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1、利用基因工程技利用基因工程技术生生产重重组蛋白蛋白从基因到蛋白的复制、转录和翻译过程从基因到蛋白的复制、转录和翻译过程功能蛋白功能蛋白组装组装什么是基因工程什么是基因工程什么是基因工程什么是基因工程 基基基基因因因因工工工工程程程程(Genetic (Genetic Engineering)Engineering)原原原原称称称称遗遗遗遗传传传传工工工工程程程程。是是是是指指指指在在在在分分分分子子子子水水水水平平平平上上上上将将将将一一一一种种种种或或或或多多多多种种种种生生生生物物物物体体体体( (供供供供体体体体) )的的的的DNADNA片片片片断断断断（目目目目的的的的基基基基因因因因
2、）与与与与载载载载体体体体DNADNA分分分分子子子子（如如如如质质质质粒粒粒粒、病病病病毒毒毒毒等等等等）在在在在体体体体外外外外进进进进行行行行拼拼拼拼接接接接重重重重组组组组, ,产产产产生生生生新新新新的的的的自自自自然然然然界界界界从从从从未未未未有有有有过过过过的的的的重重重重组组组组DNADNA分分分分子子子子，然然然然后后后后转转转转入入入入另另另另一一一一种种种种生生生生物物物物体体体体( (受受受受体体体体) )内内内内，使使使使之之之之按按按按照照照照人人人人们们们们的的的的意意意意愿愿愿愿遗遗遗遗传传传传并并并并表表表表达达达达出出出出新新新新的的的的性性性性状状状状的
3、的的的技技技技术术术术。基基基基因因因因工工工工程程程程有有有有时时时时也也也也称称称称为为为为重重重重组组组组DNADNA技技技技术术术术(DNA (DNA Recombination)Recombination)或或或或 分分分分 子子子子 克克克克 隆隆隆隆 技技技技 术术术术 (Molecular (Molecular Cloning)Cloning)。什么是重组蛋白什么是重组蛋白什么是重组蛋白什么是重组蛋白 重组蛋白是指将一种或多种生物体（供重组蛋白是指将一种或多种生物体（供重组蛋白是指将一种或多种生物体（供重组蛋白是指将一种或多种生物体（供体）的基因导入另一种生物体（受体）内，体）
4、的基因导入另一种生物体（受体）内，体）的基因导入另一种生物体（受体）内，体）的基因导入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出的蛋白质使之按照人们的意愿遗传并表达出的蛋白质使之按照人们的意愿遗传并表达出的蛋白质使之按照人们的意愿遗传并表达出的蛋白质产物。产物。产物。产物。nn应用基因工程技术构建重组细胞并通过重组细胞培应用基因工程技术构建重组细胞并通过重组细胞培应用基因工程技术构建重组细胞并通过重组细胞培应用基因工程技术构建重组细胞并通过重组细胞培养，令其超量合成其它生物体内含量极微但却具有养，令其超量合成其它生物体内含量极微但却具有养，令其超量合成其它生物体内含量极微但却具有养
5、，令其超量合成其它生物体内含量极微但却具有极高经济价值重组蛋白是现代生物技术中最活跃的极高经济价值重组蛋白是现代生物技术中最活跃的极高经济价值重组蛋白是现代生物技术中最活跃的极高经济价值重组蛋白是现代生物技术中最活跃的研究方向之一，广泛应用于生产药用蛋白质及代谢研究方向之一，广泛应用于生产药用蛋白质及代谢研究方向之一，广泛应用于生产药用蛋白质及代谢研究方向之一，广泛应用于生产药用蛋白质及代谢工程等领域。工程等领域。工程等领域。工程等领域。nn已经投放市场并正在研制开发的重组蛋白药物几乎已经投放市场并正在研制开发的重组蛋白药物几乎已经投放市场并正在研制开发的重组蛋白药物几乎已经投放市场并正在研制
6、开发的重组蛋白药物几乎触及到医药的各个领域，包括各种抗病毒剂、抗癌触及到医药的各个领域，包括各种抗病毒剂、抗癌触及到医药的各个领域，包括各种抗病毒剂、抗癌触及到医药的各个领域，包括各种抗病毒剂、抗癌因子、抗因子、抗因子、抗因子、抗AIDSAIDS药物、新型抗生素、重组疫苗、重组药物、新型抗生素、重组疫苗、重组药物、新型抗生素、重组疫苗、重组药物、新型抗生素、重组疫苗、重组生长激素、重组干扰素、重组抗体、免疫辅助剂、生长激素、重组干扰素、重组抗体、免疫辅助剂、生长激素、重组干扰素、重组抗体、免疫辅助剂、生长激素、重组干扰素、重组抗体、免疫辅助剂、抗衰老保健品、心脑血管防护急救药、生长因子以抗衰老
7、保健品、心脑血管防护急救药、生长因子以抗衰老保健品、心脑血管防护急救药、生长因子以抗衰老保健品、心脑血管防护急救药、生长因子以及诊断试剂等。及诊断试剂等。及诊断试剂等。及诊断试剂等。 重组蛋白的生产包括重组蛋白的生产包括重组蛋白的生产包括重组蛋白的生产包括 上游技术和下游技上游技术和下游技上游技术和下游技上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是外源基因术两大组成部分。上游技术指的是外源基因术两大组成部分。上游技术指的是外源基因术两大组成部分。上游技术指的是外源基因重组、克隆和表达载体以及基因工程菌（细重组、克隆和表达载体以及基因工程菌（细重组、克隆和表达载体以及基因工程菌（细重组、克隆和
8、表达载体以及基因工程菌（细胞）的设计与构建；而下游技术则涉及到含胞）的设计与构建；而下游技术则涉及到含胞）的设计与构建；而下游技术则涉及到含胞）的设计与构建；而下游技术则涉及到含有重组外源基因的生物细胞（基因工程菌或有重组外源基因的生物细胞（基因工程菌或有重组外源基因的生物细胞（基因工程菌或有重组外源基因的生物细胞（基因工程菌或细胞）的大规模培养以及外源基因表达的重细胞）的大规模培养以及外源基因表达的重细胞）的大规模培养以及外源基因表达的重细胞）的大规模培养以及外源基因表达的重组蛋白的分离纯化过程。组蛋白的分离纯化过程。组蛋白的分离纯化过程。组蛋白的分离纯化过程。重组蛋白生产重组蛋白生产重组蛋
9、白生产重组蛋白生产基本流程图基本流程图基本流程图基本流程图 重组蛋白的整个过程由工程菌重组蛋白的整个过程由工程菌重组蛋白的整个过程由工程菌重组蛋白的整个过程由工程菌( (细胞细胞细胞细胞) )的设计构建（上游技的设计构建（上游技的设计构建（上游技的设计构建（上游技术）和基因产物（重组蛋白）的生产（下游技术）两大部分组术）和基因产物（重组蛋白）的生产（下游技术）两大部分组术）和基因产物（重组蛋白）的生产（下游技术）两大部分组术）和基因产物（重组蛋白）的生产（下游技术）两大部分组成，前者的单元操作过程如下成，前者的单元操作过程如下成，前者的单元操作过程如下成，前者的单元操作过程如下: : (1)
10、(1) 从供体细胞中分离出基因组从供体细胞中分离出基因组从供体细胞中分离出基因组从供体细胞中分离出基因组DNADNA，用限制性核酸内切酶分，用限制性核酸内切酶分，用限制性核酸内切酶分，用限制性核酸内切酶分别将外源别将外源别将外源别将外源DNA(DNA(包括外源基因或目的基因包括外源基因或目的基因包括外源基因或目的基因包括外源基因或目的基因) )和载体分子切开和载体分子切开和载体分子切开和载体分子切开( (简简简简称切称切称切称切); ); (2) (2) 用用用用DNADNA连接酶将含有外源基因的连接酶将含有外源基因的连接酶将含有外源基因的连接酶将含有外源基因的DNADNA片段接到载体分子上片
11、段接到载体分子上片段接到载体分子上片段接到载体分子上，形成，形成，形成，形成DNADNA重组分子重组分子重组分子重组分子( (简称接简称接简称接简称接); ); (3) (3) 借助于细胞转化手段将借助于细胞转化手段将借助于细胞转化手段将借助于细胞转化手段将DNADNA重组分子导入受体细胞中重组分子导入受体细胞中重组分子导入受体细胞中重组分子导入受体细胞中( (简简简简称转称转称转称转); ); (4) (4) 短时间培养转化细胞，以扩增短时间培养转化细胞，以扩增短时间培养转化细胞，以扩增短时间培养转化细胞，以扩增DNADNA重组分子或使其整合到重组分子或使其整合到重组分子或使其整合到重组分子
12、或使其整合到受体细胞的基因组中受体细胞的基因组中受体细胞的基因组中受体细胞的基因组中( (简称增简称增简称增简称增); ); (5) (5) 筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因高效稳定表达的基筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因高效稳定表达的基筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因高效稳定表达的基筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞因工程菌或细胞因工程菌或细胞因工程菌或细胞( (简称检简称检简称检简称检) )。 由此可见，基因工程的上游操作过程可简化为由此可见，基因工程的上游操作过程可简化为由此可见，基因工程的上游操作过程可简化为由此可见，基因工程的上游操作过程可简化为:
13、 :切、接、转、切、接、转、切、接、转、切、接、转、增、检。增、检。增、检。增、检。nnThe DNA containing the gene must be isolated away The DNA containing the gene must be isolated away from its genomic contextfrom its genomic contextnnThat should be simple but there are big problemsThat should be simple but there are big problemsGene of in
14、terestCloning can supply large quantities of recombinant DNASingle bacterium transformed with single copy of plasmid which is subsequently replicatedGrowth to a colonyProvides several m mg of recombinant DNAProvides several mg of recombinant DNAInoculate into liquid broth重组蛋白表达的典型穿梭载体。重组蛋白表达的典型穿梭载体。
15、MCS = 多克隆位点；多克隆位点；Op = 细菌复制起始位点；细菌复制起始位点； Mp = 细菌中的选择性基因；细菌中的选择性基因；ME = 真核生物中的选择性基因；真核生物中的选择性基因； OE = 真核复制起始位点；真核复制起始位点；PE = 真核启动子；真核启动子；TE = 真核中止子；真核中止子；hG = 表达的外源基因。表达的外源基因。重组蛋白的表达系统重组蛋白的表达系统重组蛋白的表达系统重组蛋白的表达系统 所谓重组蛋白的表达系统，是指生产重组蛋白所谓重组蛋白的表达系统，是指生产重组蛋白所谓重组蛋白的表达系统，是指生产重组蛋白所谓重组蛋白的表达系统，是指生产重组蛋白的基因工程宿主菌
16、或宿主细胞。的基因工程宿主菌或宿主细胞。的基因工程宿主菌或宿主细胞。的基因工程宿主菌或宿主细胞。 目前常用的表达系统宿主要有原核的细菌（主目前常用的表达系统宿主要有原核的细菌（主目前常用的表达系统宿主要有原核的细菌（主目前常用的表达系统宿主要有原核的细菌（主要是大肠杆菌，要是大肠杆菌，要是大肠杆菌，要是大肠杆菌，E. Coli.E. Coli.）和真核的酵母菌、昆虫细）和真核的酵母菌、昆虫细）和真核的酵母菌、昆虫细）和真核的酵母菌、昆虫细胞、动物细胞系以及近年发展起来的盘基网柄菌系胞、动物细胞系以及近年发展起来的盘基网柄菌系胞、动物细胞系以及近年发展起来的盘基网柄菌系胞、动物细胞系以及近年发展
17、起来的盘基网柄菌系统。统。统。统。1 1、原核生物表达系统细菌、原核生物表达系统细菌 ( (E. coli.E. coli.) )2 2、真核生物表达系统酵母菌、真核生物表达系统酵母菌(Yeast)(Yeast)3 3、动物细胞、动物细胞4 4、昆虫细胞、昆虫细胞4 4、新型真核表达系统盘基网柄菌、新型真核表达系统盘基网柄菌 盘基网柄菌盘基网柄菌盘基网柄菌盘基网柄菌( (DictyosteliumDictyostelium discoideumdiscoideum) )属于真属于真属于真属于真菌界的粘菌亚界的聚粘霉纲菌界的粘菌亚界的聚粘霉纲菌界的粘菌亚界的聚粘霉纲菌界的粘菌亚界的聚粘霉纲( (
18、AcrasiomzcetesAcrasiomzcetes) )。18691869年真菌学家年真菌学家年真菌学家年真菌学家Oskar Oskar BrefeldBrefeld首次描述了盘基网柄首次描述了盘基网柄首次描述了盘基网柄首次描述了盘基网柄菌。盘基网柄菌属菌。盘基网柄菌属菌。盘基网柄菌属菌。盘基网柄菌属D. D. discoideumdiscoideum由由由由RaperRaper 1935 1935年年年年发现。在自然界中发现。在自然界中发现。在自然界中发现。在自然界中D. D. discoideumdiscoideum 通过吞噬土壤表通过吞噬土壤表通过吞噬土壤表通过吞噬土壤表面的细菌摄
19、取营养和繁殖。面的细菌摄取营养和繁殖。面的细菌摄取营养和繁殖。面的细菌摄取营养和繁殖。盘基网柄菌的生命周期生长阶段生长阶段发育阶段发育阶段 细胞聚集细胞聚集 细胞分化细胞分化 移动移动 达到顶点达到顶点 植物体植物体生长阶段生长阶段生长阶段生长阶段 (growth phase)(growth phase)吞噬细胞吞噬细胞胞饮无菌培养基胞饮无菌培养基 (AX (AX2 2, AX, AX3 3 和和 AXAX4 4) )丝足丝足伪足伪足吞噬细胞 (Phagocytosis）细胞聚集 (Aggregation)细胞分化 (Cell differentiation)移动阶段 (Migration p
20、hase)假原质团假原质团(Pseudoplasmodium)(Pseudoplasmodium) Prestalk cells (15 %)Prestalk cells (15 %) Prespores cells Prespores cells (75%)(75%)固体表面固体表面顶点 （Culmination）植物体形成不同表达系统的比较不同表达系统的比较重组基因工程菌的高密度培养重组基因工程菌的高密度培养n培养基组成的优化培养基组成的优化n 流加流加n固定化固定化n罐流床罐流床n微过滤微过滤 下下 游游培养基组成的优化培养基组成的优化碳源种类的选择碳源种类的选择碳源种类的选择碳源种类的
21、选择下游：培养基组成的优化下游：培养基组成的优化基因工程菌培养技术基因工程菌培养技术基因工程菌培养技术基因工程菌培养技术流加培养流加培养2L2L发酵罐中流加培养盘基网柄菌生产发酵罐中流加培养盘基网柄菌生产发酵罐中流加培养盘基网柄菌生产发酵罐中流加培养盘基网柄菌生产hFasLhFasL基因工程菌的固定化培养基因工程菌的固定化培养基因工程菌的固定化培养基因工程菌的固定化培养nn将基因工程菌固定在多孔载体上，可提高菌体将基因工程菌固定在多孔载体上，可提高菌体将基因工程菌固定在多孔载体上，可提高菌体将基因工程菌固定在多孔载体上，可提高菌体密度，实现连续发酵，为利用其生产异源蛋白密度，实现连续发酵，为利
22、用其生产异源蛋白密度，实现连续发酵，为利用其生产异源蛋白密度，实现连续发酵，为利用其生产异源蛋白提供了有效途径。提供了有效途径。提供了有效途径。提供了有效途径。nn多孔载体：多孔陶瓷、浮石、片状硅胶泡沫和多孔载体：多孔陶瓷、浮石、片状硅胶泡沫和多孔载体：多孔陶瓷、浮石、片状硅胶泡沫和多孔载体：多孔陶瓷、浮石、片状硅胶泡沫和柱状硅胶泡沫等。柱状硅胶泡沫等。柱状硅胶泡沫等。柱状硅胶泡沫等。CeramTec (1.5-2.5 mmCeramTec (1.5-2.5 mm）PumicePumice（(1.5-2.5 mm(1.5-2.5 mm）ImmobasilImmobasil FS (0.8D ,
23、0.2 H ) FS (0.8D ,0.2 H )ImmobasilImmobasil R (4O.D/2I.D R (4O.D/2I.D ,4L),4L)固定化培养基因工程菌细胞固定化培养基因工程菌细胞载体表面和内部的细胞固定化电镜扫描照片载体表面和内部的细胞固定化电镜扫描照片载体表面和内部的细胞固定化电镜扫描照片载体表面和内部的细胞固定化电镜扫描照片多孔陶瓷多孔陶瓷浮石浮石生物微胶囊固定化生物微胶囊固定化生物微胶囊固定化生物微胶囊固定化罐流床反应器连续培养固定化细胞罐流床反应器连续培养固定化细胞罐流床反应器连续培养固定化细胞罐流床反应器连续培养固定化细胞利用微过滤实现工程菌高密度培养利用微
24、过滤实现工程菌高密度培养重组蛋白的分离纯化（下游技术）重组蛋白的分离纯化（下游技术） 生化分离工作的一般过程生化分离工作的一般过程生化分离工作的一般过程生化分离工作的一般过程 动、植物组织、体液等动、植物组织、体液等动、植物组织、体液等动、植物组织、体液等 胞外产物胞外产物胞外产物胞外产物 提取提取提取提取发酵液发酵液发酵液发酵液 预处理预处理预处理预处理 cc分离分离分离分离 cc破碎破碎破碎破碎 碎片分离碎片分离碎片分离碎片分离 初步纯化初步纯化初步纯化初步纯化 精制精制精制精制 制成品制成品制成品制成品培培培培养养养养液液液液 加加加加 热热热热 沉沉沉沉 淀淀淀淀 匀匀匀匀 化化化化
25、离离离离 心心心心 沉沉沉沉 淀淀淀淀 分子筛分子筛分子筛分子筛 无菌过滤无菌过滤无菌过滤无菌过滤酶酶酶酶反反反反应应应应 调调调调 pH pH pH pH 离离离离 心心心心 超超超超 声声声声 萃萃萃萃 取取取取 吸吸吸吸 附附附附 离离离离 子子子子 超超超超 滤滤滤滤 絮絮絮絮 凝凝凝凝 过过过过 滤滤滤滤 胞胞胞胞 溶溶溶溶 过过过过 滤滤滤滤 萃萃萃萃 取取取取 亲亲亲亲 和和和和 冻冻冻冻 干干干干 错错错错流流流流过过过过滤滤滤滤 研研研研 磨磨磨磨 错错错错流流流流过过过过滤滤滤滤 超超超超 滤滤滤滤 吸吸吸吸 附附附附 喷喷喷喷 干干干干 憎憎憎憎 水水水水 结结结结 晶晶
26、晶晶 电电电电 泳泳泳泳重组蛋白的分离纯化（下游技术）重组蛋白的分离纯化（下游技术）nn预处理及固液分离技术预处理及固液分离技术 细胞破碎细胞破碎 重组蛋白的包涵体处理技术重组蛋白的包涵体处理技术 离心离心 膜分离技术膜分离技术 双水相萃取双水相萃取 反胶束提取纯化技术反胶束提取纯化技术 超临界萃取技术超临界萃取技术nn吸附（色谱）分离技术吸附（色谱）分离技术吸附（色谱）分离技术吸附（色谱）分离技术 活性炭活性炭活性炭活性炭 氧化铝氧化铝氧化铝氧化铝 硅胶硅胶硅胶硅胶 滑石粉滑石粉滑石粉滑石粉 硅藻土硅藻土硅藻土硅藻土 大网格聚合物吸附大网格聚合物吸附大网格聚合物吸附大网格聚合物吸附nn固相析
27、出分离法固相析出分离法固相析出分离法固相析出分离法 盐析法盐析法盐析法盐析法 有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法 等电点沉淀等电点沉淀等电点沉淀等电点沉淀 其它沉淀法其它沉淀法其它沉淀法其它沉淀法 水溶性非离子型聚合物沉淀剂水溶性非离子型聚合物沉淀剂水溶性非离子型聚合物沉淀剂水溶性非离子型聚合物沉淀剂 金属离子和络合物沉淀金属离子和络合物沉淀金属离子和络合物沉淀金属离子和络合物沉淀 离子型多聚物沉淀剂离子型多聚物沉淀剂离子型多聚物沉淀剂离子型多聚物沉淀剂 亲和沉淀亲和沉淀亲和沉淀亲和沉淀 结晶法结晶法结晶法结晶法nn重组蛋白的色谱分离法重组蛋白的色谱分离法重组蛋白的色谱分离法重组蛋白的色谱分离法 凝胶色谱凝胶色谱凝胶色谱凝胶色谱/ /分子筛色谱分子筛色谱分子筛色谱分子筛色谱 离子交换离子交换离子交换离子交换 亲和层析亲和层析亲和层析亲和层析 电色谱电色谱电色谱电色谱nn电泳分离技术电泳分离技术电泳分离技术电泳分离技术 平板电泳平板电泳平板电泳平板电泳 连续凝胶电泳连续凝胶电泳连续凝胶电泳连续凝胶电泳 等电聚焦点用等电聚焦点用等电聚焦点用等电聚焦点用 毛细管电泳毛细管电泳毛细管电泳毛细管电泳 连续流动电用连续流动电用连续流动电用连续流动电用 无载体连续流动电泳无载体连续流动电泳无载体连续流动电泳无载体连续流动电泳
