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1、环环境境生生物物工工程程微生物生态及其对污染物的作用环境工程的微生物学基础环境工程的微生物学基础Chapter 22.1 微生物多样性2.4 微生物的驯化2.2 微生物的营养2.5 常见污染物治理的微生 物操作技术2.3 微生物对污染物的作用1 1FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程第二节 微生物的营养n n营养：生物体从外界摄取物质和能量，满足自身营养：生物体从外界摄取物质和能量，满足自身生长和繁殖需要的一种生理功能。生长和繁殖需要的一种生理功能。类类 型型碳源碳源能源能源微生物举例微生物举例
2、光能自养菌光能自养菌光能异养菌光能异养菌化能自养菌化能自养菌化能异养菌化能异养菌COCO2 2有机物有机物COCO2 2有机物有机物光能光能光能光能无机还原物无机还原物有机物有机物蓝细菌、紫蓝细菌、紫/ /绿硫细菌、藻绿硫细菌、藻类类紫色非硫细菌（红螺菌科细紫色非硫细菌（红螺菌科细菌）菌）硝化细菌、硫化细菌、铁细硝化细菌、硫化细菌、铁细菌、氢细菌菌、氢细菌绝大多数细菌和全部的真核绝大多数细菌和全部的真核微生物微生物2 2FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程微生物的营养要求n n六大要素：C、N、
3、Energy、GF、H2O、Mineral saltsn nCarbon source: “细胞骨架”，能生物降解的菌可以利用多种有机物作为碳源。但利用的能力不同： eg：Pseudomonas cepacia可以利用90种不同的有机物，而Methanobacterium 仅仅利用CO2和少数C1和C2化合物。3 3FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程n nNitrogen source：蛋白质合成和核酸合成的必需物质。1.1.环境中N的存在形式：氮气、铵盐、硝酸盐、尿素、有机含氮化合物等；2.
4、2.微生物可以利用多种形式的氮源： 肺炎克雷伯氏菌：利用农药溴苯腈肺炎克雷伯氏菌：利用农药溴苯腈氨氨 假单胞菌：二硝基苯酚假单胞菌：二硝基苯酚硝酸盐硝酸盐氨氨3、有机污染环境中，N源是微生物种群的生长限制因子。污染物完全降解的碳氮比范围： 200:110:14 4FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程n nGrowth factors:vv主要是氨基酸amino acid、嘌呤purine、嘧啶pyridine、维生素vitaminvv需要的量少，但有些微生物不能自身合成，必需依赖外源提供，如乳酸
5、菌必需提供多种维生素的供应。Auxoautotroph：生长素自养型Auxoheterotroph：生长素异养型5 5FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程n nMineral salts：微生物生长需要多种矿质元素：Macroelements常量元素：构成生物分子成分，如磷是核酸、细胞膜的重要成分，硫是蛋氨酸、硫胺素的成分，这些元素有P、S、K、Mg、Ca、Na、Fe，浓度104103mol/L；Microelements微量元素：Cu、Zn、Mn、Co、Mo，浓度108106mol/L；酶代谢
6、中起作用。6 6FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程自然环境中矿质元素含量较高，但是少数难溶的矿质如磷，成为水环境和土壤环境中的限制因子。一般要求碳磷比的范围：1000:1100:1用C/N和C/P来评判环境的营养状况要谨慎！7 7FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程qq水：水： 一般用一般用水活度水活度（Water activityWater activity，A Aw w) )或或水势水势（w
7、ater water potentialpotential，）来表示微生物可利用的水。来表示微生物可利用的水。水活度水活度 水活度事实上与平衡相对湿度含义一致，但它不是水活度事实上与平衡相对湿度含义一致，但它不是以以0100%RH0100%RH标志标志, ,而是以而是以0.1.0 Aw0.1.0 Aw标志。平衡湿标志。平衡湿度定义为没有了物质与空气中水的交换情况下，由度定义为没有了物质与空气中水的交换情况下，由周围空气获取的湿度值。周围空气获取的湿度值。水势水势 某一系统中水的化学势与处于相同温度和压力的纯某一系统中水的化学势与处于相同温度和压力的纯水的化学势之差，除以水的偏摩尔体积所得的商。
8、水的化学势之差，除以水的偏摩尔体积所得的商。它是水分转移本领大小的指标。它是水分转移本领大小的指标。 水总是从水势高的一方流向水势低的一方。水总是从水势高的一方流向水势低的一方。 8 8FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程n n一般微生物需要水活度在0.9001.000范围内存活，除了极少数菌体如Halobacter外。n n水活度值和细菌繁殖 n naw = 0.910.95 细菌最多 n naw = 0.88 酵母最多 n naw = 0.80 霉菌最多 n naw = 0.75 喜盐细菌
9、n naw = 0.70 osmiophile某些酵母 n naw = 0.65 xerophile 某些霉菌9 9FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程第三节 微生物对污染物的作用n n微生物对污染物的作用是多方面的。包括：降解作用，共代谢作用，去毒作用，激活作用。1010FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程1.微生物的降解作用n n降解微生物 种类繁多，细菌、真菌、藻类1）细菌 降解污染物的主力
10、军，29类，广泛对污染物产生降解，包括真细菌、蓝细菌和古菌1111FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程n n2 2）真菌）真菌 酵母、霉菌、大型真菌对污染物都有降解。酵母、霉菌、大型真菌对污染物都有降解。 种类种类种属种属代表污染物代表污染物 酵母酵母CandidaCandidaSaccharomycesSaccharomycesTrichosporonTrichosporonRhodotorulaRhodotorula石油烃石油烃石油烃，克菌丹等石油烃，克菌丹等石油烃石油烃石油烃石油烃 霉菌霉
11、菌AspergillusAspergillusBotrytisBotrytisCladosporiumCladosporiumCunninghamellaCunninghamella石油烃，敌百虫石油烃，敌百虫石油烃、扑草净石油烃、扑草净石油烃、扑草净石油烃、扑草净石油烃、甲霜灵石油烃、甲霜灵 白腐菌白腐菌平革菌平革菌云芝云芝PAHsPAHs/TCDD/TCDDPCPPCP1212FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程n n藻类 自然界藻类和菌类共栖，降解有机物。如氧化塘。藻类降解：A、多种酚类化
12、合物（苯酚、邻甲酚、苯三酚等）、萘。B、偶氮染料：小球藻对33种偶氮染料脱色能力。1313FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程2.基质代谢的生理过程n n微生物降解基质过程和其他化合物的代谢相似： 向基质接近 对固体基质吸附分泌胞外酶可渗透物质的吸收和胞内代谢1414FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程n n向基质接近 接近的意思：微生物处在这种物质的可扩散范围内，或者胞外酶处于这种范围内。 细菌
13、和其他微生物表现出向基质的趋向性。 如：丝状真菌向基质生长，担子菌的探查环境行为。n n对固体基质的吸附 微生物和固体基质间有非常紧密地结合 如：纤维素分解菌吸附纤维素，沥青降解菌牢固附着。1515FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程n n胞外酶的分泌 天然和人工合成的大分子物质都难降解，生物采取分泌胞外酶来达到降解作用。 胞外酶活动失效的原因： 1）酶被吸附； 2）变性； 3）被生物降解； 4）分解产物被竞争生物利用。1616FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程
14、FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程n n细胞内代谢 异生素进入细胞后，可以通过周边代谢途径被降解。 初始代谢产物通常汇集到少数中央代谢途径，参与细胞成分构建。 副反应产物：代谢产生的副反应产物可能产生终死产物终死产物和致死性产物致死性产物。终死产物本身就是持久性的，若无其他生物代谢，将是有害的；致死性产物就是代谢过程中产生的产物抑制生物体生命循环的关键步骤使得细胞死亡。如：氟代乙酸盐是由氟取代的基质降解形成，抑制 TCA循环。1717FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物
15、工工程程n n测定出不同基质条件下有机化合物的半衰期，这测定出不同基质条件下有机化合物的半衰期，这些与环境因素关系很大。些与环境因素关系很大。类别类别半衰期半衰期生物降解快生物降解快1717天天生物降解较快生物降解较快728728天天生物降解慢生物降解慢424424周周抗生物降解抗生物降解612612月月1818FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程2.共代谢n n现象：1960s，一氯乙酸上生长的假单胞菌使三氯乙酸脱卤，却不能利用三氯乙酸n n微生物不能从共代谢中受益，在纯培养中，共代谢终死转化
16、1919FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程n n共代谢基质与共代谢微生物 许多化合物在培养物中行共代谢。如：环己烷、氯酚、二氯苯胺、三硝基苯、甲草胺、禾草敌、2，4D。 微生物：无色杆菌属、节杆菌属、假单胞菌属、黄杆菌属、产碱菌属、诺卡氏菌属、芽孢杆菌属；青霉属、丝核菌属等 共代谢转化涉及单个或多种酶，进行羟基化、氧化、去硝基、去氨基、水解、酰化等作用。2020FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程
17、程共代谢的原因（1）缺少进一步降解的酶系（2）中间产物的抑制作用最初的转化产物抑制了后续酶的活性。例如：恶臭假单胞菌共代谢形成3-氯儿茶酚，抑制了后续酶系活性导致不能降解。 2121FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程（3）需要另外的基质 需要第二种基质因为：可提供电子供体或者起诱导作用。 如：铜绿假单胞菌要经过正庚烷诱导产生羟化酶系，使链烷烃转化为相应的醇。2222FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工
18、工程程n n共代谢的环境意义共代谢是微生物转化的一种特殊类型，会造成不良的环境影响：a.进行共代谢的微生物数量在环境中不增加，物质转化率降低。b.共代谢使有机产物持久积累，母体的毒性不能消除。2323FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程3.去毒作用n n去毒作用：污染物分子结构改变，降低或去除对敏感物种的有害性。n n去毒的酶反应通常在细胞内进行，形成的产物通常有三种转归：a.直接分泌到胞外；b.经过一步或多步反应，进入正常代谢途径，然后以有机废物的形式分泌或：c.最后碳以CO2的形式释放出来。
19、2424FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程n n典型反应：典型反应：（1 1）水解反应：酯键或酰胺键水解使得毒物脱毒）水解反应：酯键或酰胺键水解使得毒物脱毒（2 2）羟基化作用：在苯环或脂肪链上羟基化，使毒物失去）羟基化作用：在苯环或脂肪链上羟基化，使毒物失去毒性毒性（3 3）脱卤作用：脱卤酶使工业废物含卤化合物转化为无毒）脱卤作用：脱卤酶使工业废物含卤化合物转化为无毒产物。产物。（4 4）去甲基）去甲基oror去烷基：许多杀虫剂中与去烷基：许多杀虫剂中与N N、S S、OO相连的甲相连的甲基
20、或烷基脱去后，变成无毒。基或烷基脱去后，变成无毒。（5 5）甲基化：有毒酚类加入甲基钝化。）甲基化：有毒酚类加入甲基钝化。2525FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程（6 6）硝基还原：硝基化合物对各种高等）硝基还原：硝基化合物对各种高等oror低等生低等生物都是有害的，还原后毒性减轻：物都是有害的，还原后毒性减轻：RNORNO2 2RNHRNH2 2（7 7）去氨基：去氨基： 如：有毒杀草剂醚草通脱氨形成对植物无毒害的如：有毒杀草剂醚草通脱氨形成对植物无毒害的产物。产物。（8 8）醚键断裂：）
21、醚键断裂： 如：卤代苯氧羧酸类除草剂醚键断裂消除对植物如：卤代苯氧羧酸类除草剂醚键断裂消除对植物毒性。毒性。（9 9）腈转化为酰胺）腈转化为酰胺（1010）轭合作用（）轭合作用（conjugationconjugation）：）：生物体中间代生物体中间代谢产物和异生素可进行合成反应，称为轭合作用。谢产物和异生素可进行合成反应，称为轭合作用。产物一般无毒性。产物一般无毒性。2626FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程4.激活作用n n激活作用及其特点：致癌物致畸物致突变物急性毒物毒植物素抗菌素迅速
22、矿化活活化化缓慢矿化缓慢矿化无无毒毒化化合合物物持久性2727FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程n n激活作用的起始研究：某些农药本身不对靶标生物激活作用的起始研究：某些农药本身不对靶标生物有害，只有进入体内以后分子结构发生改变，才会有害，只有进入体内以后分子结构发生改变，才会对生物体引起伤害和死亡。对生物体引起伤害和死亡。n n激活反应：激活反应：（1 1）脱卤作用：三氯乙烯（）脱卤作用：三氯乙烯（TCETCE）在微生物降解过在微生物降解过程中发生激活，产生强致癌物程中发生激活，产生强致癌物
23、氯乙烯。厌氧代氯乙烯。厌氧代谢还可形成谢还可形成1 1，1 1二氯乙烯和反二氯乙烯和反-1-1，2-2-二氯乙烯。二氯乙烯。2828FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程（2 2）亚硝胺的形成：）亚硝胺的形成： 亚硝胺类化合物的基本结构为：亚硝胺类化合物的基本结构为： 很强的致癌、致畸、和致突变物。很强的致癌、致畸、和致突变物。 通过仲胺的通过仲胺的N-N-亚硝化作用形成。亚硝化作用形成。 a.a.仲胺和叔胺：工业大量应用，河水、废水、土仲胺和叔胺：工业大量应用，河水、废水、土壤普遍存在。叔胺经过
24、脱烷基形成仲胺。壤普遍存在。叔胺经过脱烷基形成仲胺。 b.b.亚硝酸盐形成：自然界含量低，经过氨氧化成亚硝酸盐形成：自然界含量低，经过氨氧化成硝酸盐，再经反硝化作用形成亚硝酸盐。硝酸盐，再经反硝化作用形成亚硝酸盐。 c.c.亚硝胺形成：环境中极低的亚硝酸盐足以激活亚硝胺形成：环境中极低的亚硝酸盐足以激活反应：反应：2929FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程凡是合成的就是危险的，凡是天然的就是安全的。凡是合成的就是危险的，凡是天然的就是安全的。n n植物和鱼体中都含有仲胺、叔胺植物和鱼体中都含有
25、仲胺、叔胺n n消化道内微生物转化使叔胺消化道内微生物转化使叔胺仲胺，并使饮水和蔬仲胺，并使饮水和蔬菜中的硝酸盐菜中的硝酸盐NONO2 2- -n n微生物作用微生物作用oror在低在低pHpH值的胃内经非生物作用形成值的胃内经非生物作用形成亚硝胺亚硝胺3030FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程（3 3）环氧化作用：微生物可以使一些带双键的化）环氧化作用：微生物可以使一些带双键的化合物形成环氧化物，使得产物对动物更有毒性合物形成环氧化物，使得产物对动物更有毒性（4 4）硫代磷酸酯转化为磷酸酯：
26、）硫代磷酸酯转化为磷酸酯： 激活反应在动物体内激活反应在动物体内oror自然界中发生，氧化脱硫自然界中发生，氧化脱硫造成的毒性增强可高达造成的毒性增强可高达1 1万倍，如毒虫畏激活后，万倍，如毒虫畏激活后，氧化脱硫形成强烈的胆碱酯酶抑制剂。氧化脱硫形成强烈的胆碱酯酶抑制剂。3131FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程其他激活方式有： 苯氧羧酸的代谢、硫醚的氧化、酯的水解、甲基化、去甲基化等激活的作用类型：a.典型激活：产物比前体物质更具有毒性；b.缓解 一种化合物有两种前途：变成毒性即激活；转化
27、为无毒产物，从而避免了激活，称为缓解。c.生物毒性谱的变化：结构改变对另一种生物有害3232FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程第四节 微生物的驯化n n驯化及其在污染物处理中的应用 土壤和水体受到污染后，特别在受到不容易生物降解的有机物污染后，污染物开始不发生降解或降解很慢，经过一段时间后污染物会迅速降解。 驯化期（acclimation period）:从污染物进入环境到污染物开始迅速降解的时间间隔。 又称：适应期（adaptation period），停滞期（lag period）3333
28、FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程n n驯化期长短变化很大，时间取决于化学品的种类、化学品的浓度以及环境条件。化学品化学品环环 境境驯化期驯化期4 4硝基酚硝基酚水沉积物水沉积物404080h80h五氯酚五氯酚河水河水21213535天天二硝酚二硝酚土壤土壤1616天天氯代苯类氯代苯类生物膜生物膜1010天天5 5个月个月次次氨基三乙酸氨基三乙酸河口河口5050天天杀草强杀草强土壤土壤7 7天天苯胺灵苯胺灵土壤土壤2020天天3434FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物
29、工工程程FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程n n驯化：定向选育，即通过人工措施使微生物逐步适应某种特定条件，最后获得具有较高耐受力和代谢活性的菌株。原始菌株原始菌株靶化合物靶化合物靶化合物高高活性菌株活性菌株浓浓度度逐逐渐渐增增加加3535FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程n n驯化的后效应n n 驯化期的结束标志着降解的开始。n n 降解某种化学品的微生物群落驯化出来，能保持一段时期的活性。n n不是所有的化合物都有驯化后效应。可能原因？化学品浓度太低。例：
30、4硝基苯酚的驯化后效应：在含有沉积物和天然水的样品中浓度高于10g/L10g/L才能降解，否则无法降解。C10g/LC110g/L3636FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程n n农药加速降解n n现象：单一或反复使用某种杀虫剂、杀菌剂或除草剂，对有害生物的控制失效。 为什么？ 1、抗药性产生； 2、化学品迅速降解农药加速降解（accelerated pesticide degradation），促进生物降解（enhanced microbial degradation）3737FEL,bio-
31、vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程n n问题的产生由于驯化期长度和降解速率发生了变化。n n为了延长农药作用期，需要使用延缓剂抑制生物降解菌n n有些农药没有此类问题：如毒死蜱、异丙隆等n n施用过的土壤比从未施用的土壤更迅速的矿化农药3838FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程n n影响驯化的因素1.1.一种基质驯化出的微生物群落经常同时驯化出降解部分有关结构分子的群落。2.2.环境因子影响驯化期的长短。如：
32、温度、pH、通气状况、N、P、等等3.3.代谢化合物的浓度。微量浓度的化学品的生物降解速率随浓度增加而提高，但浓度越高驯化期越长。4.4.微生物区系差异。同一种化学品在同一浓度下，随地点不同驯化期差异很大。3939FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程n n产生驯化期的原因产生驯化期的原因n n对驯化期的认识，早期建立在纯培养基础上。对驯化期的认识，早期建立在纯培养基础上。不足之处：纯培养的细菌浓度远远超过自然界不足之处：纯培养的细菌浓度远远超过自然界单个种群密度。单个种群密度。n n重新设计的实
33、验来验证假说，结果一些新的解重新设计的实验来验证假说，结果一些新的解释如下：释如下：1.1.群体数量太少与检测的灵敏度不够群体数量太少与检测的灵敏度不够2.2.毒物的存在毒物的存在3.3.原生动物的捕食作用原生动物的捕食作用4.4.新的基因型的出现新的基因型的出现5.5.二次生长二次生长6.6.酶的诱导和停滞期酶的诱导和停滞期4040FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程1.群体数量太少和检测灵敏度不够n n土壤、天然水、污水和废水环境中能够利用合成有机化合物生长的微生物群体数量是很少的，有时甚至
34、只有几个。 即使是几个细胞在旺盛的代谢污染物，但不会被观察到明显的浓度下降和细胞增加。只有细胞分裂进入指数期，母体化合物浓度的下降才会被观察到。有机物初始浓度越高，经历的停滞期越长！4141FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程2.毒物的存在n n抑制剂的存在影响了驯化期。1.1.化学品浓度很高，只有很少的微生物可以降解；2.2.很多污染点都是有毒化学品的混合物，抑制了微生物的降解。 地下水污染的羽状带，由于污染物流出使抑制剂稀释而发生降解。4242FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环
35、境境生生物物工工程程FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程n n毒物有几种方式让驯化期延长或缩短i. i.单纯抑制：如重金属抑制降解NTA，使得活性淤泥的驯化期延长；ii.ii.抑制快生菌：毒物抑制快生菌，通常使降解污染物的混合种群的优势菌株。iii.iii.毒性产生：毒性最初不存在，在降解过程产生。如：在苯酚和如：在苯酚和4 4硝基苯酚共存，苯酚硝基苯酚共存，苯酚的降解受到的降解受到4 4硝基苯酚降解产物的抑制硝基苯酚降解产物的抑制iv.iv.毒性消除 毒性消除后降解菌能够繁殖，驯化期为2段时间之和。4343FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生
36、生物物工工程程FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程原生动物的捕食作用n n实验证明：设置对照组，添加真核抑制剂，发现驯化期缩短真核生物的存在抑制了菌群？n n捕食作用不明显的地方，如许多天然水体，驯化期不受真核抑制剂的影响。4444FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程新的基因型的出现n n突变、种间基因转移会导致发生遗传改变。n n新基因型产生后，若该选择是有利的，降解菌就会大量繁殖。n n驯化反映的是突变或基因转移发生的时间与新降解菌繁殖达到高种群密度的总和。假
37、假单胞菌单胞菌产碱菌产碱菌降解氯儿茶酚基因转移4545FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程二次生长n n二次生长产生的原因：微生物对不同基质的利用有先后选择。n n较容易利用的基质被优先利用：大肠杆菌对葡萄糖、山梨糖混合液的利用；假单胞菌对无机磷和有机磷混合液的利用。4646FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程酶的诱导和停滞期n n许多参与异生素分解的最初几步酶都是诱导酶。n n诱导在几分钟或者几
38、个小时内完成，驯化期需要几天到几周。n n诱导酶的产生与基质浓度有关。4747FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程2.3 微生物操作技术1、菌株接种n n接种目的：生物强化作用加速污染物的降解（对时间严格要求时）克服降解微生物的不均匀性缩短驯化期恢复微生物区系：污染高浓度、高温度或其他条件抑制天然降解物种增长4848FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程n n接种注意点a)a)无须接种：条件有利，天
39、然区系存在，时间充裕b)b)接种失效：不适合降解微生物生存的条件 典型事例典型事例 烃类降解混合菌投入海水系统，并不能促进污染烃类降解混合菌投入海水系统，并不能促进污染降解降解4949FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程2、菌株的富集和分离富集培养技术是一种常用的选择性培养技术。选择生长因子造成特殊环境选择优势微生物。唯一碳源or能源必需无机盐其他条件控制富集培养5050FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物
40、物工工程程n n3、异生素降解菌富集和分离的困难及其解决方法a)异生素的特点：高毒性、非水溶性、高挥发性和热不稳定性 降解菌分离困难，因为有些可直接杀灭微生物，如低分子量溶剂、醛、酚类b)问题的处理方法：毒性：强毒性的可以低浓度维持；水溶性差的可以高浓度保持。憎水性：通过分散作用或使用惰性亲水载体。具体方法：高速搅拌、超声波乳化、硅藻土吸附等 5151FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程挥发性：适当封闭体系，注意及时补充热稳定性：热不稳定异生素不可用常规方法加热灭菌，过滤消毒（有机溶剂类过滤会破
41、坏硝化纤维素膜和聚碳酸酯膜，只能用烧结陶瓷膜或烧结金属膜过滤） 高毒性物质虽自身可以杀菌，但最好过滤除菌5252FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程n n4、异生素降解菌富集和分离技术n n富集分离的难度 常规微生物的富集分离可以直接挑选，而异生素降解菌则不然，因为： a、生长缓慢，不易区分； b、补充的外源有机物增加了复杂性； c、不溶性异生素影响浊度观察。5353FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工
42、工程程可行方法：n n残留分析和生长状况判断 降解实验要分析异生素残留状况： 异生素异生素憎水性憎水性憎水性憎水性萃萃萃萃取取取取气气气气/ / / /液液液液相相相相色色色色谱谱谱谱化化学学反反应应测测定定卤卤素素分分析析14C标记生物呼吸仪生物呼吸仪生物呼吸仪生物呼吸仪5454FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程n n降解菌落的选择 利用生理特征来挑选：如形成透明带、指示剂变色、特殊颜色反应等；菌菌落落观观察察技技术术透明圈形成：双层琼脂技术透明圈形成：双层琼脂技术透明圈形成：双层琼脂技术透
43、明圈形成：双层琼脂技术制备好的矿制备好的矿制备好的矿制备好的矿物琼脂支持平板上倾倒乳化好的异生素琼脂，用物琼脂支持平板上倾倒乳化好的异生素琼脂，用物琼脂支持平板上倾倒乳化好的异生素琼脂，用物琼脂支持平板上倾倒乳化好的异生素琼脂，用以观察透明带以观察透明带以观察透明带以观察透明带显色剂添加：利用显色反应显色剂添加：利用显色反应显色剂添加：利用显色反应显色剂添加：利用显色反应，如降解氯代苯胺如降解氯代苯胺如降解氯代苯胺如降解氯代苯胺偶氮苯，可用茴香胺双氧水喷洒，红色褪去偶氮苯，可用茴香胺双氧水喷洒，红色褪去偶氮苯，可用茴香胺双氧水喷洒，红色褪去偶氮苯，可用茴香胺双氧水喷洒，红色褪去者为降解菌落者为
44、降解菌落者为降解菌落者为降解菌落酸碱指示剂：酸碱指示剂：有机氯的降解菌，加入酸碱指有机氯的降解菌，加入酸碱指有机氯的降解菌，加入酸碱指有机氯的降解菌，加入酸碱指示剂如伊红、美蓝、溴甲酚紫、溴百里酚蓝，可示剂如伊红、美蓝、溴甲酚紫、溴百里酚蓝，可示剂如伊红、美蓝、溴甲酚紫、溴百里酚蓝，可示剂如伊红、美蓝、溴甲酚紫、溴百里酚蓝，可以检测到颜色变化以检测到颜色变化以检测到颜色变化以检测到颜色变化5555FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程5、共代谢基质降解菌的富集和分离n n共代谢基质降解菌的富集分离
45、是困难的，因为共代谢是不与微生物生长相联系的基质降解过程，不能使用降解基质作为唯一碳源富集。n n解决途径：用类似物富集和测定富集菌中有关的酶系。5656FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程n n1类似物富集 使用类似物可以加速共代谢基质分解。以此原理进行分离。 优点：容易操作，有定向性； 缺点：不是总有效，要多多试验。n n2相关酶的测定 了解共代谢性质后，可以通过测定特定的酶来筛选菌株，来得到降解菌。5757FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程FEL,bio-
46、vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程同生菌的富集和分离n n同生菌n n异生素上述方法失败n n原因？浓度？生长因子缺乏纯培养技术的缺陷5858FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程n n另一现象： 富集培养降解速率提高，但单一碳源在人工培养时生长缓慢，转管几次后生长停止。为何？ 培养基缺乏营养； 同生菌降解任务。同生菌微生物的关系：互养、协同共栖5959FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物
47、工工程程n n有效分离手段：恒化器6060FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程“加速进化”与富集分离n n在选择压力存在的恒在选择压力存在的恒化器中长期混合培养化器中长期混合培养微生物，通过各种微微生物，通过各种微生物间质粒的自然传生物间质粒的自然传递和相互作用来完成递和相互作用来完成构建新菌株的目的，构建新菌株的目的，又称为又称为” ”质粒协助分质粒协助分子育种子育种” ”。ABCwaste6161FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程FEL,bio-vaxFEL
48、,bio-vax环环境境生生物物工工程程接种试验成功案例n n在反应器中加入纯培养、富集物或混合菌株降解异生素容易获得成功n n土壤、含水层、地表水环境中成功的事例不多1、土壤：农药石油类以及一些特殊烃类有：对硫磷假单胞菌 苯胺灵混合细菌 石油类假丝酵母 硝基酚混合菌株6262FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程2、其他环境 （1）水体 河口获得的烃类降解菌可促进石油泄漏污染，接种可促进海滨石油污染，如将降解PAHs的分支杆菌接种到水体可以促进芘的矿化。 （2）活性淤泥系统 有代谢多样的微生物，
49、但对许多新的合成化合物的驯化期过长，接种可加速降解。6363FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程接种失败的原因 经常可以见到接种失败的例子：海水中分解石油烃的菌株接种到淡水中不起作用；土壤中可利用脂肪烃的细菌接种到燃料油污染的土壤，不促进降解n n反映了引入的微生物受到多种生态因子限制。1.营养限制 大量微生物在有机污染的水体中竞争无机盐，导致快速生长的非降解菌占优势。证据：接种体在灭菌条件下可以分解污染物，而在非灭菌的自然环境中不能分解的现象。6464FEL,bio-vaxFEL,bio-va
50、x环环境境生生物物工工程程FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程2、捕食者和寄生物的抑制 环境中的捕食者和寄生物对细菌的抑制，如 原生动物捕食多种细菌，要求细菌密度在106个/ml(g). 证据：硝基苯利用菌Corynebacterium spp.对4-硝基苯酚降解，接种到低浓度湖水中数目下降，加入抑制原生动物和真核生物的放线菌酮，降解正常数量增加。6565FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程3.3.细菌在土壤中的移动能力细菌在土壤中的移动能力 一般土壤表面施用的接
51、种物在土壤中移动不超过一般土壤表面施用的接种物在土壤中移动不超过5cm5cm，通过土壤孔隙水分扩散，移动也不显著。通过土壤孔隙水分扩散，移动也不显著。 通过对粪大肠杆菌的研究证实，细菌移动不超过化通过对粪大肠杆菌的研究证实，细菌移动不超过化粪池区域粪池区域1010米。米。 另有研究认为细菌通过另有研究认为细菌通过 裂隙基岩至少移动裂隙基岩至少移动3030米米6666FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程FEL,bio-vaxFEL,bio-vax环环境境生生物物工工程程4、其他原因 a 其他碳源的存在 微生物对易用碳源的利用降低污染物代谢能力 b 有机基质浓度太低 c 需要添加额外碳源支持生长 共代谢微生物 d 温度 e pH值 f 盐分：海水分离的菌不能降解淡水石油 g 毒物 天然抑制物6767
