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1、酶的分离与纯化注意事项及酶分离纯化酶的分离与纯化注意事项及酶分离纯化为什么进行酶活力和酶比活力测定为什么进行酶活力和酶比活力测定PPT制作：陈玉成，金昱资料查找：郭姗姗PPT讲解：田恩平酶的提取、分离纯化技术路线酶的提取、分离纯化技术路线细胞破碎细胞破碎酶酶提取提取酶酶分离纯化分离纯化酶酶浓缩浓缩酶酶贮存贮存动物、植物或微生物细胞动物、植物或微生物细胞发酵液发酵液离心分离，过滤分离，沉淀分离心分离，过滤分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃离，层析分离，电泳分离，萃取分离，结晶分离等。取分离，结晶分离等。酶酶的的纯化化过程，程，约可分可分为三三个阶段个阶段：(1) (1) 粗粗蛋白质蛋白质 (
2、crude (crude protein): protein): 采样采样 均均质质打破打破细胞胞 抽出全蛋白，抽出全蛋白，多使用多使用 盐盐析析沉淀沉淀法法；可以；可以粗略去除蛋白粗略去除蛋白质以外的物以外的物质。(2) (2) 部分部分纯化化 (partially (partially purified): purified): 初步的初步的纯化，化，使用各使用各钟 柱柱层层析法析法。(3) (3) 均均质酶质酶 (homogeneous): (homogeneous): 目标酶目标酶的的进进一步精制一步精制纯化，可用化，可用制制备备式式电泳电泳 或或 HPLCHPLC。酶分离纯化不同阶段
3、本章目录n n酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。n n酶提取时首先应根据酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易极性的有机溶剂中，酸性物
4、质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。溶于酸性溶剂中。n n酶都能溶解于水，通常可用酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取提取提取提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。机溶剂提取。 酶的提取：酶的提取：提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、縮短扩散距离，增大浓度差等都有利于提高酶分子的扩散速度，从而增大提取效果。 为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程中还要注意控制好温度、pH值等提取条件。
5、酶提取过程中应注意事项 ： 根据酶提取时，所采用的溶剂或溶液的不同，酶抽提的方根据酶提取时，所采用的溶剂或溶液的不同，酶抽提的方法主要有盐溶液提取，酸溶液提取，碱溶液提取，有机溶法主要有盐溶液提取，酸溶液提取，碱溶液提取，有机溶剂提取等。剂提取等。 盐溶液提取：盐溶液提取： 大多数酶在一定浓度的盐存在条件下，酶的溶解度大多数酶在一定浓度的盐存在条件下，酶的溶解度增加，即盐溶，但盐浓度不能太高，否则溶解度反而降低，增加，即盐溶，但盐浓度不能太高，否则溶解度反而降低，即盐析。故：一般采用稀盐溶液进行酶的提取，盐浓度控即盐析。故：一般采用稀盐溶液进行酶的提取，盐浓度控制在制在0.020.5mol/L
6、。 例如：用固体发酵生产的麸曲中的例如：用固体发酵生产的麸曲中的-淀粉酶，糖化酶、淀粉酶，糖化酶、蛋白酶等胞外酶，用蛋白酶等胞外酶，用0.15molL的氯化钠溶液或的氯化钠溶液或0.020.05molL的磷酸缓冲液提取；酵母醇脱氢酶用的磷酸缓冲液提取；酵母醇脱氢酶用0.50.6molL的磷酸氢二钠溶液提取；有少数酶，如霉菌产的磷酸氢二钠溶液提取；有少数酶，如霉菌产生的生的 在酶的提取过程中，为了提高提取率并防止酶变性在酶的提取过程中，为了提高提取率并防止酶变性失活，须注意以下几点：失活，须注意以下几点：n n1 1温度：温度：温度：温度：n n通常抽提温度应控制在通常抽提温度应控制在通常抽提温
7、度应控制在通常抽提温度应控制在0-10oC0-10oC（0-4 0-4 oCoC）。对某些耐温的酶，如胃蛋）。对某些耐温的酶，如胃蛋）。对某些耐温的酶，如胃蛋）。对某些耐温的酶，如胃蛋白酶等，可适当提高抽提温度，在白酶等，可适当提高抽提温度，在白酶等，可适当提高抽提温度，在白酶等，可适当提高抽提温度，在37 37 oCoC下保温抽提，效果较好。因下保温抽提，效果较好。因下保温抽提，效果较好。因下保温抽提，效果较好。因为提高温度、可提高酶的扩散速度，增加酶的溶解度，有利于酶的提为提高温度、可提高酶的扩散速度，增加酶的溶解度，有利于酶的提为提高温度、可提高酶的扩散速度，增加酶的溶解度，有利于酶的提
8、为提高温度、可提高酶的扩散速度，增加酶的溶解度，有利于酶的提取。取。取。取。n n2.2.试剂试剂试剂试剂n n接着要注意的就是避免使用一些会造成酶变性的试剂，比如说重金属接着要注意的就是避免使用一些会造成酶变性的试剂，比如说重金属接着要注意的就是避免使用一些会造成酶变性的试剂，比如说重金属接着要注意的就是避免使用一些会造成酶变性的试剂，比如说重金属盐，有机试剂。严格意义上来说，要提取活性酶，任何可能使蛋白质盐，有机试剂。严格意义上来说，要提取活性酶，任何可能使蛋白质盐，有机试剂。严格意义上来说，要提取活性酶，任何可能使蛋白质盐，有机试剂。严格意义上来说，要提取活性酶，任何可能使蛋白质沉淀的试
9、剂和方法都要避免使用。最好就是直接在液体环境下进行，沉淀的试剂和方法都要避免使用。最好就是直接在液体环境下进行，沉淀的试剂和方法都要避免使用。最好就是直接在液体环境下进行，沉淀的试剂和方法都要避免使用。最好就是直接在液体环境下进行，比较理想的方法就是色谱柱层析。然后，实际上为了防止蛋白质在提比较理想的方法就是色谱柱层析。然后，实际上为了防止蛋白质在提比较理想的方法就是色谱柱层析。然后，实际上为了防止蛋白质在提比较理想的方法就是色谱柱层析。然后，实际上为了防止蛋白质在提取过程中被释放的内源性蛋白酶（木瓜蛋白酶，枯草蛋白酶等等）降取过程中被释放的内源性蛋白酶（木瓜蛋白酶，枯草蛋白酶等等）降取过程中
10、被释放的内源性蛋白酶（木瓜蛋白酶，枯草蛋白酶等等）降取过程中被释放的内源性蛋白酶（木瓜蛋白酶，枯草蛋白酶等等）降解蛋白质，还需要在提取环境中加入适当的蛋白酶抑制剂。解蛋白质，还需要在提取环境中加入适当的蛋白酶抑制剂。解蛋白质，还需要在提取环境中加入适当的蛋白酶抑制剂。解蛋白质，还需要在提取环境中加入适当的蛋白酶抑制剂。 酶活酶的比活力酶活力的度量单位。1961年国际酶学会议规定：1个酶活力单位是指在特定条件（25，其它为最适条件）下，在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量，或是转化底物中1微摩尔的有关基团的酶量。1、在特定条件下，单位重量（mg）蛋白质或RNA所具有的酶活力单位数。 2、比活力(性
11、)(Specific Activity)是酶纯度的量度,即指:单位重量的蛋白质中所具有酶的活力单位数,一般用IU/mg蛋白质来表示.一 般来说,酶的比活力越高,酶越纯.。 3、比活力 为每毫克蛋白质所具有的酶活力单位数，一般用酶活力单位/mg蛋白质表示。酶的比活力在酶学研究中用来衡量酶的纯度，对于同一种酶来说，比活力越大，酶的纯度越高。利用比活力的大小可以用来比较酶制剂中单位质量蛋白质的催化能力，是表示酶的纯度高低的一个重要指标。在酶的分离纯化过程中为什么进行酶活力及酶比活力测定1、防止酶变性失活。一旦活力明显下降，就要考虑换一种纯化方法；2、计算纯化效率。通过总活力和比活，评估纯化效率，寻找最佳方法。
