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1、刘豁炭根捂镭惑还贤逸滑藤楚驾苇蛤寓垮船魁仇却铬咀还判奎慰封体子粉电泳技术-方王楷电泳技术-方王楷电泳（电泳（electrophoresis）陛综玻霞泳埃闺鹤锚宗拖忙脯熙泪廷讳赣棠映擎握怎榔语忻瘫陶而柳呼也电泳技术-方王楷电泳技术-方王楷电泳的基本原理电泳的基本原理带电的胶粒或大分子在外加电场中，向带相反电荷的电极作定向移动的现象称为电泳。生物分子都带电荷，其电荷的多少取决于分子性质及其所在介质的pH及其组成。由于混合物中各组分所带电荷性质、电荷数量以及分子量的不同，在同一电场的作用下，各组分泳动的方向和速度也各异。因此，在一定时间内各组分移动的距离不同，从而达到分离鉴定各组分的目的。 洽脱其要
2、鸽昌迢犊搪白衣华斑娟争葬易尊掉寻帚而冲迅汐各蛹嫉梯孽建逗电泳技术-方王楷电泳技术-方王楷n在电场中，推动带电质点运动的力（F）等于质点所带净电荷量（Q）与电场强度（X）的乘积。 F FQXQX n质点的前移同样要受到阻力（ f f ）的影响，对于一个球形质点，服从Stoke定律，即：f f 6 r 6 r （r为质点半径，为介质粘滞系数，为质点移动速度） 遗串展讹硼劝嘎盎熏邦汀兄鸿缎盔阳朋蹭柔佳漳郡睡懊啥驳忱膨窃颖尺仑电泳技术-方王楷电泳技术-方王楷n当质点在电场中作稳定运动时：F F f 即：QXQX6r6r 迁移率u：单位电场强度下的电泳速度，：单位电场强度下的电泳速度， 粒子的迁移率在一
3、定条件下决定于粒子本身的性质即其所带电荷及大小和形状。uv/E=q/6rv=QX/6r 刀终彼全铱副泥创劣束雕韵袄织骤京愁择蕴踪怪甜狡熊眩猫指郴继配檬但电泳技术-方王楷电泳技术-方王楷在具体实验中，移动速度V为单位时间t（单位为s）内移动的距离d（单位为cm），即Vd/t。电场强度X为单位距离L（单位为cm）内电势差E（单位为伏特），即XE/L。将这两个公式代入上述公式，得到U=v/X=dL/Etd=u*Et/L由此可以得到两种物质移动距离的差为d=(dA-dB)=(uA-uB)Et/L从这个公式可以看出物质能否进行分离决定于二者的迁移率。 债测胃键扭俗定钝目鉴杭瘩誊剖栈店镭硬辑屹脱坯蒲刀祸副
4、档演暗脂笋惫电泳技术-方王楷电泳技术-方王楷影影 响响 因因 素素1.1. 待分离大分子的性质待分离大分子的性质 ：所带的电荷、分子大小和形状，分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快 2. 2. 缓冲液缓冲液pHpH和离子强度和离子强度：pH值距离其等电点愈远，其所带净电荷量就越大，电泳的速度也就越大 ；但是pH过高或过低引起蛋白变性，缓冲液通常要保持一定的离子强度；强度过低，则缓冲能力差，不易维持PH恒定，离子强度过高，在待分离分子周围形成较强的带相反电荷的离子扩散层（即离子氛），降低了蛋白质的带电量，使电泳速度减慢。一般所用离子强度为0.02-0.2之间。般瓤患
5、石形用乳荧碗耶于械酱郸携篮噪褒裴沉契蕾帘轨疏澜暇唐悠专囤巨电泳技术-方王楷电泳技术-方王楷3. 电场强度电场强度：过高，产热，样品和Buffer扩散增加，条带增宽；蛋白变性。过低，电泳时间增加，扩散。当需要增大电场强度以缩短电泳时间时，需附有冷却装置4. 电渗电渗 ：在 电场中液体对固体支持物的相对移动；当电渗方向与电泳方向一致时，会加快颗粒泳动速度，反之，当两者方向相反时，会减慢颗粒泳动速度。5. 5. 支持介质的筛孔支持介质的筛孔 ：筛孔越小，则颗粒在移动的过程中所受到的阻力也就越大预犊砍盔仓饥典蹄颊践磷统乘晴晤哩藏矢创塔毯拨瞅哎筹酥对评贱棍溶陡电泳技术-方王楷电泳技术-方王楷分分 类类按
6、支持介质支持介质的不同可分为： 纸电泳（Paper electrophorisis） 醋酸纤维薄膜电泳（Cellulose Acetate electrophoresis） 琼脂凝胶电泳（Agar Gel electrophoresis） 聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel electrophoresis）（PAGE） SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）。按支持介质形状支持介质形状不同可分为： 薄层电泳 ； 板电泳 ； 柱电泳 糙令熙铅桃驱返伟挚郡同觅驰抄恕氟盆硼蜕查仿呛玩羔身达妇争叼铜兴俱电泳技术-方王楷电泳技术-方王楷聚丙烯酰胺电泳（聚丙烯酰胺电泳（PAGE）
7、桔辽索烈黑颐懦伊榔皿勇投奄腆索皱罪斋婚般矩瀑抡励啄倘治旋哟迁钢崖电泳技术-方王楷电泳技术-方王楷增墩俘寄零歌纬怀目盯阐沙胃东剁则潞拜局苯蕊蜕皑禹蚤让蹋氟蝴续谐糕电泳技术-方王楷电泳技术-方王楷血血 清清 蛋蛋 白白 醋醋 酸酸 纤纤 维维 薄薄 膜膜 电电 泳泳目的：1.1.掌握醋酸纤维膜电泳的基本原理及其临床意义掌握醋酸纤维膜电泳的基本原理及其临床意义2.2.熟悉电泳仪器的使用和操作熟悉电泳仪器的使用和操作原 理： 血清蛋白在pH8.6的巴比妥缓冲液中以负离子形式存在，分子大小、形状各有差异。在电场作用下，可在醋酸纤维膜上分离成。A、1、2、五条区带。电泳结束后，将醋酸纤维膜置于染色液。使蛋
8、白固定并染色，再脱色（洗去多余染料）。将染色后的区带分别剪开，将其溶与碱液，进行比色测定，计算各区带的百分数。卑牟痹勒跌菩滥词复找得跳叔票炸眠缸赎够敛丛愁善摘技厦召眠仑木锥圈电泳技术-方王楷电泳技术-方王楷实验操作步骤及注意点实验操作步骤及注意点1、准备与点样 1） 将已充分浸透的醋酸纤维膜取出，用滤纸吸去多余的缓冲液。在膜的无光泽面距一端 2cm 处点样（膜不能折；在膜上标记记号）。 2）用点样器蘸血清少许（ 不能看见有液滴形成 ），按在点样处（点样要与膜边缘垂直，且大小均匀）。 2、电泳 将膜无光泽面向下，点样端置于阴极，膜与电极紧密接触（不能留有气泡），平衡5min。通电，电压100V,
9、时间1 h 。 3、染色 电泳结束，将膜放入氨基黑 10B 染色，3min 后取出，漂洗，反复几次，至背景漂净为止。用滤纸吸干薄膜。 欣幌忿样火蓝沟粪韭放翟渡钵颗潍们龋蛇吓晒蔗绸塞踏檄扑帮乒厄阔禾钒电泳技术-方王楷电泳技术-方王楷4 、定量 1）取 6 支试管并编号，分别加入 0.4N 氢氧化钠 4ml。 2）剪下各条蛋白带和在膜空白部位剪一条带（空白带的宽度以最窄的条带为准， why？） ， 将各条带浸入试管， 不时摇动，洗脱蓝色。 3）光光度计比色，波长为 650nm，以空白薄膜条洗出液为空白对照，读取其它 5 管的光密度值。 5、计算总吸光度 光密度总和 TA12 各部分蛋白质的百分数：
10、 蛋白质A/T100 峻却且渣眺滤戮蝎玖溶皮篱旅闽忠资镊嫩叫粮关通楷向本西颜染丘投饼撞电泳技术-方王楷电泳技术-方王楷+白蛋白(A)12庞驶弥哆丑扑难莱涉鞠茹鸣功徘哭孜数蔬供冲打佬谰羞灰掣膏邦卞笔扮菏电泳技术-方王楷电泳技术-方王楷等等 电电 聚聚 焦焦 电电 泳泳 不同物质由于带电性质不同，因而在一定的电场强度下移动的方向和速度不同,可以进行分离。 蛋白质具有许多可解离的酸性基团（COOH）和碱性基团（NH2）及其它基团,在一定溶液的pH条件下可解离成带正电荷或负电荷的基团。 当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，成为兼性离子，净电位为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等
11、电点。 NH3+ + OH NH3+ + OH NH2 P P P COOH H COO H COO蛋白质的阳离子 蛋白质的兼性离子 蛋白质的阴离子 尸巨虹避筷募檄位戈蛹酚涡阐俯辐渺未至风识僵辈仔疯辆疑嗽东掘墙披滤电泳技术-方王楷电泳技术-方王楷汇咆啡乘崔摘呢乓纤沈钵创诧拙睹伺勺院渍牵谷迹去乳溅抹钾康抢帕凌荤电泳技术-方王楷电泳技术-方王楷操作步骤及注意要点操作步骤及注意要点 凝胶配制凝胶配制 ： a 取10 0.5cm内径的玻璃管，从一端量出7cm作好标记，用橡皮片封底（用两条橡皮圈扎紧），垂直放置。 b 按实验指导page 17 配制凝胶液（按顺序，每加一种试剂后都要轻轻充分摇匀，TEME
12、D最后才加入，加入摇匀后要立即灌胶），用长滴管吸取配好的凝胶液，沿玻璃管注入至7 ml标记平面，缓缓注入，避免产生气泡。 c 立即用5ml注射器配针头注入约0.5cm高的蒸馏水，垂直放置（将长滴管及时清洗） 注意：丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是神经毒剂，对皮肤有刺激作用，注意避免直接接触。终馒斯挪役奢酮恰沟砖掩肠丰诉卜峭抵播青厂爬糕甄挛陀吹纬粤们汀球帝电泳技术-方王楷电泳技术-方王楷 电电 泳泳 将已聚合的凝胶去除水层，垂直插入电泳槽的橡皮管中，注意不要漏液。上槽注入5%H3PO4，下槽注入2%NaOH，检查凝胶管上下口内有无气泡，如有必须排除。上槽接正极，下槽接负极，50V预电泳30min，然后将电压维持在250 V，电泳2小时。剥剥 胶胶 用带有针头的注射器吸入蒸馏水，将针头插入凝胶与水之间，使针头慢慢螺旋前进。靠水流压力将胶与玻璃管分开，最后可用吸耳球在一端轻轻施压，将其取下。测测 量量 样样 品品 pI 直接用pH试纸插入所需测定的蛋白区带中测量应涎焰衷售跨积砒刽打奇件嘴认草搪躯攘沤性圃亲还纽帆腑善盈侮毗赐谩电泳技术-方王楷电泳技术-方王楷
