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1、分子分型（分子流行病学研究）分子分型（分子流行病学研究）从核酸分子水平上分析医院感染的发生、发展规律及机理，从核酸分子水平上分析医院感染的发生、发展规律及机理，更加准确有效地进行医院感染管理控制，已成为当前国际医更加准确有效地进行医院感染管理控制，已成为当前国际医院感染管理研究中的重要方向。院感染管理研究中的重要方向。从患者分离株到病区周围环境株的比较分析；从患者分离株到病区周围环境株的比较分析；从外源性感染到内源性感染从外源性感染到内源性感染从某一医院的医院感染暴发到大范围甚至世界从某一医院的医院感染暴发到大范围甚至世界范围的感染菌株流行变迁；范围的感染菌株流行变迁；基因多态性分析技术已成为
2、医院感染监测控基因多态性分析技术已成为医院感染监测控制的制的高水平研究领域。高水平研究领域。1微生物室在医院感染中的作用微生物室在医院感染中的作用accurately identifying nosocomial pathogensdetecting unexpected antimicrobial-drug resistanceepidemiologic typingPfaller MA et al. The clinical microbiology laboratory and infection control: emerging pathogens, antimicrobial re
3、sistance, and new technology. Clin Infect Dis 1997;25:858-70. 鉴定鉴定特殊耐药菌的特殊耐药菌的检出检出流行病学分型流行病学分型2PFGE(PFGE(脉冲场凝胶电脉冲场凝胶电脉冲场凝胶电脉冲场凝胶电泳泳泳泳) )RAPD(RAPD(随机扩增随机扩增随机扩增随机扩增DNADNA多态性多态性多态性多态性) )REA(限制性酶切限制性酶切)ribotyping (核糖体分核糖体分型型)分子分型分子分型基因分型基因分型分子流行病学分子流行病学研究研究31、脉冲场凝胶电泳、脉冲场凝胶电泳(PFGE)制制备备琼琼脂脂糖糖栓栓块块消消 化化酶酶 切
4、切脉脉冲冲电电泳泳结结果果解解释释4消化、释放出消化、释放出DNADNAPFGEPFGE原理原理5Enzyme酶切酶切PFGEPFGE原理原理约约5 52020个、长度个、长度1010800800kbkb的大片段的大片段DNADNA6Tenover FC.et al.J Clin Microbiol,1995;33(9):22332239 7脉冲电泳脉冲电泳PFGE原理原理8原理：原理：DNADNA常规凝胶电泳常规凝胶电泳脉冲场凝胶电泳脉冲场凝胶电泳9时间消耗时间消耗从分离菌株到出结果平均从分离菌株到出结果平均 2.5 2.5 天天标本准备、细胞裂解第标本准备、细胞裂解第一天一天酶切第二天酶切
5、第二天染色、拍照第三天染色、拍照第三天PFGEPFGE原理原理染色、拍照染色、拍照1011PFGEPFGE结果判读结果判读目测法：目测法：按美国疾病控制和预防中心按美国疾病控制和预防中心( (CDC)TenoverCDC)Tenover等人推荐的方等人推荐的方法判读。法判读。图谱完全相同的定为图谱完全相同的定为一个型一个型，彼此之间相差一个带的定，彼此之间相差一个带的定为同一型的为同一型的不同亚型不同亚型，相差，相差2 23 3个带的认为个带的认为亲缘关系密亲缘关系密切切，相差，相差4 46 6个带的认为个带的认为可能相关可能相关，条带相差，条带相差7 7个以上的个以上的认为认为无亲缘关系无亲
6、缘关系。并随机地选择不同的字母如。并随机地选择不同的字母如A A、B B、C C、D D等的字母顺序分型。等的字母顺序分型。 聚类分析聚类分析计算机输入计算机输入SPSSSPSS，做树状图做树状图12PFGE同源性分析同源性分析13PFGE特点：特点：DNA原位提取法，减少了断裂原位提取法，减少了断裂利用细菌全基因组信息利用细菌全基因组信息细菌分型金标准细菌分型金标准142、RAPD（随机扩增（随机扩增DNA多态性）多态性）19901990年年WilliamsWilliams：RAPDRAPDWelshWelsh：AP-PCRAP-PCR本质上相同本质上相同 引物：引物：“短短” ” 、“单一
7、单一” ” 和和“非特异性非特异性”，一般，一般9 91010bpbp 扩增条件：扩增条件：“非严格性非严格性” 退火温度一般较低退火温度一般较低,25,253535 15ESHWAR MAHENTHIRALINGAM.et al.J Clin Microbiol,1996;34(5):11291135 16nESHWAR MAHENTHIRALINGAM.et al.J .et al.J Clin Clin MicrobiolMicrobiol,1996;34(5):1129,1996;34(5):112911351135 17nESHWAR MAHENTHIRALINGAM.et al.J
8、 .et al.J Clin Clin MicrobiolMicrobiol,1996;34(5):1129,1996;34(5):112911351135 18分子分型在医院感染控制中分子分型在医院感染控制中的作用的作用19Special Issue New Technology for Detecting Multidrug-Resistant Pathogens in the Clinical Microbiology LaboratoryLance R. Peterson* and Gary A. Noskin*Northwestern Memorial Hospital and No
9、rthwestern University Medical School, Chicago, Illinois, USAEID, 2001, 7: 30620Northwestern Memorial Hospital, Chicago700-bed, university-affiliated medical center出院：出院：39,000/年年急诊：急诊：56,000例例/年年门诊量：门诊量：260,000/年年 21分型确认后及干预效果分型确认后及干预效果P=0.002LR Petersonet al, EID, 2001, 7: 3065.7922指标指标1.the total
10、number of nosocomial infections per 1,000 patient days每千住院日医院感染每千住院日医院感染数数2.the number of patients with nosocomial infections per 100 patient discharges 每每100出院病人医院感染病人数出院病人医院感染病人数 (percentage of patients with nosocomial infection)（医院感染病人百分比）医院感染病人百分比） 23感染控制工作小组成员：感染控制工作小组成员：We formed a permanent,
11、integrated infection control and prevention program that fully incorporates Hacek DM et al. Am J Clin Pathol 1999;111:647-54. infection control personnel,infectious disease personnel, pharmacy personnel, clinical microbiology personnel into a single working group to minimize hospital infections. 感染控
12、制感染控制感染性疾病感染性疾病药学药学临床微生物临床微生物24资料收集方法（资料收集方法（Methods for data collection）：）：review of microbiology reports review of patients medical records, direct observation of medical and nursing practice, active surveillance of rectal cultures of patients in nursing units for high-risk patients, evaluation of
13、 suspected nosocomial infections reported by health-care providers. 查阅微生物报告查阅微生物报告查阅病史记录查阅病史记录对医护人员操作的直接对医护人员操作的直接观察观察高危病人直肠培养的动高危病人直肠培养的动态连续观察态连续观察对上报的可疑医院感染对上报的可疑医院感染的评估鉴定的评估鉴定 由三位专职感染控制人员对资料进行汇总分析，并制由三位专职感染控制人员对资料进行汇总分析，并制定出相应控制措施，并在医院感染控制和预防部门主管的指定出相应控制措施，并在医院感染控制和预防部门主管的指导下实施。导下实施。25Two interve
14、ntions：a molecular typing laboratory a weekly planning meetinginfection controldiagnostic medical microbiology (molecular epidemiology)Pharmacyand infectious diseases两个主要的干预措施：两个主要的干预措施：分子分型分子分型周会周会包括以下方面的代表：包括以下方面的代表：感染控制感染控制微生物诊断（分子微生物诊断（分子流行病学）流行病学）药学药学感染性疾病感染性疾病26周会内容：周会内容：医院感染动向（短医院感染动向（短期、长期）期
15、、长期）感染控制专职人员感染控制专职人员和微生物实验室的和微生物实验室的工作工作决定需要做的调整决定需要做的调整需分型的病原体与需分型的病原体与主管讨论决定主管讨论决定weekly meetings： the ongoing short- and long-term trends in nosocomial infections within the center activities of the infection control professionals and microbiology laboratory personnel; any needed changes were det
16、ermined. The organizational structure for selecting microbes for typing was shared by the medical directors of infection control and clinical microbiology27需基因分型的微生物：需基因分型的微生物：routinely genomically typed：VREPeriodic routine typing：fluoroquinolone-resistant P. aeruginosa, methicillin-resistant Staphy
17、lococcus aureus (MRSA), Enterobacter cloacae, Clostridium difficile Additional organisms for typing：selected through surveillance of microbiology culture reports discussed at the weekly meeting. 常规基因分型：常规基因分型：VRE周期性分型：周期性分型：氟喹诺酮耐药的铜绿氟喹诺酮耐药的铜绿MRSA阴沟肠杆菌阴沟肠杆菌难辨梭菌难辨梭菌其他：根据微生物报告其他：根据微生物报告并在周会上讨论后决定并在周会上讨
18、论后决定需基因分型的病原体需基因分型的病原体 任何时候任何时候任何时候任何时候工作小组要求进行基因分型，临床微生物工作小组要求进行基因分型，临床微生物工作小组要求进行基因分型，临床微生物工作小组要求进行基因分型，临床微生物实验室即将菌株提供给实验室即将菌株提供给实验室即将菌株提供给实验室即将菌株提供给分子分型部门分子分型部门分子分型部门分子分型部门并执行并执行并执行并执行28实验方法实验方法REA analysisrestriction of genomic DNA with conventional electrophoresisDNA限制性酶切限制性酶切29基因分型相关费用基因分型相关费用
19、the cost of equipment, remodeling, reagent and other supplies, salaries and benefits for three technologists, plus all the institutional assessments (e.g., full-cost basis) required to operate a hospital laboratory. 仪器配制及维修、实仪器配制及维修、实验室改造等；验室改造等；试剂及其他消耗品试剂及其他消耗品三位实验员的薪水三位实验员的薪水所有的评估分析（如所有的评估分析（如full
20、-cost basis ）需）需要动用全院系统要动用全院系统分析方法：分析方法：t t检验检验成本成本-效益分析（效益分析（Analysis of Cost Data）30结果：结果：1、VREinitial impetus: serious nosocomial problem-VREs emergencemolecular typing results:a pattern of numerous “mini” patient-to-patient outbreaks of distinct clonesrather than the spread of a single persistin
21、g strain 1、VRE最初调查：最初调查：VRE医医院感染严重院感染严重分型结果提示：分型结果提示：多型别、小规模多型别、小规模（mini）病人间流病人间流行行而不是一个型别的而不是一个型别的流行流行31genomic typing:patient-to-patient transmission; nosocomial outbreak; little evidence of horizontal spread Using this information, we determined what intervention was likely to control an apparent
22、 outbreak (20).结果：结果：基因分型：可将可能的医院基因分型：可将可能的医院感染分组：感染分组：病人之间交叉感染病人之间交叉感染(high conality, 90%)感染爆发感染爆发(moderate clonality, 35%-75%) 无水平传播无水平传播(90%likelypatient-to-patient transmissionmoderate clonality, 35%-75%possiblynosocomial outbreakclonality, 1,400 fewer patients acquired infections during this ti
23、me,averting more than 50 expected deaths Even with endemic VRE, most of our outbreaks involve three or fewer patients (19).医院感染：医院感染：3.3%3.3%下降下降至至2.6%(2.6%(全国医院感染全国医院感染率：率：4.4%-5%4.4%-5%) ) 减少减少1,4001,400的病人感的病人感染染死亡：减少了死亡：减少了5050VREVRE：涉及的病人也比涉及的病人也比其他医院少其他医院少41成本成本The mean number of patients with
24、 nosocomial infections decreased by 283 per year, a reduction of more than 1,100 inpatient days. The costs avoided by using this calculation averaged more than $2,150,000/year, based on 1999 dollars. 医院感染患者数量平医院感染患者数量平均每年下降均每年下降 283，住，住院天数下降超过院天数下降超过1100天天因此节省的费用平均因此节省的费用平均每年超过每年超过$2,150,000（与与1999年
25、相比）年相比）42Representatives now meet together for 45 minutes each weekFor Microbiology, opening the typing laboratory totaled $180,050. By the fifth year, costs in the laboratory section were stable. The cost for the laboratory, includng three medical technologists, is $400,000 yearly. Virtually all th
26、ese costs are borne by the hospital.小组聚会逐渐转为每小组聚会逐渐转为每周开会，周开会，45min，讨讨论论微生物室成立分子分微生物室成立分子分型实验室（设备及人型实验室（设备及人员）的费用为员）的费用为$180,050. 每年分子分型相关支每年分子分型相关支出为出为$400,000 医院承担医院承担43While such a grant program would cost up to $2 billion each year if all U.S. hospitals participated, the projected reduction in c
27、ost of treating nosocomial infections could reach over five times that amount.a savings of $5.00 for each dollar spent. 假设：美国所有医院假设：美国所有医院进行基因分型相关费进行基因分型相关费用达到用达到20亿美元亿美元节省下来的治疗医院节省下来的治疗医院感染的费用将超过感染的费用将超过5倍（倍（100亿）！亿）！每使用每使用1美元节省美元节省5美元美元44Typing time: within 1 week 48 hours. Lack of clonality: sugg
28、ests other reasons for the apparent outbreak, antimicrobial-agent use pressure, failure of appropriate nursing-care practices, or simply random variation in the number of infections. Early knowledge of whether microbial clonality is present or absent focuses the scope of an investigation and facilit
29、ates appropriate intervention.时间：时间：1周，周，48h 如没有流行相关线索，如没有流行相关线索，可能是其他原因：可能是其他原因： 抗生素压力抗生素压力, 护理操作不当（非感护理操作不当（非感染相关）染相关）, 仅仅是感染数量的随仅仅是感染数量的随机变化机变化早早发现、及早确定调发现、及早确定调查范围、采取合适的查范围、采取合适的干预措施干预措施45cost of rapid detection using the polymerase chain reaction (PCR) =one day of glove isolationcould be comple
30、ted in a single 8-hour workday. As gene chip technology moves into clinical use, detecting a large number of resistance determinants soon after a patient is admitted to the hospital should be possible.PCR 分型分型费用费用=一天的手套一天的手套费用费用8小时的工作时间小时的工作时间内可完成内可完成基因芯片：基因芯片：大规模大规模耐药监测耐药监测病人入院后即实施病人入院后即实施46分子分型在医院
31、感染中的应用：分子分型在医院感染中的应用：technically possiblemedically usefuleconomically justified47医院感染的分子流行病学医院感染的分子流行病学研究方法研究方法分子流行病学方法在医院分子流行病学方法在医院感染中的应用感染中的应用医院感染控制的人员安排医院感染控制的人员安排成本成本-效益研究效益研究临床医院感临床医院感染控制染控制科研科研48实验研究：实验研究：瑞金医院瑞金医院 04 04年年0505年年全耐药鲍曼不动杆菌（全耐药鲍曼不动杆菌（PRABPRAB） 各个科室的各个科室的突然增多突然增多经脉冲场凝胶电泳（经脉冲场凝胶电泳（PFGEPFGE）证实证实烧伤科为单独一个型别烧伤科为单独一个型别PRABPRAB科室内流行科室内流行除烧伤科以外的其他科室为科室间同一型别除烧伤科以外的其他科室为科室间同一型别PRABPRAB流行。流行。由此可见，分子流行病学方法：由此可见，分子流行病学方法：为医院感染控制为医院感染控制提供准确的实验数据提供准确的实验数据有效判断感染来源和流行趋势有效判断感染来源和流行趋势为更好的做好医院感染控制工作打下了基础。为更好的做好医院感染控制工作打下了基础。4950
