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1、 第九章第九章 动物细胞基因工程（）动物细胞基因工程（） 第一节第一节 基因转移的概念和生物学意义基因转移的概念和生物学意义 第二节第二节 基因导入的技术方法基因导入的技术方法 第三节第三节 外源基因表达的检测外源基因表达的检测课间结束习题第一节第一节 基因转移的概念和生物学意义基因转移的概念和生物学意义一、一、基因转移技术的种类基因转移技术的种类二、二、受体细胞和基因导入方法的选择受体细胞和基因导入方法的选择课间结束习题第二节第二节 基因导入的技术方法基因导入的技术方法一、一、 微小细胞融合介导的基因转导微小细胞融合介导的基因转导二、二、 磷酸钙转染法磷酸钙转染法三、三、 脂质体介导转染法脂
2、质体介导转染法四、四、 电击法电击法五、五、 葡聚糖转染法葡聚糖转染法六、六、 细胞显微注射转染法细胞显微注射转染法 课间结束第一节第一节 基因转移的概念和生物学意义基因转移的概念和生物学意义 把外源基因导入细胞中的技术称基因把外源基因导入细胞中的技术称基因转移转移(Gene Transfer)(Gene Transfer)或转基因技术。其主或转基因技术。其主要意义在于：要意义在于： 1 1）检测基因的性状和功能。）检测基因的性状和功能。 2 2）产生特殊细胞组分或蛋白。）产生特殊细胞组分或蛋白。 3 3）遗传病的诊断与治疗（动物模型）。）遗传病的诊断与治疗（动物模型）。 4 4）病变或癌变机
3、理研究。）病变或癌变机理研究。 5 5）动物优良品种的培育（转基因动物）动物优良品种的培育（转基因动物）。 6 6）生物反应器制备。）生物反应器制备。 一、基因转导技术的种类一、基因转导技术的种类 基因转移可在染色体和基因转移可在染色体和DNADNA大分子两个大分子两个水平上进行。水平上进行。染色体转导染色体转导（chromosome chromosome transductiontransduction）是利用细胞融合或显微注）是利用细胞融合或显微注射法把携有目的基因的染色体或染色体片射法把携有目的基因的染色体或染色体片段导入受体细胞段导入受体细胞( (或称宿主细胞或称宿主细胞) )内的技术
4、。内的技术。而而基因转导基因转导（Gene transductionGene transduction）或）或转染转染（transfectiontransfection）是把已克隆的基因、含）是把已克隆的基因、含有目的基因的有目的基因的DNADNA片段或序列等，导入受体片段或序列等，导入受体细胞基因组中的技术。细胞基因组中的技术。 基因转导的具体技术方法当前有：磷基因转导的具体技术方法当前有：磷酸钙法、脂质体介导法、电击法和酸钙法、脂质体介导法、电击法和DEAEDEAE葡葡聚糖法等多种。聚糖法等多种。 从基因表达的持续性上可分为从基因表达的持续性上可分为稳定表稳定表达达(Stable or P
5、ermanent)(Stable or Permanent)和和瞬时表达瞬时表达( (transienttransient 或短期表达或短期表达) )两类。两类。 稳定表达是导入基因已被整合入受体稳定表达是导入基因已被整合入受体细胞基因组中，从而能长期进行表达；对细胞基因组中，从而能长期进行表达；对这类表达的检测，需借助筛选标记这类表达的检测，需借助筛选标记(Selected Marker)(Selected Marker)，才能测知。，才能测知。 瞬时表达，在基因转移后一周内即可观瞬时表达，在基因转移后一周内即可观察到基因表达现象，但不持久，随时间推察到基因表达现象，但不持久，随时间推移表达
6、渐减弱或消失。瞬时表达的机理尚移表达渐减弱或消失。瞬时表达的机理尚不清楚，可能与被导入的基因末进行整合不清楚，可能与被导入的基因末进行整合有关。有关。细胞内转基因技术可归纳如下：细胞内转基因技术可归纳如下： 细胞融合技术细胞融合技术 染色体转导染色体转导 磷酸钙法磷酸钙法 染色体注射染色体注射 电击法电击法 脂质体法脂质体法 细胞内基因转导细胞内基因转导 显微注射法显微注射法 基因转染基因转染 逆转录病毒介导法逆转录病毒介导法 （体细胞）（体细胞） 其他其他 基因转导基因转导 转基因动物转基因动物 （生殖细胞）（生殖细胞）二、受体细胞和基因转导方法的选择二、受体细胞和基因转导方法的选择 受体细
7、胞对导入后基因的表达有很大受体细胞对导入后基因的表达有很大影响。基因导入后的表达与受体细胞性状、影响。基因导入后的表达与受体细胞性状、细胞种类、来源有密切关系。同一基因导细胞种类、来源有密切关系。同一基因导入不同细胞，可能产生不同表达效果。入不同细胞，可能产生不同表达效果。 细胞选择以细胞选择以球蛋白基因为例；它是球蛋白基因为例；它是一种低水平表达基因，在一种低水平表达基因，在HelaHela细胞中无表细胞中无表达；但如导入达；但如导入MELMEL14(14(小鼠红白血癌细胞小鼠红白血癌细胞) )细胞中，却能促细胞中，却能促MELMEL1414细胞发生分化。据细胞发生分化。据此，检测此，检测球
8、蛋白基因时，需用球蛋白基因时，需用MELMEL1414而而不用不用HelaHela细胞。从而受体细胞的选择绝不细胞。从而受体细胞的选择绝不是无关紧要的。是无关紧要的。 在技术方法选择上，若目的在于获取在技术方法选择上，若目的在于获取瞬时表达效果，所有方法都可用。瞬时表达效果，所有方法都可用。 稳定表达可选磷酸钙法、电击法和脂稳定表达可选磷酸钙法、电击法和脂质体介导法，均有稳定转染效应。质体介导法，均有稳定转染效应。 磷酸钙法和脂质体介导法利于被转染磷酸钙法和脂质体介导法利于被转染的的DNADNA附在细胞表面，而后被细胞吞入，此附在细胞表面，而后被细胞吞入，此两种方法适用于贴附生长细胞的转化。两
9、种方法适用于贴附生长细胞的转化。第二节第二节 技术与方法技术与方法一、微小细胞融合介导的基因转导一、微小细胞融合介导的基因转导( (染色体染色体导入导入) )1.1.原理原理 用常规方法制备的高分子量用常规方法制备的高分子量DNADNA片段一片段一般在般在505080kb80kb，因此用，因此用DNADNA转染法所转导的转染法所转导的DNADNA片段长度受到限制。另外在片段长度受到限制。另外在DNADNA转染过转染过程中，片段过长有可能人为地造成基因的程中，片段过长有可能人为地造成基因的损伤或异常改变等。因此是否能转移完整损伤或异常改变等。因此是否能转移完整的的DNADNA是一个十分重要的问题
10、。是一个十分重要的问题。 应用微小细胞融合技术可将单个的、未应用微小细胞融合技术可将单个的、未受损伤的染色体从一种细胞转导到另一种受损伤的染色体从一种细胞转导到另一种细胞。细胞。应用这一技术得到的杂交细胞，是应用这一技术得到的杂交细胞，是研究基因定位、哺乳动物基因结构、表达、研究基因定位、哺乳动物基因结构、表达、调控的理想模型。调控的理想模型。2.2.方法：方法： 微小细胞融合介导基因转导技术所涉微小细胞融合介导基因转导技术所涉及到的主要实验方法和步骤较多，但主要及到的主要实验方法和步骤较多，但主要为以下基本部分：为以下基本部分：将选择性标志基因转导供体细胞；将选择性标志基因转导供体细胞；制备
11、微小细胞；制备微小细胞；微小细胞与受体细胞融合；微小细胞与受体细胞融合；杂交细胞筛选及鉴定。杂交细胞筛选及鉴定。 将选择标记基因导入供体细胞将选择标记基因导入供体细胞 将标志基因导入受体细胞并整合到染将标志基因导入受体细胞并整合到染色体基因组中，带有标志基因的细胞可进色体基因组中，带有标志基因的细胞可进行筛选。如含有抗新霉素基因行筛选。如含有抗新霉素基因(neo)(neo)的细胞，的细胞，可在含可在含G418G418的培养基中生长；的培养基中生长； 制备微小细胞制备微小细胞 主要的实验步骤为诱导细胞形成微核、主要的实验步骤为诱导细胞形成微核、排核产生微小细胞、纯化微小细胞。排核产生微小细胞、纯
12、化微小细胞。 贴壁细胞、半贴壁细胞及悬浮细胞都贴壁细胞、半贴壁细胞及悬浮细胞都可用以下方法诱导产生微核。可用以下方法诱导产生微核。 (1) (1)诱导细胞产生微核：接种细胞培养诱导细胞产生微核：接种细胞培养至至8080一一9090汇合，加秋水仙胺汇合，加秋水仙胺m1m1，培养，培养2424小时，收集分裂中期细胞；小时，收集分裂中期细胞； (2) (2)低渗处理：用在培养液中加入等体低渗处理：用在培养液中加入等体积的无菌三蒸水的办法低渗；将细胞悬浮积的无菌三蒸水的办法低渗；将细胞悬浮在低渗培养液中，置在低渗培养液中，置3737作用作用10103030分分钟，时间因细胞不同而异。对大多数不易钟，时
13、间因细胞不同而异。对大多数不易形成微核的细胞均可用此法；形成微核的细胞均可用此法； (3) (3)低渗处理后，低渗处理后，10001000转离心转离心3 3分钟，分钟，用常规培养液用常规培养液( (不含秋水仙胺不含秋水仙胺) )培养过夜；培养过夜； (4) (4)经上述诱导产生的微核细胞，可用经上述诱导产生的微核细胞，可用GiemsaGiemsa染色后或不染色在相差显微镜下观染色后或不染色在相差显微镜下观察。察。 排核排核 根据细胞经诱导产生微核后贴壁松紧根据细胞经诱导产生微核后贴壁松紧的程度，选择排核的方法。的程度，选择排核的方法。 (1)(1)贴壁细胞生长在贴壁细胞生长在25cm25cm2
14、 2 Coster Coster 培培养瓶养瓶( (这种培养瓶的厚度比常规培养瓶薄，这种培养瓶的厚度比常规培养瓶薄，瓶口为垂直而且比较小，生长面积为瓶口为垂直而且比较小，生长面积为25cm25cm2 2，容积为，容积为40m1)40m1)。去掉培养液，加入含有。去掉培养液，加入含有10g10gm1m1细胞松弛素细胞松弛素B B的无血清培养液至的无血清培养液至瓶口，用瓶盖盖紧，置瓶口，用瓶盖盖紧，置3737温育温育3030分钟；分钟； (2) (2)离心排核：用角头转子离心排核：用角头转子JAl0JAl0，在离，在离心筒里加入心筒里加入150m1 37150m1 37的温水，将培养瓶的温水，将培
15、养瓶长有细胞的一面向下放入转子筒内，离心长有细胞的一面向下放入转子筒内，离心力力10 000g10 000g，3434离心离心6565分钟，离心后细胞分钟，离心后细胞沉在瓶下角，避免震荡，去上清，加入新沉在瓶下角，避免震荡，去上清，加入新鲜培养液，用吸管将细胞沉淀混匀后置冰鲜培养液，用吸管将细胞沉淀混匀后置冰上备用；上备用； (3) (3)悬浮细胞排核：悬浮细胞排核： 采用梯度离心法，用采用梯度离心法，用PercollPercoll加等体积加等体积无血清培养液。用含有细胞松弛素无血清培养液。用含有细胞松弛素B B，终浓，终浓度度10g10gm1m1的的DMEMDMEM，将细胞悬浮在梯度离，将细
16、胞悬浮在梯度离心液中，心液中，3737育温育温3030分钟，置分钟，置Sorvall Sorvall SSSS3434角头转子，角头转子，23500g23500g，3434离心离心6565分分钟，停转时勿用刹车。钟，停转时勿用刹车。 离心后可见离心后可见3 3条带，上层为细胞膜及细条带，上层为细胞膜及细胞碎片，中层为微小细胞，下层为微小细胞碎片，中层为微小细胞，下层为微小细胞和完整细胞核混合物。胞和完整细胞核混合物。 用吸管小心将中间一条带吸出，置入用吸管小心将中间一条带吸出，置入50m150m1离心管中，然后加入等体积无血清培离心管中，然后加入等体积无血清培养液，养液，30003000转离心
17、转离心1010分钟弃去上清，将微分钟弃去上清，将微小细胞沉淀悬浮在无血清培养液中置冰上小细胞沉淀悬浮在无血清培养液中置冰上备用。备用。 纯化微小细胞纯化微小细胞 (1) (1)将上述制备的细胞悬液用无血清培养将上述制备的细胞悬液用无血清培养液稀释至液稀释至120m1120m1，依次通过，依次通过12m12m、8m8m、5m5m和和3m3m的微孔滤器，过滤时尽量避免的微孔滤器，过滤时尽量避免用力，以防较大的细胞核或完整细胞核穿用力，以防较大的细胞核或完整细胞核穿过滤膜；过滤膜； (2) (2)滤过后的细胞悬液，以滤过后的细胞悬液，以30003000转，转，44离心离心2020分钟，细胞沉淀即为微
18、小细胞，分钟，细胞沉淀即为微小细胞，将其悬浮在将其悬浮在6m16m1无血清培养液中，置冰上备无血清培养液中，置冰上备用。用。 每次实验取十分之一体积的微小细胞每次实验取十分之一体积的微小细胞悬液制备细胞滴片，用悬液制备细胞滴片，用GiemsaGiemsa染色观察微染色观察微小细胞的形态。小细胞的形态。 微小细胞融合及融合细胞的筛选微小细胞融合及融合细胞的筛选 (1) (1)在在微小细胞微小细胞悬液中加入植物血凝素悬液中加入植物血凝素P(PHAP(PHAP)P)，终浓度，终浓度50Pg50Pgm1m1，将已准备好，将已准备好的的受体细胞受体细胞弃去培养液，用无血清培养液弃去培养液，用无血清培养液
19、洗一遍以去掉血清，加入洗一遍以去掉血清，加入1m1 1m1 微小细胞悬微小细胞悬液，置液，置3737培养培养2020分钟，待微小细胞与受分钟，待微小细胞与受体细胞粘在一起后，去掉培养液，加体细胞粘在一起后，去掉培养液，加4444PEGPEG处理处理40406060秒，用无血清培养液洗秒，用无血清培养液洗3 3遍，遍，加常规培养液置加常规培养液置3737培养。培养。 (2) (2)融合细胞筛选：融合细胞筛选： 融合后的细胞培养融合后的细胞培养2424小时，以小时，以1 1：3 3分瓶分瓶传代，培养传代，培养24244848小时后加入选择培养基，小时后加入选择培养基，如含如含G418G418的培养
20、液，每隔的培养液，每隔3 35 5天换液一次，天换液一次，筛选筛选2 23 3周。周。 杂交细胞的鉴定杂交细胞的鉴定 (1) (1)经上述方法筛选得到的杂交细胞，经上述方法筛选得到的杂交细胞，无论是具有形态转化的，还是无论是具有形态转化的，还是G418G418抗性的，抗性的，最后确定染色体转移是否成功，应确定有最后确定染色体转移是否成功，应确定有无外源性染色体转移，除核型分析外，可无外源性染色体转移，除核型分析外，可用下列方法：用下列方法： Giemsa Giemsa 分化性染色：是最简便的、分化性染色：是最简便的、用于确定人鼠杂交细胞中是否有人的染色用于确定人鼠杂交细胞中是否有人的染色体的方
21、法之一。常规制备染色体标本、室体的方法之一。常规制备染色体标本、室温下老化一天，用三蒸水浸泡温下老化一天，用三蒸水浸泡(37)(37)过夜，过夜，用用6 6GiemsaGiemsa溶液，做分化性染色溶液，做分化性染色3 3分钟，分钟，水洗、镜下观察。可根据着色深浅判定结水洗、镜下观察。可根据着色深浅判定结果。果。 PCR PCR的应用：对于转移的某些基因可的应用：对于转移的某些基因可用用PCRPCR进行检测，如进行检测，如G418G418抗性基因抗性基因neoneo或在或在小鼠细胞中检测某些人的基因等，都可用小鼠细胞中检测某些人的基因等，都可用PCRPCR进行检测是否转移成功，此法快速简便。进
22、行检测是否转移成功，此法快速简便。 染色体原位杂交的应用染色体原位杂交的应用 目前用非同位素标记的原位杂交技术目前用非同位素标记的原位杂交技术已普遍应用到染色体基因定位，用生物素已普遍应用到染色体基因定位，用生物素或地高辛标记，操作方便，实验周期短，或地高辛标记，操作方便，实验周期短，特异性好。特异性好。技术特点总结：技术特点总结： 应用微小细胞融合介导的基因转移，应用微小细胞融合介导的基因转移，DNADNA没有受到损伤，蛋白和没有受到损伤，蛋白和DNADNA也没有分离，也没有分离，其基因的结构是完整的，所反映的是原来其基因的结构是完整的，所反映的是原来的本质。因而这一点有别于其它的转移方的本
23、质。因而这一点有别于其它的转移方式。式。 不足之处是该方法实验程序复杂不足之处是该方法实验程序复杂, ,周期周期长，涉及到的技术多，应注意所用技术的长，涉及到的技术多，应注意所用技术的标准化。标准化。 二、磷酸钙转染法二、磷酸钙转染法 此法是简便易行的分子水平经典的此法是简便易行的分子水平经典的DNADNA转移技术，癌基因的始动工作便是用此法转移技术，癌基因的始动工作便是用此法完成的，现虽存在有多种技术，但本法仍完成的，现虽存在有多种技术，但本法仍有其应用价值。有其应用价值。 1 1 原理：原理： 把外源基因作为转染物，与磷酸钙转把外源基因作为转染物，与磷酸钙转染液混合，加入到被转染的培养细胞
24、环境染液混合，加入到被转染的培养细胞环境中，能使外源基因进入细胞内并整合或掺中，能使外源基因进入细胞内并整合或掺入入(Intergrate)(Intergrate)到受体细胞的基因组中。到受体细胞的基因组中。这一过程称作这一过程称作基因转染基因转染(Gene (Gene Transfection)Transfection)。磷酸钙液促基因转移的机磷酸钙液促基因转移的机制尚不明了。制尚不明了。 2 2 转染方法：转染方法： 材料：材料： NIHNIH3T33T3细胞细胞( (受体细胞受体细胞) ) 基因组基因组DNA(DNA(含癌基因含癌基因) ) 磷酸转染液磷酸转染液NaCl 8.0g NaC
25、l 8.0g 用时现配，用时现配，pHpH很重要很重要，HEPES 5.0g HEPES 5.0g 一定要控制在；一定要控制在； NaNa2 2HPOHPO4 4 0.099g 0.099g 滤过消毒，一滤过消毒，一20 20 加三蒸水至加三蒸水至 1000.0ml 1000.0ml 贮存贮存 步骤：步骤： (1)(1)提取基因提取基因DNA(DNA(略略) )； (2)DNA(2)DNA准备：取供体准备：取供体DNA50DNA50100g100g，加加3M NaCl3M NaCl或醋酸钠使最终浓度至或醋酸钠使最终浓度至 混匀；混匀； (3) (3)再加再加2 2倍体积无水乙醇，倍体积无水乙醇
26、，30003000转转分离心分离心1010分钟，去上清；分钟，去上清； (4)(4)加入转染缓冲液，待加入转染缓冲液，待DNADNA充分溶解充分溶解后，再加入后，再加入2.5M 2.5M CaClCaCl2 2，令最终浓度为，令最终浓度为125mM125mM，用吸管轻轻吹打三次，用吸管轻轻吹打三次( (不用搅拌器不用搅拌器以防以防DNADNA拌结拌结) )。置室温下。置室温下10103030分钟，待分钟，待液体透明度降低，出现微浊蓝色时，即可液体透明度降低，出现微浊蓝色时，即可用于转染受体细胞；用于转染受体细胞； (5) (5)细胞：取生长状态良好、处于半汇细胞：取生长状态良好、处于半汇合阶段
27、的指数增生期细胞，在转染前合阶段的指数增生期细胞，在转染前4 4小时，小时，更换培养液更换培养液(5(5毫升瓶毫升瓶)1)1次；次； (6)(6)转染：向每瓶中加转染：向每瓶中加DNADNA磷酸钙沉磷酸钙沉淀物淀物1m11m1瓶，置瓶，置3737作用作用4 46 6小时；小时； (7)(7)培养：弃去培养液，用培养：弃去培养液，用1515甘油处甘油处理理3 3分钟，无血清培养漂洗分钟，无血清培养漂洗1 1次，加入新培次，加入新培养液，养液，3737温箱培养温箱培养2424小时；小时； (8) (8)传代：按传代：按1 1：5 5或或1 1：1010分瓶传代；分瓶传代；每每2 23 3天换液天换
28、液1 1次，接近汇合时血清用量降次，接近汇合时血清用量降至至5 5，培养，培养2 23 3周。周。 (9)(9)检测：逐日观察，待出现转化灶后，检测：逐日观察，待出现转化灶后，分离入另瓶中培养。分离入另瓶中培养。 标记基因共转染标记基因共转染(Co(CoTransfection)Transfection) 用用含含癌癌基基因因的的总总DNADNA转转染染成成纤纤维维型型受受体体细细胞胞诱诱发发形形成成转转化化灶灶后后，转转化化细细胞胞与与末末转转化化细细胞胞在在形形态态上上有有显显著著不不同同。便便于于把把转转化化细细胞胞从从未未转转化化细细胞胞群群中中分分离离出出来来做做进进一一步步的分析和
29、测试。的分析和测试。在在不形成转化灶不形成转化灶时或转化细胞与末转化细时或转化细胞与末转化细胞在形态上难以区分时，既难肯定是否把胞在形态上难以区分时，既难肯定是否把癌基因已转入受体细胞中，也无法把含有癌基因已转入受体细胞中，也无法把含有外源基因的细胞分离出来。在这种情况下，外源基因的细胞分离出来。在这种情况下，标记基因标记基因(Marker Gene)(Marker Gene)的共转染法很为适的共转染法很为适用。常用抗新霉素用。常用抗新霉素neoneo基因共转染法。基因共转染法。 新霉素新霉素( (neomycinneomycin G418)G418)能影响能影响80S80S核核糖体的功能和蛋
30、白质的合成，有杀死细胞糖体的功能和蛋白质的合成，有杀死细胞的作用。的作用。neoneo基因即基因即3 3磷酸转移酶基因，磷酸转移酶基因，它具有抗新霉素的作用，能使它具有抗新霉素的作用，能使G418G418失活。失活。如把如把neoneo基因整合入某一细胞中后，再用基因整合入某一细胞中后，再用G418G418处理此细胞时，则该细胞能产生对处理此细胞时，则该细胞能产生对G418G418的抗性而不被杀死。的抗性而不被杀死。 当当把把neoneo基基因因与与目目的的基基因因连连接接后后转转染染时时, ,能能保保证证转转染染细细胞胞必必定定含含有有目目的的基基因因；当当不不进进行行连连接接共共同同转转染
31、染细细胞胞时时，由由于于neoneo基基因因量量少少，大大多多数数已已摄摄入入neoneo基基因因的的细细胞胞也也同同时时摄摄入入目目的的基基因因，然然后后再再用用新新霉霉素素处处理理细细胞胞进进行筛选。行筛选。 人细胞和动物细胞在人细胞和动物细胞在G418G418中都难以维中都难以维持生存，而含有持生存，而含有neoneo基因的细胞因有抗性，基因的细胞因有抗性，得以存活下来。而这些细胞因含有外源转得以存活下来。而这些细胞因含有外源转染掺入的染掺入的DNADNA，从而也能把已转染外源基因，从而也能把已转染外源基因的细胞保留和区别出来。的细胞保留和区别出来。 常用的常用的neoneo基因是携有此
32、基因的载体基因是携有此基因的载体质粒质粒(pSV2(pSV2neo)neo)作为标记基因。作为标记基因。 用品材料：用品材料： 基因组基因组DNA(DNA(含癌基因含癌基因) ) neo neo基因基因(pSV2(pSV2neoneo质粒质粒) ) G418 G418培养液培养液 200200一一800g800gm1m1 小牛血清小牛血清 1010 磷酸转染液磷酸转染液( (配法见前节配法见前节) ) DMEM DMEM培养液培养液 步骤：步骤： (1)G418(1)G418配制：取配制：取l l克克G418G418溶于溶于l ml l l ml l M M的的HEPESHEPES液中，加蒸馏
33、水至液中，加蒸馏水至10m110m1，过滤消，过滤消毒，毒，44保存；保存； (2)G418(2)G418效应测定：各种哺乳动物细胞效应测定：各种哺乳动物细胞对对G418G418敏感性不同，有一定的差异；变动敏感性不同，有一定的差异；变动在在100g100gm1m11mg1mgmlml范围。为此在使用范围。为此在使用G418G418前应进行测定：前应进行测定： 测定方法测定方法 (3)(3)细胞培养：取待测培养细胞，制备细胞培养：取待测培养细胞，制备成细胞悬液，按等量接种入多孔塑料板每成细胞悬液，按等量接种入多孔塑料板每孔中；孔中； (4)(4)加加G418G418：按梯度浓度向每孔中加入：按
34、梯度浓度向每孔中加入不同量的不同量的G418G418； (5)(5)检测：适用浓度为在检测：适用浓度为在1010一一1414天内，天内，能杀死细胞的最低浓度；能杀死细胞的最低浓度； (6)(6)受体细胞准备：同前；受体细胞准备：同前； (7)(7)转染：与磷酸钙转染法相同，区别转染：与磷酸钙转染法相同，区别是除基因组是除基因组DNADNA外并加入了外并加入了 pSV2pSV2neo neo 1 12g2g；转染后培养；转染后培养2424小时或更长，到细小时或更长，到细胞增长接近汇合时，按胞增长接近汇合时，按1 1：4 4密度传代、继密度传代、继续培养。续培养。 (8)G418(8)G418处理
35、：待细胞密度增至处理：待细胞密度增至50507070汇合时，去掉培养液，更换入浓度为汇合时，去掉培养液，更换入浓度为800g800gm1G418m1G418培养液中进行筛选培养液中进行筛选 ( (伴有伴有末加转染液的细胞作为对照末加转染液的细胞作为对照) )； (9) (9)检测：当作对照的细胞大部分死亡检测：当作对照的细胞大部分死亡时时( (约约3 35 5天后天后) )，再更换一次含，再更换一次含G418G418的筛的筛选液；此时选液；此时G418G418的浓度可降至的浓度可降至200g200gmlml，以维持筛选作用；，以维持筛选作用； (10)(10)筛选：约筛选：约10101515天
36、后，可见有抗天后，可见有抗性的克隆出现，待其逐渐增大后，再转入性的克隆出现，待其逐渐增大后，再转入另瓶中繁殖，并做进一步的鉴定。另瓶中繁殖，并做进一步的鉴定。 其他标记：绿色荧光蛋白其他标记：绿色荧光蛋白 green green fluorescent protein(GFP)fluorescent protein(GFP)三、脂质体介导转染法三、脂质体介导转染法 1. 1.原理：原理： 脂质体脂质体(Lipofectin Regeant(Lipofectin Regeant：LR)LR)试试剂是剂是1 1：1(W1(WW)W)阳离子脂质体阳离子脂质体 DOTMA(3DOTMA(3二油酰氧二油
37、酰氧) )丙基丙基-N-N，N N，N N氯化三甲铵氯化三甲铵) ) 和和 DOPE(DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺二油酰磷脂酰乙醇胺) )的混合物，的混合物，它适用于把它适用于把DNADNA转入悬浮或贴壁培养细胞中，转入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方便的转染方法之一。是目前条件下最方便的转染方法之一。与磷酸钙法或与磷酸钙法或DEAEDEAE葡聚糖等转染法相比，葡聚糖等转染法相比，据所用细胞的不同，据所用细胞的不同，LRLR法能提高转染率法能提高转染率5 5100100倍。特别适用于对某些用磷酸钙法转染倍。特别适用于对某些用磷酸钙法转染率低的细胞；也可用于转染各种寡聚核苷率低的细胞；也可
38、用于转染各种寡聚核苷酸。酸。 用用LRLR进行转染时，首先需优化对每一种细胞进行转染时，首先需优化对每一种细胞的转染条件。即用每一新的的转染条件。即用每一新的LRLR对个别细胞进行转对个别细胞进行转染时，均应找出该批染时，均应找出该批LRLR对转染某一特定细胞适合对转染某一特定细胞适合的的用量、作用时间等用量、作用时间等。DNADNA可从可从1 15g5g和孵育时和孵育时间间6 6小时开始。按这两个固定参数，给出相应小时开始。按这两个固定参数，给出相应LRLR需用量的曲线。再选用需用量的曲线。再选用LRLR和和DNADNA两者最佳的剂量，两者最佳的剂量，确定出转染时间确定出转染时间(2(224
39、24小时小时) )；因；因LRLR对细胞有一对细胞有一定的毒性，转染作用时间以不超过定的毒性，转染作用时间以不超过2424小时为好。小时为好。DNAliposome 四、电击法四、电击法(E1ectroporation)(E1ectroporation) 1. 1.原理：原理： 电击法转染需用特殊仪器。把悬浮状电击法转染需用特殊仪器。把悬浮状态受体细胞和用于转染的态受体细胞和用于转染的DNADNA共同置入特定共同置入特定小杯中，再施以高压电脉冲，能促小杯中，再施以高压电脉冲，能促DNADNA通过通过细胞膜被吸收。被吸收的细胞膜被吸收。被吸收的DNADNA即可被整合入即可被整合入基因组中，使细胞
40、发生转化。如转移的质基因组中，使细胞发生转化。如转移的质粒带有选择标记基因，也可在选择培养基粒带有选择标记基因，也可在选择培养基中进行鉴定。中进行鉴定。 2. 2.方法：方法： 用品用品 ： 受体细胞受体细胞 DNA(DNA(制备略制备略) ) PBS PBS 电穿孔仪电穿孔仪(Bio(BioRad Gene PulserRad Gene Pulser，附，附电击小室电击小室) ) 步骤步骤 ： (1)DNA(1)DNA制备：制备：( (略略) ) (2) (2)细胞：对数生长期细胞，收获细胞：对数生长期细胞，收获5105106 6离心；离心； (3)(3)漂洗：吸除上清液，加漂洗：吸除上清液
41、，加4PBS4PBS冰浴冰浴2020分钟，离心、去上清；分钟，离心、去上清； (4)(4)重悬：于冷重悬：于冷4PBS4PBS中，调成中，调成5105106 6mlPBSmlPBS； (5)(5)加加DNADNA：加入已被酶切割的：加入已被酶切割的DNA 1DNA 110g(10g(总体积总体积5l)5l)，装入电击小室中，装入电击小室中，把小室置于电击器中；把小室置于电击器中； (6) (6)电击准备：联接电源；接通电击室电击准备：联接电源；接通电击室稳压电源，调至稳压电源，调至2000V2000V和极限；将瓦数和电和极限；将瓦数和电流标度盘调到流标度盘调到5 5； (7)(7)电击：接通安
42、全开关，使电源横过电击：接通安全开关，使电源横过电击室放电，在无菌条件下把电击后细胞电击室放电，在无菌条件下把电击后细胞转入培养瓶中，续加转入培养瓶中，续加10ml10ml培养液，置温箱培养液，置温箱中培养；中培养； (8)(8)培养：如含有标记培养：如含有标记neoneo基因，可按基因，可按前述筛选培养法处理。前述筛选培养法处理。 注意：上述电击参数仅供参考。与其注意：上述电击参数仅供参考。与其它方法一样，因细胞、转染它方法一样，因细胞、转染DNADNA等的不同，等的不同，所用电击条件可能需相应改变，因此为获所用电击条件可能需相应改变，因此为获理想效果，应进行预试验，以求得最佳条理想效果，应
43、进行预试验，以求得最佳条件。件。 五、乙二胺己基葡聚糖五、乙二胺己基葡聚糖(DDTM)(DDTM)转染法转染法 DDTM DDTM转染法为适用于转染培养细胞的转染法为适用于转染培养细胞的方法。方法。DNADNADEAEDEAE转染用的葡聚糖混合液易转染用的葡聚糖混合液易于制备，转染效率高。于制备，转染效率高。 先制备出葡聚糖混合液，加入目的基先制备出葡聚糖混合液，加入目的基因、混合、然后转染入培养细胞。由于样因、混合、然后转染入培养细胞。由于样品制备容易，可以大量制备。关于此法中品制备容易，可以大量制备。关于此法中细胞摄取外源细胞摄取外源DNADNA的化学机制尚不清楚。的化学机制尚不清楚。 1
44、. 1.材料：材料： DEAEDEAE葡聚糖干液葡聚糖干液(TBS(TBS中中(1mg(1mgm1m1）滤过消毒，滤过消毒，44贮存贮存 氯奎氯奎(Chloroquine)(Chloroquine)干液干液( (水溶水溶) ) 100.0mM 100.0mM 滤过消毒，分装成每份，滤过消毒，分装成每份，-20-20避光贮存避光贮存 PBS(PBS(有有CaCa+和和MgMg+) ) Tris TrisEDTA(TE)EDTA(TE)，pH 8.0pH 8.0 Tris 0.1M Tris 0.1M EDTA 0.00l M EDTA 0.00l M 10 10“A A”液：液： NaCl 8.
45、0gNaCl 8.0g KCl O.38g KCl O.38g Na Na2 2HPOHPO4 4 0.2g 0.2g Tris 3.0g Tris 3.0g 用用HClHCl调节调节pHpH到，加水到到，加水到100m1100m1，滤过消毒，室温中贮存滤过消毒，室温中贮存100100“B B”液：液： CaClCaCl2 22H2H2 20 1.5g0 1.5g MgCl MgCl2 26H6H2 2O 1.0gO 1.0g 加水到加水到100ml100ml，滤过消毒，室温中贮存，滤过消毒，室温中贮存 TrisTris缓冲盐溶液缓冲盐溶液(TBS)(TBS)：现用现配：现用现配 1010“A
46、 A”液液 10.0ml10.0ml 100 100“B B”液液 1.0ml1.0ml H H2 20 89.0ml0 89.0ml 滤过消毒，滤过消毒，44贮存贮存 2. 2.步骤：步骤： 本法适用于多种类型细胞。用本法适用于多种类型细胞。用6 6孔孔培养板进行。培养板进行。 第一天：第一天： (1)(1)细胞接种：于细胞接种：于7575汇合期收集汇合期收集细胞细胞( (避免用密集生长细胞避免用密集生长细胞) )，制成悬，制成悬液，向每孔中接种液，向每孔中接种2102104 4细胞细胞/cm/cm2 2，悬液总量悬液总量2ml2ml。 第二天：第二天： (2)(2)转染液准备：取溶于转染液
47、准备：取溶于l0l0一一25ul 25ul TETE中；加中；加50ulTBS 50ulTBS 和和50ul DEAE 50ul DEAE 葡聚葡聚糖糖(TBS(TBS溶解溶解) )。DEAEDEAE葡聚糖终浓度须达葡聚糖终浓度须达约；约； (3)(3)细胞生长状态：在进行转化前，细胞生长状态：在进行转化前，镜下观察细胞，生长状态要分散而均镜下观察细胞，生长状态要分散而均匀，密度须达匀，密度须达6060一一7070汇合；汇合； (4)(4)试剂准备：把所有试剂置室温试剂准备：把所有试剂置室温中；中； (5) (5)转化准备：吸除培养液，现用转化准备：吸除培养液，现用3m1PBS3m1PBS洗洗
48、1 1次，接着再用次，接着再用3m1TBS3m1TBS洗洗1 1次；次； (6)(6)转化：吸除转化：吸除TBSTBS，向每孔中加，向每孔中加l00l00一一125ulDNA125ulDNADEAEDEAE葡聚糖葡聚糖TBSTBS混合液，充混合液，充分混合；分混合； (7)(7)置育：把培养板置于无菌工作台面置育：把培养板置于无菌工作台面上，每间隔上，每间隔5 5分钟轻轻摇动一次，共分钟轻轻摇动一次，共1 1小时，小时，保证使保证使DNADNA溶液覆盖细胞和避免细胞干涸；溶液覆盖细胞和避免细胞干涸； (8)(8)漂洗：漂洗：1 1小时后，吸除小时后，吸除DNADNA液，先用液，先用3m1TBS
49、3m1TBS洗洗1 1次，再用次，再用3m1PBS3m1PBS洗洗1 1次；次； (9) (9)吸除吸除PBSPBS，换成含有，换成含有100M100M氯奎的氯奎的完全培养液。在含完全培养液。在含5 5C0C02 23737温箱中培养温箱中培养4 4小时；小时； (10)(10)除掉含有氯奎的培养液，换成不除掉含有氯奎的培养液，换成不含氯奎的完全培养液，继续培养；含氯奎的完全培养液，继续培养； (11)(11)连续培养连续培养l l一一3 3天后，可对细胞进天后，可对细胞进行实验分析；培养持续时间依实验需要而行实验分析；培养持续时间依实验需要而定。受转染细胞的各种因子表达时间不同，定。受转染细
50、胞的各种因子表达时间不同，表面蛋白表达的最好时间可能在转染后第表面蛋白表达的最好时间可能在转染后第三天左右。三天左右。 此法的转染效率可通过氯奎此法的转染效率可通过氯奎(Chloroquine)(Chloroquine)处理转染细胞得到改善。可处理转染细胞得到改善。可能氯奎有中和转染细胞溶酶体能氯奎有中和转染细胞溶酶体pHpH的作用。的作用。当细胞摄入外源当细胞摄入外源DNADNA后，能保护后，能保护DNADNA不被降不被降解，从而能保证解，从而能保证DNADNA进入核中。据报道，此进入核中。据报道，此法转染效率可高达法转染效率可高达8080，但用此法把，但用此法把DNADNA转转入细胞中以后
51、，和磷酸钙法相比较，有较入细胞中以后，和磷酸钙法相比较，有较高的突变性。高的突变性。 六、细胞显微注射转染法六、细胞显微注射转染法 1.1.原理：原理： 前述转染技术是利用生物学媒介或改前述转染技术是利用生物学媒介或改变生物膜性质，使变生物膜性质，使DNADNA进入核内被整合入基进入核内被整合入基因组中的方法。细胞显微注射法是一种借因组中的方法。细胞显微注射法是一种借助显微注射器；直接把助显微注射器；直接把DNADNA注射入核内，使注射入核内，使之能发生整合入受体细胞基因组中的技术。之能发生整合入受体细胞基因组中的技术。 此技术的关键在于实验者要拥有细胞此技术的关键在于实验者要拥有细胞显微注射
52、装置、熟练掌握注射技术和能制显微注射装置、熟练掌握注射技术和能制备出适用于显微注射用的备出适用于显微注射用的DNADNA等几项条件。等几项条件。其中主要为注射仪和训练有素的技术人员。其中主要为注射仪和训练有素的技术人员。熟练的术者，每小时可注射熟练的术者，每小时可注射100100个细胞以上。个细胞以上。 另外尚需克服两个技术难点，一是要制另外尚需克服两个技术难点，一是要制备出好的注射用显微针。最好用高质量的备出好的注射用显微针。最好用高质量的自动拉针仪拉制。如用一般手动拉针器拉自动拉针仪拉制。如用一般手动拉针器拉制时，应满足以下要求：尖的末端需有一制时，应满足以下要求：尖的末端需有一个细部，长
53、度厘米，细部过长，注射时容个细部，长度厘米，细部过长，注射时容易折断。针尖开口要求易折断。针尖开口要求2 23m3m间，针口小间，针口小于于1m1m时，即使加很大的压力，也很难把时，即使加很大的压力，也很难把粘度很大的粘度很大的DNADNA注射出。针的开口大于注射出。针的开口大于5m5m时，易损伤细胞。时，易损伤细胞。2m 其次在注射时，为便于把注射针转移到其次在注射时，为便于把注射针转移到注射野和进行移动，在进行注射操作时需注射野和进行移动，在进行注射操作时需揭开培养皿盖，让细胞露在空气中，时间揭开培养皿盖，让细胞露在空气中，时间需需1 12 2小时以上，增加了污染机会，因此小时以上，增加了
54、污染机会，因此要有严密的无菌措施。要有严密的无菌措施。 2. 2.方法：方法： (1)(1)注射用注射用DNADNA制备：制备：( (略略) ) (2) (2)显微注射针：取显微注射针数个，显微注射针：取显微注射针数个，镜下挑选最佳者，高压灭菌后、无菌吸入镜下挑选最佳者，高压灭菌后、无菌吸入一定量一定量DNADNA，把注射针安装在显微镜持针器，把注射针安装在显微镜持针器上、调动控制器旋扭，选择注入上、调动控制器旋扭，选择注入 DNADNA压力压力参数；参数； (3) (3)细胞：取一皿生长状态良好的细胞，细胞：取一皿生长状态良好的细胞，置于显微镜台上置于显微镜台上( (能自控调温能自控调温)
55、)，去除培养，去除培养皿盖，调动持针器把显微针移入培养皿内；皿盖，调动持针器把显微针移入培养皿内； （4 4）注射准备：调动持针器旋扭，把）注射准备：调动持针器旋扭，把针尖调至接近细胞针尖调至接近细胞( (相差镜下观测相差镜下观测) )，使针，使针的长轴与培养皿平面保持的长轴与培养皿平面保持3030左右；超过左右；超过45 45 注射时，针尖易折断，小于注射时，针尖易折断，小于3030时，时，针的柄部会受培养皿边缘阻挡，能限制注针的柄部会受培养皿边缘阻挡，能限制注射针的活动范围，射针的活动范围，3002m (5) (5)注射：选健康完整细胞，一定量的注射：选健康完整细胞，一定量的DNADNA即
56、被注射入细胞内，可见细胞微微膨胀，即被注射入细胞内，可见细胞微微膨胀，说明说明DNADNA已被注入，如此反复注射至所需数已被注入，如此反复注射至所需数量细胞；量细胞； (6)(6)培养：其余培养、观测、筛选等方培养：其余培养、观测、筛选等方法与其它转染法相同。法与其它转染法相同。 在大量细胞群中，受注射的细胞仅为在大量细胞群中，受注射的细胞仅为少数。期间受注射细胞可能易被末受注射少数。期间受注射细胞可能易被末受注射细胞增殖生长所压制。对此，除可采用细胞增殖生长所压制。对此，除可采用neoneo基因共转染和基因共转染和G418G418筛选法外，也可用标记筛选法外，也可用标记刮除法刮除其它细胞。刮
57、除法刮除其它细胞。 细胞显微注射除适用于注射细胞显微注射除适用于注射DNADNA片段、片段、寡核苷酸，也可用于注射蛋白、抗体以及寡核苷酸，也可用于注射蛋白、抗体以及各种对细胞有影响的药物等。各种对细胞有影响的药物等。第三节第三节 转移基因及其表达的检测转移基因及其表达的检测外外源源基基因因转转移移至至哺哺乳乳动动物物受受体体细细胞胞有有3 3种种存存在在状状态态，其其一一，被被降降解解；其其二二，游游离离于于宿宿主主细细胞胞；其其三三，整整合合在在宿宿主主染染色色体体上上。游游离离于于宿宿主主细细胞胞中中的的外外源源基基因因，只只要要序序列列完完整整、功功能能完完全全，一一般般都都能能在在寄寄
58、主主细细胞胞表表达达产产生生蛋蛋白白质质。但但是是这这种种表表达达只只是是暂暂时时的的，不不能能遗遗传传。只只有有极极少少数数整整合合到到宿宿主主染染色色体体上的基因才能传代。上的基因才能传代。 然而迄今为止，有关外源基因在宿主然而迄今为止，有关外源基因在宿主染色体上的整合，经过检测分析才能知道，染色体上的整合，经过检测分析才能知道，这种整合是随机的，整合的拷贝数与宿主这种整合是随机的，整合的拷贝数与宿主细胞类型有关，也与所用载体及转移细胞类型有关，也与所用载体及转移DNADNA量量有关。在整合过程中，部分外源有关。在整合过程中，部分外源DNADNA能保持能保持完整结构，而部分完整结构，而部分
59、DNADNA则发生重排，宿主则发生重排，宿主DNADNA也发生重排并部分丢失。也发生重排并部分丢失。 因此，由外源基因转化的细胞，其转因此，由外源基因转化的细胞，其转基因结果很难预测。基因结果很难预测。 目目前前已已有有多多种种方方法法可可对对转转移移基基因因及及其其表表 达达 进进 行行 检检 测测 分分 析析 。 常常 用用 的的 方方 法法 有有SouthernSouthern印印迹迹法法、NorthernNorthern印印迹迹法法、PCRPCR检检测测法法、生生物物芯芯片片技技术术以以及及通通过过蛋蛋白白质质分分析析以检测外源基因等方法。以检测外源基因等方法。（一）（一）Southe
60、rnSouthern印迹法印迹法 将从转化细胞中所提取并经纯化的将从转化细胞中所提取并经纯化的DNADNA用限制性内切核酶消化并经变性处理和琼用限制性内切核酶消化并经变性处理和琼脂糖凝胶电泳后，按凝胶中的原顺序用滤脂糖凝胶电泳后，按凝胶中的原顺序用滤纸转移至硝酸纤维素膜上，然后与标记探纸转移至硝酸纤维素膜上，然后与标记探针杂交，以此来检测整合的外源针杂交，以此来检测整合的外源DNADNA的位置的位置和顺序。和顺序。（二）（二）NorthernNorthern印迹法印迹法 对外源基因的对外源基因的mRNAmRNA的一种分析检测方的一种分析检测方法。对所提取并经分离提纯和变性处理的法。对所提取并经
61、分离提纯和变性处理的mRNAmRNA凝胶电泳后，用滤纸吸印转移到硝酸凝胶电泳后，用滤纸吸印转移到硝酸纤维素膜上。经固定后，用外源纤维素膜上。经固定后，用外源DNADNA杂交，杂交，以此来检测外源基因的转录物。以此来检测外源基因的转录物。（三）（三）PCRPCR技术技术PCRPCR技术即聚合酶链式反应技术即聚合酶链式反应(polymerase (polymerase chain reactionchain reaction，PCR)PCR)是对外源基因及其是对外源基因及其mRNAmRNA的另一种检测方法。该技术是以经纯的另一种检测方法。该技术是以经纯化具有化具有 poly A poly A的的m
62、RNAmRNA为模板，以寡聚为模板，以寡聚dTdT为为引物，以引物，以dNTPdNTP为底物，在为底物，在反转录酶的作用反转录酶的作用下合成下合成cDNAcDNA。最最后后提提取取PCRPCR扩扩增增的的cDNAcDNA进进行行电电泳泳，然然后后用用印迹法杂交分析印迹法杂交分析。（四）生物芯片技术（四）生物芯片技术 生物芯片生物芯片(Biochips)(Biochips)能同时检测成百能同时检测成百上千种生物大分子。首先，按一定次序在上千种生物大分子。首先，按一定次序在一个玻璃片上依次涂上能与目标生物大分一个玻璃片上依次涂上能与目标生物大分子进行结合的分子子进行结合的分子, , 然后使样品与该
63、芯片然后使样品与该芯片进行反应进行反应, , 二者的结合通过荧光探针来进二者的结合通过荧光探针来进行检测。该法的优点是经济、快速行检测。该法的优点是经济、快速, ,不足之不足之处是灵敏度不够高。处是灵敏度不够高。此此外外，还还可可通通过过WesternWestern印印迹迹法法、免免疫疫沉沉淀淀法法、免免疫疫荧荧光光等等方方法法分分析析检检测测转转移移基基因因编编码码的的蛋蛋白白质质，以以此此达达到到分分析析检检测测转转基基因因的的目的。目的。习题习题1.1.细胞内基因导入常用方法有哪些？细胞内基因导入常用方法有哪些？ 2.2.何谓标记基因共转染？共转染有何用途何谓标记基因共转染？共转染有何用途？原理？原理？
