。2摩尔磷消光系数（摩尔磷消光系数（molar absorptivity）法法 A：样品的光吸收值样品的光吸收

35、值 C：每升溶液中磷的摩尔数每升溶液中磷的摩尔数 L：光径光径 在在pH7.0时；时；DNA的的 为为6600, RNA的的 为为77007800。 ：摩尔磷消光系数，也称摩尔磷吸光系数：摩尔磷消光系数，也称摩尔磷吸光系数 知道了磷的含量就可知核酸的含量知道了磷的含量就可知核酸的含量3增色效应与减色效应增色效应与减色效应 增色效应（增色效应（hyperchromic effect） 减色效应（减色效应（hypochromic effect） （五）沉降特性（五）沉降特性 1核酸浮力密度的测定核酸浮力密度的测定 浮力密度：经密度梯度沉降平衡法测出的密度浮力密度：经密度梯度沉降平衡法测出的密度 氯

36、化绝（氯化绝（CsCl）密度梯度沉降平衡密度梯度沉降平衡 用用12个已知浮力密度的标准个已知浮力密度的标准DNA样品作参考样品作参考 式中式中 ：未知未知DNA的密度的密度 0：标准标准DNA的密度的密度 ：角速度（弧度角速度（弧度/秒）秒） r： 未知未知DNA与转轴之间的距离与转轴之间的距离 r0：已知已知DNA与转轴之间的距离与转轴之间的距离 2DNA中中GC含量的测定含量的测定 GC对的含量与浮力密度之间呈正比关系对的含量与浮力密度之间呈正比关系 RolfeMeselson导出了如下公式：导出了如下公式： =0.100（GC%）+1.658(g/cm3) 知道了浮力密度就可计算出知道了

37、浮力密度就可计算出GC对的含量对的含量 3核酸的构象和分离核酸的构象和分离 ：RNA环状环状DNA线状线状DNA蛋白质蛋白质 DNA 沉降沉降（六）核酸的变性、复性和杂交（六）核酸的变性、复性和杂交 1变性（变性（denaturation） 核酸变性的概念核酸变性的概念 引起核酸变性的因素引起核酸变性的因素 （1）热变性）热变性 结构：螺旋结构：螺旋线团线团 理化性质：紫外吸收理化性质：紫外吸收 粘度粘度比旋光度比旋光度 生物活性：生物活性生物活性：生物活性或丧失或丧失 （2）熔点（）熔点（Tm） Tm: 熔点，熔解温度，熔点，熔解温度， 变性温度，解链温度变性温度，解链温度 （3）影响）影响

38、Tm值的因素值的因素 DNA的均一性的均一性 DNA中中GC对的含量对的含量 经验式经验式: (GC)%=(Tm69.3)2.44 盐离子强度盐离子强度 2复性（复性（renaturation） （1）复性）复性 理化性质理化性质: 比旋光度比旋光度 粘度粘度高于高于Tm值值5 复性复性 也称退火也称退火（annealing）生物活性得到部分恢复生物活性得到部分恢复 （2）影响复性的因素）影响复性的因素 样品的性质样品的性质 DNA的浓度的浓度 DNA片段的大小片段的大小 温度温度 离子强度离子强度 （3）复性动力学）复性动力学 DNA的复性过程是一种双分子反应的复性过程是一种双分子反应 S：

39、single strand DNA D：double strand DNA 经重排，积分等经重排，积分等 式中式中 C0：t=0时，起始时，起始DNA的浓度（的浓度（mol/L） C：t时间时，单链时间时，单链DNA的浓度（的浓度（mol/L） k：复性反应常数（复性反应常数（L/molsec） t：复性时间（复性时间（sec） CC0= 11+kC0tCot : 时的时的Cot值，即指复性完成一半时的值，即指复性完成一半时的Cot值。值。 3杂交（杂交（hybridization） 核酸的杂交：是指不同来源的单链核酸之间可通过核酸的杂交：是指不同来源的单链核酸之间可通过 碱基互补形成双螺旋结

40、构。碱基互补形成双螺旋结构。 单链单链DNA与单链与单链DNA杂交（杂交（DNADNA）利用核酸杂交可检测特定的核苷酸片段或研究同源性等。利用核酸杂交可检测特定的核苷酸片段或研究同源性等。单链单链DNA与单链与单链RNA杂交（杂交（DNARNA）单链单链RNA与单链与单链RNA杂交（杂交（RNARNA）用硝酸纤维素膜作为支持物进行杂交用硝酸纤维素膜作为支持物进行杂交 1975年英国年英国E. M. Southern首创的首创的Southern blotting（Southern印迹）印迹）原理原理方法方法探针：作为检测用的已知探针：作为检测用的已知DNA序列或序列或RNA序列的片段序列的片段

41、1977年年G.K.Stark首创首创Northern blotting （Northern印迹）印迹） Western blotting（Western 印迹）印迹） （七）凝胶电泳（七）凝胶电泳 核酸研究中最常用的方法核酸研究中最常用的方法 优点：简单、快速、灵敏、成本低。优点：简单、快速、灵敏、成本低。 通过凝胶电泳通过凝胶电泳 （1）可进行核酸分离，知道核酸的纯度。）可进行核酸分离，知道核酸的纯度。 （2）测定分子大小。）测定分子大小。 （3）估计核酸的构象。）估计核酸的构象。 凝胶电泳兼有分子筛效应和电荷效应凝胶电泳兼有分子筛效应和电荷效应 1琼脂糖凝胶电泳（琼脂糖凝胶电泳（agar

42、ose gel electrophoresis） 琼脂糖凝胶电泳的迁移率主要与分子大小、胶浓度、琼脂糖凝胶电泳的迁移率主要与分子大小、胶浓度、核酸构象、电流等有关。核酸构象、电流等有关。 2聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 （polyacrylamide gel electrophoresis） 用于分析用于分析RNA或或Mr小于小于1000bp的的DNA片段片段 适用于大分子核酸，一般用于适用于大分子核酸，一般用于DNA分析。分析。 八、核酸的生物功能八、核酸的生物功能 （一）（一）DNA的生物功能的生物功能 1DNA与遗传与遗传 （1）DNA是主要的遗传物质是主要的遗传物质间接证据间接

43、证据直接证据直接证据 细菌转化作用细菌转化作用 （transformation ）肺炎球菌（肺炎球菌（pneumococcus） 1928年细菌学家年细菌学家Griffith 细菌毒性实验细菌毒性实验 1944年年Avery细菌转化实验细菌转化实验 转化作用：转化作用：转化作用的物质称转化因子转化作用的物质称转化因子 从一种细菌中得到从一种细菌中得到DNA通过一定途径进入另一种细菌，通过一定途径进入另一种细菌，从而引起后者遗传特性的改变。从而引起后者遗传特性的改变。 噬菌体感染实验噬菌体感染实验 1952年美国年美国Hershey 噬菌体感染实验噬菌体感染实验 转导作用（转导作用（transd

44、uction） 人工合成基因的表达人工合成基因的表达 （2）DNA的复制（的复制（replication） （3）DNA的转录（的转录（transcription） 2DNA与变异与变异 突变突变 染色体畸变染色体畸变 基因突变基因突变 （1）基因突变（）基因突变（genetic mutation） 基因概念的发展、补充基因概念的发展、补充 什么是基因突变什么是基因突变 基因突变的几种主要形式基因突变的几种主要形式 碱基取代（碱基取代（base substitution，也称碱基置换）也称碱基置换） A.转换（转换（transition） B.颠换（颠换（transversion） 碱基缺失（

45、碱基缺失（base deletion） 碱基插入（碱基插入（base insertion） 突变的原因突变的原因 自发突变自发突变 诱发突变如紫外线、诱发突变如紫外线、X射线、亚硝酸、烷化剂、射线、亚硝酸、烷化剂、 碱基类似物等碱基类似物等 嘧啶二聚体嘧啶二聚体 脱氨脱氨（2）基因重组（）基因重组（gene recombination） 基因的体外重组，即基因工程（基因的体外重组，即基因工程（genetic engineering） 获得目的基因获得目的基因 基因载体（基因载体（vector） 目的基因与基因载体连接形成重组目的基因与基因载体连接形成重组DNA 通过转化或其它方法将重组通过转化

46、或其它方法将重组DNA分子引入受体细胞分子引入受体细胞 被转化细胞的筛选和繁殖被转化细胞的筛选和繁殖 3. DNA与遗传性疾病、癌变的关系与遗传性疾病、癌变的关系（1）镰刀状红细胞贫血病的）镰刀状红细胞贫血病的DNA点突变点突变（2）白化病的基因缺失）白化病的基因缺失（3）癌变）癌变（二）（二）RNA的生物功能的生物功能 1RNA与蛋白质的生物合成与蛋白质的生物合成 （1）mRNA与遗传密码与遗传密码 遗传密码（遗传密码（genetic code） 密码子（密码子（codon） mRNA的主要功能的主要功能 （2）tRNA的作用的作用 tRNA的作用是多方面的，它接受氨基酸、携带氨基酸，的作用

47、是多方面的，它接受氨基酸、携带氨基酸，把氨基酸转运到核糖体上，然后按照把氨基酸转运到核糖体上，然后按照mRNA上的密码顺序上的密码顺序装配成多肽或蛋白质。装配成多肽或蛋白质。 tRNA必须识别相应的氨基酸和识别必须识别相应的氨基酸和识别mRNA上相应的密上相应的密码子。码子。 tRNA怎样识别相应的氨基酸怎样识别相应的氨基酸: 主要靠高度专一的氨主要靠高度专一的氨酰酰tRNA合成酶。合成酶。tRNA怎样识别怎样识别mRNA上相应的密码子上相应的密码子 （3）rRNA的作用的作用 2RNA与遗传与遗传 九、核酸的分离、纯化和核苷酸的制备九、核酸的分离、纯化和核苷酸的制备 （一）核酸的分离、提取通

48、则（一）核酸的分离、提取通则 为了得到完整的大分子核酸，一般要注意为了得到完整的大分子核酸，一般要注意3点点 :1保持低温（保持低温（04）。）。 2防止过酸、过碱，避免剧烈搅拌。防止过酸、过碱，避免剧烈搅拌。 3防止核酸酶的作用。防止核酸酶的作用。 抑制抑制DNase： 可加柠檬酸钠、可加柠檬酸钠、EDTA等金属螯合剂；或加去污剂等金属螯合剂；或加去污剂 ： 十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（SDS）；）；或加蛋白变性剂。或加蛋白变性剂。 抑制抑制RNase： （1）实验器皿高温，或高压灭菌，不能高压灭菌的用）实验器皿高温，或高压灭菌，不能高压灭菌的用 具用具用0.1%二乙基焦碳酸盐（二乙基焦

49、碳酸盐（diethyl pyrocarbonate, DEPC）处理。处理。 （2）加强的蛋白变性剂如硫氰酸胍、异硫氰酸胍等。）加强的蛋白变性剂如硫氰酸胍、异硫氰酸胍等。 （3）加核糖核酸酶阻抑蛋白（）加核糖核酸酶阻抑蛋白（RNasin）等等RNase的抑制剂。的抑制剂。 （二）大分子（二）大分子DNA的提取的提取 1材料的选择材料的选择 2细胞破碎细胞破碎 3DNA蛋白质（蛋白质（DNP）的提取的提取 真核细胞真核细胞DNA与蛋白质结与蛋白质结合成核蛋白（合成核蛋白（DNP），），RNA与与蛋白质结合成蛋白质结合成RNP，而且而且DNP和和RNP常常混在一起。利用常常混在一起。利用DNP和和

50、RNP在不同浓度在不同浓度NaCl中中溶解度的不同来分离溶解度的不同来分离DNP和和RNP。 可用可用1mol/LNaCl溶液提取溶液提取DNP。 相相对对溶溶解解度度NaCl（mol/L）DNP在在NaCl中的溶解度中的溶解度4 4去蛋白质去蛋白质 （1 1）SDS SDS （2 2）苯酚法）苯酚法 （3 3）氯仿法）氯仿法 （4 4）酚）酚: :氯仿氯仿: :异戊醇异戊醇25:24:1 25:24:1 5沉淀沉淀DNA 6去杂质去杂质 （1）去）去RNA （2）去多糖）去多糖 7进一步纯化进一步纯化 生物材料生物材料 DNP（RNP） DNP 纤维状纤维状DNA 较纯较纯DNA 纯纯DNA

51、 *原核生物的原核生物的DNA是裸露的，与蛋白质结合不多，分离纯化要简单些。是裸露的，与蛋白质结合不多，分离纯化要简单些。 破细胞破细胞1.0mol/L NaCl*去蛋白质去蛋白质酒精沉淀酒精沉淀去去RNA柱层析，电泳柱层析，电泳密度梯度离心密度梯度离心去去多糖多糖（三）（三）RNA的提取的提取 1不同种类不同种类RNA的提取的提取 2大分子大分子RNA的提取的提取 （1）酚提取）酚提取 （2）酚）酚氯仿氯仿SDS法法 3mRNA的提取的提取 4工业上制备工业上制备RNA （1）稀碱法）稀碱法 （2）浓盐法）浓盐法 （四）核酸纯度鉴定（四）核酸纯度鉴定 1.A260/A280 2.电泳电泳 （五）核酸含量的测定（五）核酸含量的测定 1.定磷法定磷法 2.定糖法定糖法 3.紫外吸收法紫外吸收法 （六）核苷酸的制备（六）核苷酸的制备 1碱水解碱水解 2酶水解酶水解 3.自溶法自溶法