第二章第二章 培养基及其制备培养基及其制备v培养基培养基(Culture medium)：选用各种营养物质，经：选用各种营养物质，经配制成适合不同微生物生长繁殖或积累代谢产物的营配制成适合不同微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质v培养基的组成必需细胞的生长和代谢产物所需的元素，并能提供提供生物合成和细胞维持活力所需要的能量v培养基的组成和配比合适与否，对微生物的生长发育、培养基的组成和配比合适与否，对微生物的生长发育、产品的产量、提炼工艺的选择和成品质量都会产生相产品的产量、提炼工艺的选择和成品质量都会产生相当大的影响当大的影响 一、培养基的营养成分及用途一、培养基的营养成分及用途 光光 光能自养光能自养 氢、硫、氨氢、硫、氨 自养菌自养菌Ⅰ.Ⅰ.能源能源 亚硝酸盐、亚铁盐亚硝酸盐、亚铁盐 化能自养化能自养 碳水化合物等有机物碳水化合物等有机物 石油天然气和石油化工产品石油天然气和石油化工产品 功能：生长、繁殖需要；功能：生长、繁殖需要； 异养菌异养菌第一节、培养基的成分第一节、培养基的成分 碳酸气碳酸气 淀粉水解糖、糖蜜、亚硫酸盐纸浆废液等淀粉水解糖、糖蜜、亚硫酸盐纸浆废液等 石油、正构石蜡、天然气石油、正构石蜡、天然气 醋酸、甲醇、乙醇等石油化工产品醋酸、甲醇、乙醇等石油化工产品 功能：主要能量载体、构成菌体、代谢产物的物质基础；功能：主要能量载体、构成菌体、代谢产物的物质基础； 豆饼或蚕蛹水解液、味精废液豆饼或蚕蛹水解液、味精废液Ⅲ.Ⅲ.氮源氮源 玉米浆、酒糟水等有机氮玉米浆、酒糟水等有机氮 尿素、硫酸铵、氨水、硝酸盐等无机氮、氮气尿素、硫酸铵、氨水、硝酸盐等无机氮、氮气 功能：构成菌体、含氮代谢物；功能：构成菌体、含氮代谢物；ⅡⅡⅡⅡ.碳源碳源碳源碳源 磷酸盐、钾盐、钙盐等矿物盐磷酸盐、钾盐、钙盐等矿物盐Ⅳ.Ⅳ.无机盐无机盐 铁、锰、钴等微量元素铁、锰、钴等微量元素 功能：构成菌体，参与酶的组成，维持酶活性，调节渗透压，调功能：构成菌体，参与酶的组成，维持酶活性，调节渗透压，调节节pHpH值，维持氧化还原电位；值，维持氧化还原电位；Ⅴ.Ⅴ.特殊生长因子：硫胺素、生物素、对氨基苯甲酸、肌醇等特殊生长因子：硫胺素、生物素、对氨基苯甲酸、肌醇等 功能：酶的辅助部分，维持生命活动；功能：酶的辅助部分，维持生命活动；Ⅵ.Ⅵ.水分水分 功能：生化反应的介质，功能：生化反应的介质，溶解营养物质和代谢产物溶解营养物质和代谢产物 二、培养基的类型二、培养基的类型 1.1.依营养物质的来源分类依营养物质的来源分类 ① ①天然培养基；天然培养基；（麦芽汁、玉米粉、麸皮、锯末等）（麦芽汁、玉米粉、麸皮、锯末等） ② ②合成培养基；合成培养基； （高氏培养基、察氏培养基等（高氏培养基、察氏培养基等 ）） ③ ③半合成培养基；半合成培养基； （牛肉膏蛋白胨、土豆葡萄糖（牛肉膏蛋白胨、土豆葡萄糖培养基）培养基） 2.2.依培养基物理状态：依培养基物理状态： ① ①液体培养基：液体培养基：用于大规模工业生产；实验室摇瓶试用于大规模工业生产；实验室摇瓶试 验；微生物生理代谢研究。
验；微生物生理代谢研究 ② ②固体培养基：固体培养基：用于菌种培养、分离、保存，育种用于菌种培养、分离、保存，育种 3.3.依培养基主要成分和使用目的来分依培养基主要成分和使用目的来分 ①①基础培养基基础培养基 ②②完全培养基完全培养基 ③③鉴别培养基：鉴别培养基：培养基中加有能与某一菌的无色代谢产物发生显色反应的指示剂，从而达到只须用肉眼辨别颜色就能方便的从近似菌落中找出目的菌菌落的培养基 最常见的鉴别性培养基是伊红美蓝乳糖培养基，即EMB 培养基 ④④选择培养基：选择培养基：就是根据某种微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基其功能是从混合菌样本中的选取优势菌，从而提高该菌的筛选效率可分为加富性选择培养基；抑制性选择培养基 EMB(Eosin Methylene Blue)培养基中培养大肠杆菌，因其强烈分解乳糖而产生大量的混合酸，菌体带H+,故可染上酸性染料伊红，又因伊红与美蓝结合，使菌落呈深紫色从菌落表面反光还可看到绿色金属闪光而产酸弱的菌株的菌落呈棕色不发酵乳糖的菌落无色透明鉴别肠道细菌的伊红美蓝乳糖培养基鉴别肠道细菌的伊红美蓝乳糖培养基 4.4.根据生产工艺来分根据生产工艺来分 ①①孢子培养基：孢子培养基：固体；营养不太丰富（尤其是氮源）；适当的无机盐浓度；适当的PH和温度；分天然和半合成两种类型。
② ②种子培养基：种子培养基：液体；常用速效C、N源；P较高；PH稳定；尽量接近发酵培养基 ③ ③发酵培养基：发酵培养基：液体；营养丰富，完全；C、N源迟速搭配； 应注意C:N、PH、生长因子、前体等 三、发酵培养基的选择v一）、配置培养基的原则v1、根据不同微生物的营养需要配置不同的培养基v2、注意各营养物质的浓度和配比v3、调节适宜的物理化学条件v4、根据培养微生物的目的配置v5、尽量使用廉价易得的原料 v1、生态模拟v2、查阅文献v3、借助优选法或正交试验法精心设计培养基配方v4、实验比较v实验的规模一般由定性到定量，由小到大v发酵培养基的用途与要求、成分、配比经实验确定，配制时兼顾原料来源、成本及工艺管理；二）、配置培养基的方法 培养基配方举例v牛肉膏蛋白胨培养基(常用的细菌培养基)v 牛肉膏5克、 蛋白胨10克 、NaCl5克 、水1000毫升、 pH7.2～7.4 (琼脂15～20克)v高氏一号培养基(常用的放线菌培养基)v 可溶性淀粉20克、 KNO31克 K2HPO4 0.5克、 MgSO4 0.5克 、NaCl 0.5克、 FeSO4 0.01克、水1000毫升、pH7.4～7.6、琼脂15～20克 v察氏培养基(培养霉菌用)v 蔗糖 20克、 NaNO3 3克、 K2HPO4 1克 、KCl 1克、 MgSO4 0.5克、 FeSO4 0.01克、 琼脂20克、 水1000毫升、自然pHv无氮培养基(培养自生固氮菌用)v 葡萄糖 10克 、NaCl 0.2克、 KH2PO4 0.2克 、CaSO4·2H2O 0.1克、 MgSO4 0.2克、 CaCO3 5克、 琼脂 20克、水1000毫升、自然pHv伊红-美蓝培养基(检查肠道细菌用)v 蛋白胨 10克、 K2HPO4 2克、乳糖10克、琼脂25克，水1000毫升，pH7.6v 2％伊红水溶液2毫升、0.5％美蓝水溶液2毫升、将乳糖、伊红、美蓝分别灭菌后，加入灭菌的培养基中摇匀，倒平板。
四、原料转换及意义四、原料转换及意义；v1、节约原料，减低单耗，提高发酵单位和总收率v2、开拓新的原料资源和微生物资源：野生植物淀粉、植物纤维、木屑水解物、石蜡、醋酸、乙醇 随着原料的转换，不仅要选育与原随着原料的转换，不仅要选育与原料转换相适应的菌种，同时发酵的控制方料转换相适应的菌种，同时发酵的控制方法也不相同法也不相同 v糖化糖化(Saccharify)：在工业生产上将淀粉水解：在工业生产上将淀粉水解为葡萄糖的过程，得到的水解糖液叫淀粉糖为葡萄糖的过程，得到的水解糖液叫淀粉糖v糖化的原料：薯类淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉、糖化的原料：薯类淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉等大米淀粉等v水解糖液的质量直接关系到生产菌的生长速度水解糖液的质量直接关系到生产菌的生长速度与代谢产物的积累，其中的低聚糖类与复合糖与代谢产物的积累，其中的低聚糖类与复合糖类等杂质越低越好类等杂质越低越好第二节 淀粉水解糖的制备 v一、淀粉的水解的理论基础 v1,淀粉的颗粒的外观v淀粉颗粒呈白色，不溶于冷水和有机溶剂，其内部呈复杂的结晶组织随原料品种和种类的不同，淀粉颗粒具有不同的形状和大小。
形状不规则，大致上可分为圆形、椭圆形和多角形v淀粉颗粒的构成如下： 氢键 聚集 淀粉分子链 ───→ 针状晶体 ───→ 淀粉颗粒 2，淀粉的分子结构v淀粉可分为直链和支链淀粉两类 v直链淀粉通过α-1，4键连接 v支链淀粉的直链部分通过α-1，4键连接，分支点则有α-1，6键连接，支链平均有25个葡萄糖基团 二、淀粉水解糖的制备方法二、淀粉水解糖的制备方法 1.1.酸解法酸解法 2.2.酶解法酶解法 3.3.酸酶结合法酸酶结合法 ①①酸酶法酸酶法 ② ②酶酸法酶酸法 v酸解法酸解法反应原理：淀粉反应原理：淀粉——————>葡萄糖葡萄糖v优点：设备要求简单，水解时间短（20min），设备生产能力大v缺点：高温高压下进行，设备要求耐腐蚀、耐高温、耐高压；副反应多，淀粉转化率低；对原料要求严格，淀粉颗粒颗粒大小均匀、不宜过大，淀粉乳浓度不能过高酸（催化剂）酸（催化剂） 高温高压高温高压 酶解法（双酶水解法）酶解法（双酶水解法）反应原理：反应原理：淀粉淀粉 ——— > 糊精、低聚糖糊精、低聚糖 ——— > 葡萄糖葡萄糖 优点：反应条件温和对设备要求低，优点：反应条件温和对设备要求低， 酶的专一性强，副反应少，产品纯度高，营养丰富酶的专一性强，副反应少，产品纯度高，营养丰富 对原料要求较低，淀粉乳浓度高（达对原料要求较低，淀粉乳浓度高（达40%）） 糖液色泽浅，无苦味，有利于糖液的精制糖液色泽浅，无苦味，有利于糖液的精制缺点：所需设备较多；反应时间较长（缺点：所需设备较多；反应时间较长（2-3天），糖液过滤天），糖液过滤 困难。
困难 淀粉酶淀粉酶糖化糖化酶酶液化液化糖化糖化 酶酸结合法之一，酸酶法酶酸结合法之一，酸酶法反应原理：反应原理：淀粉淀粉———>糊精、低聚糖糊精、低聚糖 ———>葡萄糖葡萄糖 （（DE值）值）10-15优点：优点： 产品质量高，反应时间较短（产品质量高，反应时间较短（<2d）） 对原料要求较低，淀粉乳浓度较高对原料要求较低，淀粉乳浓度较高 用酸量少用酸量少酸水解酸水解糖化糖化酶酶 酶酸结合法之二，酶酸法酶酸结合法之二，酶酸法反应原理：反应原理：淀粉淀粉 ———> 糊精、低聚糖糊精、低聚糖 ———> 葡萄糖葡萄糖优点：优点：反应时间短（反应时间短（<2hrs），产品质量较好），产品质量较好对原料要求较低，淀粉乳浓度较高对原料要求较低，淀粉乳浓度较高对淀粉颗粒大小无严格要求对淀粉颗粒大小无严格要求 淀粉酶淀粉酶酸水解酸水解30min30min 淀粉水解糖的制备淀粉水解糖的制备v几种水解方法的比较几种水解方法的比较从时间上看：从时间上看：酸解法最快，酶解法最慢酸解法最快，酶解法最慢从原料转化率和糖液质量上看：从原料转化率和糖液质量上看：酶解法酶解法>酸酶法酸酶法>酶酸法酶酸法>酸解法酸解法 不同的制糖工艺生产的糖液质量差别不同的制糖工艺生产的糖液质量差别 三、淀粉酸水解理论基础三、淀粉酸水解理论基础 淀淀粉粉水水解解成成葡葡萄萄糖糖的的反反应应过过程程中中同同时时发发生生：：水水解解反反应应、、复复合合反反应应、、分分解解反反应应；；其其中中水水解解反反应应是是主主要要的。
的 ㈠淀粉的水解反应l颜色变化：蓝色 暗紫 紫 红褐 暗红 红 浅红 （（C6H10O5)n+nH2O n C6H12O6酸酸影响水解反应速度常数k的几个因素 k=α·N·δ·λ 1） α为催化剂活性系数催化剂HClH2SO4H3PO4HACHBrHIα值10.5-0.520.30.0251.72.52） N为酸的摩尔浓度3） δ为多糖的水解性常数多糖的种类棉花淀粉木材稻草半纤维素蔗糖δ值140020-2510-400100000反应动力学反应动力学4） λ为水解温度温度℃119133138143k值0.1250.4700.7701.200 两个葡萄糖分子通过复合反应聚合成二糖时，不再经过α-1，4糖苷键聚合成为麦芽糖，而主要是经由α-1，6糖苷键聚合成异麦芽糖或经由β-1，6糖苷键聚合成龙胆二糖进一步聚合，生成二糖、三糖及其他低聚糖1000100淀粉乳浓度（干淀粉%）糖液的纯度（ % ）4001.0复合糖量（ % ）HClHAcH2SO4酸浓度（mol/l)（二）、葡萄糖的复合反应及其影响因素 v影响复合反应的因素：v1、淀粉浓度的影响（用DE值表示葡萄糖纯度）：vDE值＝还原糖/干物质×100％v2.、酸的影响：种类及浓度Bx(玻利克斯)：表示溶液的比重的方法 定义：某一溶液（如淀粉乳）的Bx，表示该溶液的比重和相同浓度的蔗糖溶液的比重相等。
（三）葡萄糖的分解反应及其影响因素v葡萄糖 5’-羟甲基糠醛 乙酰丙酸、蚁酸、有色素物质；1） 5`-羟甲基糠醛是产生色素的根源2）色素的生成量随葡萄糖浓度的增加而增加3）PH值等于3时，色素的生成量最小 v葡萄糖的理论收率：v实际收率 淀粉制糖过程考察指标 v淀粉转化率：v葡萄糖值—DE值液化液或糖化液中的还原糖含量(所测得的糖以葡萄糖计)占干物质的百分率vDX值：糖化液中葡萄糖含量占干物质的百分率 水解糖液的质量要求和控制要点v色泽：呈强黄色透明液v还原糖含量，18％(酸法);25-38%(酶法)vDE值：﹥90％ (酸法); ﹥ 95 %(酶法)v透光率： ﹥ 40% (酸法); ﹥ 60 %(酶法) （420nm）vpH值：4.6~4.8v淀粉转化率：92%以上（实际产量/理论产量） 第三节第三节 糖蜜前处理糖蜜前处理一、糖蜜的来源与特点一、糖蜜的来源与特点 糖蜜是制糖生产时的结晶母液，它是制糖工业的副产物糖蜜主要含有蔗糖，总糖可达50%左右一般糖蜜分甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜和葡萄糖蜜 糖蜜除含糖份外，还含有较多的杂质，其中有些是有用的，但是许多都会对发酵产生不利的影响，需要进行预处理。
预处理是通过稀释，酸化，灭菌，澄清，使之更适于发酵 v1、加酸通风沉淀法加酸通风沉淀法（冷酸通风处理法）：糖蜜加水稀释到500Bx 加入0.2～0.3％浓硫酸，通入压缩空气1h 静置澄清8h，取上清液糖蜜前处理的一般方法糖蜜前处理的一般方法 v2、加热加酸沉淀法、加热加酸沉淀法（热酸通风沉淀法）：v 糖蜜加水稀释到40％ 加适量硫酸调节pH值到4～4.5 放入澄清槽加热至80～90℃，通风30min 70～80℃保温 8～12 小时，取上清液v效果比方法1好，但是费时费设备 v3、添加絮凝剂澄清处理法：、添加絮凝剂澄清处理法：v糖蜜稀释至30～40 Bx 加硫酸调pH 3～3.8 加热至90℃ 添加8ppm聚丙烯酰胺（PAM），搅拌均匀 静置1小时，取上清液v澄清效果较好 谷氨酸发酵的糖蜜前处理谷氨酸发酵的糖蜜前处理待处理物质：胶体成分（起泡、结晶） 钙盐（结晶） 生物素（发酵控制）处理目的：澄清→脱钙→脱除生物素 糖蜜预处理消除生物素方法糖蜜预处理消除生物素方法①①活性炭处理法活性炭处理法 稀释，漂白粉，活性炭，过滤稀释，漂白粉，活性炭，过滤 原理：吸附原理：吸附②②树脂处理法树脂处理法 ③③亚硝酸处理法亚硝酸处理法原理：破坏生物素原理：破坏生物素 还可以采用以下三种方法消除生物素影响：还可以采用以下三种方法消除生物素影响：1.1.添加化学药剂处理法添加化学药剂处理法 原理：增加细胞膜对谷氨酸的渗透性原理：增加细胞膜对谷氨酸的渗透性 ① ①添加青霉素法添加青霉素法 ② ②添加表面活性剂添加表面活性剂 ③ ③添加抗氧剂法添加抗氧剂法2.2.追加糖蜜法追加糖蜜法 原理：当谷氨酸酶系统成熟时过量生物素不影响发酵，可原理：当谷氨酸酶系统成熟时过量生物素不影响发酵，可在此时添加未处理的糖蜜进去继续正常生产。
在此时添加未处理的糖蜜进去继续正常生产3.3.采用营养缺陷变异株采用营养缺陷变异株 原理：诱变生物素缺陷型菌株为油酸缺陷型等，使生物素原理：诱变生物素缺陷型菌株为油酸缺陷型等，使生物素不再影响谷氨酸的积累不再影响谷氨酸的积累 第四节第四节 纤维素代粮发酵原料纤维素代粮发酵原料v纤维素是当今世界上最丰富、最廉价的可再生生物质资源据估计，通过光合作用每年合成的纤维素达到1011～1012亿吨v主要来源于森林木质纤维素类材料，木材是最主要的来源其它含有纤维素的物质包括农业残余物、水生植物、草和其它一些植物类物质 纤维素的结构 分子间的氢键结合纤维素Ⅰ型的晶胞单元 纤维素结构对降解利用的影响v氢键键能虽小，其总和非常大，对纤维素和木材的性质影响很大，尤其对木材的吸湿性、溶解度影响很大v纤维素通过氢键缔合形成密度大的结晶区和密度小的无定型区，又被木质素和半纤维素包围着，形成完整结构，高度不溶于水 纤维素预处理预处理的目的：预处理的目的： 1，破坏纤维素的晶体结构 2，解除木质素的阻碍。
v方法：方法：vက物理法: 常用的方法有超微粉碎、蒸汽爆破、高能辐射、微波和超声波处理等vက化学方法:常采用氢氧化钠、液氨及其它化学试剂处理vက物理－化学法:常用的有氨冷冻爆破法 (1)(1)酸水解酸水解: :在酸的作用下发生水解，最在酸的作用下发生水解，最初得到水解纤维素，最后得到葡萄糖初得到水解纤维素，最后得到葡萄糖. . (2) (2)酶水解酶水解: :纤维素酶促降解是国外的研纤维素酶促降解是国外的研究热点 通过纤维素酶的作用，使纤维素大分子链上的1,4－ β糖苷键断裂，导致聚合度下降的现象纤维素酶是一种多组分酶，它包括C1酶、 β－1,4聚葡萄糖酶和β－葡萄糖苷酶纤维素的降解纤维素的降解 植物秸秆，木材，蔗渣等纤维素类物质半纤维素纤维素木质素葡萄糖乙醇木酮糖预处理纤维素类物质发酵生产乙醇基本路线纤维素酶水解发酵发酵基因工程木质素的回收利用 一一、、前前体体物物质质：：前体指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接在生物合成过程中合成到产物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高第五节第五节 前体物质、促进剂前体物质、促进剂用法用法：前体使用时普遍采用流加的方法：前体使用时普遍采用流加的方法 A：：前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利 苯乙酸，一般基础料中仅仅添加苯乙酸，一般基础料中仅仅添加0.07% B；；前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化，流加有利于提高前体的转化率化，流加有利于提高前体的转化率 氨基酸发酵的前体物质氨基酸发酵的前体物质氨基酸氨基酸菌种菌种前体物质前体物质产率（产率（% %））丝氨酸丝氨酸色氨酸色氨酸色氨酸色氨酸蛋氨酸蛋氨酸异亮氨酸异亮氨酸异亮氨酸异亮氨酸苏氨酸苏氨酸嗜甘油棒状杆菌嗜甘油棒状杆菌异常汉孙酵母异常汉孙酵母麦角菌麦角菌脱氮极毛杆菌脱氮极毛杆菌粘质赛氏杆菌粘质赛氏杆菌阿氏棒状杆菌阿氏棒状杆菌谷氨酸小球菌谷氨酸小球菌甘氨酸甘氨酸氨茴酸氨茴酸吲哚吲哚硫代丁酸硫代丁酸αα- -氨基丁酸氨基丁酸D-D-苏氨酸苏氨酸高丝氨酸高丝氨酸1.61.60.80.81.31.31.11.10.80.81.51.52.02.0 抗生素发酵常用的前体物质抗生素发酵常用的前体物质抗生素抗生素前体物质前体物质抗生素抗生素前体物质前体物质青霉素青霉素G苯乙酸或在发酵中能形成苯苯乙酸或在发酵中能形成苯乙酸的物质，如乙基酰胺等乙酸的物质，如乙基酰胺等金霉素金霉素氯化物氯化物青霉素青霉素O烯丙基－硫基乙酸烯丙基－硫基乙酸溴四环素溴四环素溴化物溴化物青霉素青霉素V苯氧乙酸苯氧乙酸红霉素红霉素丙酸、丙醇、丙酸盐、丙酸、丙醇、丙酸盐、乙酸盐乙酸盐放线菌素放线菌素C3肌氨酸肌氨酸灰黄霉素灰黄霉素氯化物氯化物链霉素链霉素肌醇、精氨酸、甲硫氨酸肌醇、精氨酸、甲硫氨酸 所谓所谓产物促进剂产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。
又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂 二、产物促进剂与抑制剂二、产物促进剂与抑制剂 促进剂提高产量的机制还不完全清楚，其原因是多方面的Ø 有些促进剂本身是酶的诱导物；Ø 有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善 细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产，Ø 也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用；Ø 有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子 在发酵过程中添加促进剂的用量极微，选择得好，效果在发酵过程中添加促进剂的用量极微，选择得好，效果较显著，但一般来说，促进剂的专一性强，往往较显著，但一般来说，促进剂的专一性强，往往不能相互套不能相互套用用 抑制剂抑制剂v在发酵过程中加入某些抑制剂会抑制某些代谢途径的进行，同时会使另一个代谢途径活跃，从而获得人们所需的某种产物或使正常代谢的某一中间物积累起来抑制剂对代谢的抑制作用是发生在代谢链分枝代谢途径上（1）四环素发酵过程中，添加NaBr,可以抑制金霉素的生物合成，从而提高四环素的产率（2）头孢霉素C，添加L—Met，可以抑制头孢霉素N的生物合成，从而提高头孢霉素C的产率 抗生素抗生素被抑制的产物被抑制的产物抑制剂抑制剂链霉素链霉素去甲基链霉素去甲基链霉素四环素四环素去甲基金霉素去甲基金霉素头孢菌素头孢菌素C C利福霉素利福霉素甘露糖链霉素甘露糖链霉素链霉素链霉素金霉素金霉素金霉素金霉素头孢霉素头孢霉素N N其他利福霉素其他利福霉素甘露聚糖甘露聚糖乙硫氨酸乙硫氨酸溴化物、硫脲溴化物、硫脲硫胺化合物硫胺化合物L-L-蛋氨酸蛋氨酸巴比妥药物巴比妥药物 第六节 培养基的灭菌一、消毒与灭菌在发酵工业中的应用一、消毒与灭菌在发酵工业中的应用 发酵生产是一个纯种培养过程，尤其是接种以后。
若不杀菌会造成（染菌的危害）：⑴⑴杂菌污染，消耗底物或产物，造成杂菌污染，消耗底物或产物，造成生产能力下降生产能力下降⑵⑵杂菌的代谢产物在染菌后改变了发酵培养基的某些理化性能，杂菌的代谢产物在染菌后改变了发酵培养基的某些理化性能，使产物的使产物的分离提取分离提取困难，得率下降或产品质量下降；困难，得率下降或产品质量下降；⑶⑶此外杂菌的大量繁殖造成发酵液的此外杂菌的大量繁殖造成发酵液的pH变化，造成变化，造成发酵异常发酵异常；；⑷⑷也可能会也可能会分解正常的代谢产物分解正常的代谢产物，从而使发酵失败；，从而使发酵失败；⑸⑸若发生噬菌体污染，会使微生物细胞裂解，使若发生噬菌体污染，会使微生物细胞裂解，使正常发酵生产正常发酵生产不能进行不能进行 v消毒：消毒：指用物理或化学方法杀死物料、容器、器具内外的病原微生物一般只能杀死营养细胞不能杀死细菌芽孢v灭菌：灭菌：指利用物理或化学方法杀灭或除去物料及设备中的所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子v消毒不一定能达到灭菌的要求，而灭菌则可达到消消毒不一定能达到灭菌的要求，而灭菌则可达到消毒的目的毒的目的v在发酵工业生产中，为了保证纯种培养，在生产菌在发酵工业生产中，为了保证纯种培养，在生产菌种接种培养前，要对种接种培养前，要对培养基、空气系统、消泡剂、培养基、空气系统、消泡剂、流加物料、设备、管道等流加物料、设备、管道等进行灭菌，还要对进行灭菌，还要对生产环生产环境进行消毒境进行消毒，防止杂菌和噬菌体的大量繁殖。
防止杂菌和噬菌体的大量繁殖 v二二 常见的灭菌方法常见的灭菌方法 1 化学物质灭菌化学物质灭菌（（1）表面消毒剂）表面消毒剂原理：药物与微生物细胞中的成分反应，使蛋白质变性酶失活使用范围：器皿、双手和实验室、无菌室的环境灭菌， 不能用于培养基灭菌 药剂药剂杀菌原理杀菌原理使用浓度使用浓度高锰酸钾高锰酸钾使蛋白质、氨基酸氧化从而使微生物死亡使蛋白质、氨基酸氧化从而使微生物死亡0.1～～3％％漂白粉漂白粉次氯酸钠在水溶液中分解为新生态氧和氯，使细次氯酸钠在水溶液中分解为新生态氧和氯，使细菌受强烈氧化作用而导致死亡菌受强烈氧化作用而导致死亡1～～ 5%酒精溶液酒精溶液使细胞脱水，引起蛋白质凝固变性对营养细胞、使细胞脱水，引起蛋白质凝固变性对营养细胞、病毒、霉菌孢子均有杀死作用病毒、霉菌孢子均有杀死作用75％％新洁而灭新洁而灭表面活性剂类洁净消毒剂，在水溶液中以阳离子表面活性剂类洁净消毒剂，在水溶液中以阳离子形式与菌体表面结合，引起菌体外膜损伤和蛋白形式与菌体表面结合，引起菌体外膜损伤和蛋白质变性一般用于器具和生产环境的消毒，不能质变性一般用于器具和生产环境的消毒，不能与合成洗涤剂合用与合成洗涤剂合用。
0.25％％甲醛甲醛强还原剂，与氨基结合使蛋白质或酶变性强还原剂，与氨基结合使蛋白质或酶变性2份份37％甲醛溶液％甲醛溶液＋＋1份份KMnO4；；37％甲醛溶液加％甲醛溶液加热热过氧乙酸过氧乙酸强氧化剂，广谱、高效、速效，对营养细胞、细强氧化剂，广谱、高效、速效，对营养细胞、细菌芽胞、真菌孢子和病毒都有杀灭作用菌芽胞、真菌孢子和病毒都有杀灭作用戊二酸戊二酸在碱性条件下具有杀死芽胞的能力在碱性条件下具有杀死芽胞的能力2％％酚类酚类如石炭酸（来苏尔）如石炭酸（来苏尔）1～～5％％ （（2 2）抗代谢类药物（生长因子类似物））抗代谢类药物（生长因子类似物）：： 有些化合物在结构上与生物体所必需的代谢物很相似，以致于可以和特定的酶结合，从而阻碍酶的功能，干扰代谢的正常进行，这些物质叫抗代谢物，用于疾病治疗，称抗代谢类药物 机理：作为菌细胞基本生长因子的竞争性抑制剂（与相应酶竞争性结合）而阻止微生物对生长因子的利用，因而可以抑制微生物的生长只有当正常代谢产物的量少或不存在时，抗代谢物才有用 种类：种类：磺胺药磺胺药————对氨基苯甲酸对氨基苯甲酸 ；； 6-6-巯基嘌呤巯基嘌呤————嘌呤；嘌呤； 5-5-甲基色氨酸甲基色氨酸————氨基酸；氨基酸； 异烟肼异烟肼————吡哆醇。
吡哆醇 磺胺药作用机理：磺胺药作用机理：细菌需要利用对氨基苯甲酸细菌需要利用对氨基苯甲酸合成生长所需的叶酸，磺胺药竞争性抑制二合成生长所需的叶酸，磺胺药竞争性抑制二氢叶酸合成酶，通过干扰细菌叶酸代谢而抑氢叶酸合成酶，通过干扰细菌叶酸代谢而抑菌SO2NHR1 R2 HN 作用机制：（1）抑制细胞壁的合成，如青霉素； （2）破坏细胞膜功能，如多粘菌素可作用于膜磷脂使膜溶解； （3）抑制蛋白质合成，如氯霉素，四环素、链霉素等； （4）干扰核酸代谢，如利福霉素、新生霉素、丝裂霉素、灰黄霉素3 3）抗生素：）抗生素： 微生物在其生命过程中所产生的一类低分子量微生物在其生命过程中所产生的一类低分子量代谢产物，在很低浓度下就能抑制甚至杀死其它微代谢产物，在很低浓度下就能抑制甚至杀死其它微生物的生长的化学物质生物的生长的化学物质 2. 辐射灭菌辐射灭菌v原理：利用高能量的电磁辐射与菌体核酸原理：利用高能量的电磁辐射与菌体核酸的光化学反应造成菌体死亡的光化学反应造成菌体死亡 v常用：紫外线、常用：紫外线、X射线和射线和γ射线v紫外线波长250~270nm，30瓦紫外线灯、照射30分钟，表面或空气杀菌。
v使用范围：用于室内空气及器皿表面灭菌使用范围：用于室内空气及器皿表面灭菌 3．干热灭菌．干热灭菌 v原理：利用高温对微生物有氧化、蛋白质变原理：利用高温对微生物有氧化、蛋白质变性和电解质浓缩作用而杀灭微生物性和电解质浓缩作用而杀灭微生物v常常用用方方法法：：灼灼烧烧和和电电热热箱箱加加热热，，140-180℃℃ 1-2小时小时v 使用范围：玻璃及金属用具及沙土管灭菌使用范围：玻璃及金属用具及沙土管灭菌 4．湿热灭菌．湿热灭菌 v原理：原理：借助蒸汽释放的热量使微生物细胞中的蛋白质、酶和核酸分子内部的化学键，特别是氢键受到破坏，引起不可逆的变性，使微生物死亡v常用方法：常用方法：水煮常压灭菌：水煮常压灭菌：100℃℃饱和蒸汽灭菌：一般饱和蒸汽灭菌：一般121℃℃，，30分钟分钟v使用范围：培养基和发酵设备灭菌使用范围：培养基和发酵设备灭菌 v优点：优点：1）蒸汽来源容易，操作费用低廉，本身无毒v 2)蒸汽具有很强的穿透力，灭菌易于彻底v 3）蒸汽均有很大的潜热，冷凝后的水分有利于湿热灭菌v 4）蒸汽输送可借助本身的压强，调节方便，技术管理容易v缺点：缺点：1)设备费用高v 2）不能用于怕受潮的物料灭菌 三、加热灭菌的原理v1.、微生物的热阻：v杀死微生物的最低温度（最低温度（极限温度）称为致死温度。
在致死温度下，杀死全部微生物所需的时间称为致死时间；在致死温度以上，温度愈高，致死时间愈短v微生物的热阻：微生物对热的抵抗力微生物在某一特定微生物在某一特定条件下（主要是温度和加热方式）下的致死时间条件下（主要是温度和加热方式）下的致死时间l一般无芽胞细菌，在一般无芽胞细菌，在60℃℃下经过下经过10min即可全部杀死；即可全部杀死；l芽胞细菌的芽胞在芽胞细菌的芽胞在100℃℃下经过几分钟至数小时才能杀死；下经过几分钟至数小时才能杀死；l某些嗜热菌能在某些嗜热菌能在120℃℃下耐受下耐受20～～30minl一般讲，一般讲，灭菌的彻底与否以灭菌的彻底与否以能否杀死芽胞细菌为标准能否杀死芽胞细菌为标准 相对热阻相对热阻：某一微生物在某条件下的致死时间与另一：某一微生物在某条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间的比值微生物在相同条件下的致死时间的比值微生物对湿热微生物对湿热的相对抵抗力的相对抵抗力微生物微生物大肠杆菌大肠杆菌细菌芽胞细菌芽胞霉菌孢子霉菌孢子病毒病毒相对抵抗力相对抵抗力12～～101～～5 2、微生物的热致死动力学：对数残留定律v在一定温度下，微生物热死遵循分子反应速度分子反应速度理论，在微生物受热失活过程中，微生物不断被杀死，活菌数不断减少，其减少速度随活菌残留的减少而减少，微生物受热死亡的速率与残存的微生物数量成正比。
微生物受热死亡的速率与残存的微生物数量成正比v N N：任一时刻的活细菌浓度（个：任一时刻的活细菌浓度（个/L/L））θθ：时间（：时间（minmin））K K：热死速率常数（：热死速率常数（minmin-1-1）） 积分边界条件：N0→Nθ；θ0=0式中，θ 灭菌时间（s）；N0 灭菌开始时，培养基中杂菌个数（个）；Nθ 经过灭菌时间θ后，残存的活菌数（个） v3、热致死反应的速度常数Kv 反应速率常数k时微生物耐热性的一种特征它随微生物的种类和灭菌温度而异v在相同温度下，k值愈小，则微生物愈耐热；k值愈大，微生物愈不耐热v同一种微生物在不同的灭菌温度下，k值不同，灭菌温度愈低，k值愈低v灭菌时间还取决于污染程度（N0） 、灭菌程度（Nt）如果要达到彻底灭菌，即灭菌结束时残留的活微生物数等于0，则所需的时间应为无限长，这在实际中是不可能的工程上，在进行灭菌的设计时，常取Nt=0.001，即在1000次灭菌中，允许有一次失败 某些芽胞细菌某些芽胞细菌的的k值值细菌名称细菌名称k值值/min-1枯草芽胞杆菌枯草芽胞杆菌3.8～～2.6硬脂嗜热芽胞杆菌硬脂嗜热芽胞杆菌FS15180.77硬脂嗜热芽胞杆菌硬脂嗜热芽胞杆菌FS6172.9产气梭状芽胞杆菌产气梭状芽胞杆菌PA36791.8 微生物的受热死亡属于单分子反应单分子反应，其灭菌速率常数K与温度之间的关系可用阿累尼乌斯公式阿累尼乌斯公式表示：A---频率常数，也称阿累尼乌斯常数，s-1；R---气体常数，8.314J/mol·KT---绝对温度，K；ΔE---微生物死亡活化能，J/mol。
4、灭菌的温度和时间、灭菌的温度和时间 灭菌时，培养基成分分解速率常数K`与温度之间的关系也可用阿累尼乌斯公式表示：K`---培养基内易被破坏成分的分解速率常数；A`---频率常数，也称阿累尼乌斯常数，s-1；R---气体常数，8.314J/mol·K；T---绝对温度，K；ΔE`---培养基成分分解所需活化能，J/mol 当培养基成分从T1上升到T2时，微生物的死亡速率与培养基的分解有如下关系： 实验证明：灭菌时杀死微生物的活化能大于培养基成分的破坏活化能实验证明：灭菌时杀死微生物的活化能大于培养基成分的破坏活化能 将温度提高到一定程度，会加速细菌孢子的死灭速度，缩短灭菌时间，由于有将温度提高到一定程度，会加速细菌孢子的死灭速度，缩短灭菌时间，由于有效成分的效成分的ΔE很低，温度的提高只能稍微增大其破坏速度，但由于灭菌时间的显很低，温度的提高只能稍微增大其破坏速度，但由于灭菌时间的显著缩短，有效成分的破坏反而减少（即著缩短，有效成分的破坏反而减少（即高温短时灭菌高温短时灭菌））灭菌温度灭菌温度℃灭菌时间（分）灭菌时间（分）营营养养成成分分破破坏坏量量%10040099.31103667.01151550.0120427.01300.58.01450.082.01500.011.0N/No=0.001灭菌温度、时间与营养成分破坏量的关系 四、影响灭菌的因素v培养基成分培养基成分对灭菌的影响对灭菌的影响ü油脂、糖类及一定浓度的蛋白质可增加微生物油脂、糖类及一定浓度的蛋白质可增加微生物的耐热性，另一些物质，如高浓度的盐类，色的耐热性，另一些物质，如高浓度的盐类，色素等可削弱其耐热性。
素等可削弱其耐热性v培养基的培养基的物理状态物理状态对灭菌的影响（固含物量、粘对灭菌的影响（固含物量、粘度、起泡性能）度、起泡性能）v培养基中培养基中氢离子浓度氢离子浓度对灭菌的影响对灭菌的影响ü培养基中氢离子浓度直接影响灭菌的效果培培养基中氢离子浓度直接影响灭菌的效果培养基的酸碱度越大，所需杀灭微生物的温度越养基的酸碱度越大，所需杀灭微生物的温度越低 四、灭菌工艺 24016012080时间（min)050100150温度升温冷却保温过程包括：升温、保温和冷却等三个阶段 各阶段对灭菌的贡献：20%、75%、5%（一）间歇灭菌（一）间歇灭菌 定义：将配制好的培养基同时放在发酵罐或其他装置中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起进行加热灭菌的过程，通常也称为实罐灭菌常用）（常用） 例：有一发酵罐内装40m3培养基，在121温度下进行实罐灭菌原污染程度为每1mL有2*105个耐热细菌芽孢，121度时灭菌速度常数为1.8min-1求灭菌失败机率为0.001时所需要的灭菌时间 解解： N0=40× 106× 2× 105=8× 1012（个） Nt=0.001（个） K= 1.8min-1 但是实际上，培养基在加热升温时（即在升温阶段）就会有部分菌被杀灭，特别是当培养基加热到100度以上，这个作用较为显著。
因此，保温灭菌时间实际上比上述计算的要短严格地讲，在降温阶段也有杀菌作用，但降温时间短，在计算时一般不考虑 发酵罐蒸汽蒸汽蒸汽蒸汽冷却水冷却水无菌培养基无菌培养基配料罐配料罐泵泵加热塔加热塔维持罐维持罐冷却管冷却管 定义：将配制好的培养基在向发酵罐等培养装置输送的同时进行加热、 保温和冷却而进行灭菌 连续灭菌的基本设备一般包括（1）配料预热罐，将配制好的料液预热到60-70℃，（2）连消塔，连消塔的作用主要是使高温蒸汽与料液迅速接触混和，并使料液的温度很快升高到灭菌温度（126-132 ℃ ）；（3）维持罐，连消塔加热的时间很短，光靠这段时间的灭菌是不够的，维持罐的作用是使料液在灭菌温度下保持5-7min，以达到灭菌的目的；（4）冷却管，从维持罐出来的料液要经过冷却排管进行冷却，生产上一般采用冷水喷淋冷却，冷却到40-50 ℃后，输送到预先已经灭菌过的罐内 （二）、连续灭菌 连续灭菌温度随时间的变化连续灭菌温度随时间的变化 （三）间歇灭菌与连续灭菌的比较 灭菌方式优 点缺 点连续灭菌1. 灭菌温度高，可减少培养基中营养物质的损失2. 操作条件恒定，灭菌质量稳定3. 易于实现管道化和自控操作4. 避免了反复的加热和冷却，提高了热的利用率5. 发酵设备利用率高1. 对设备的要求高，需另外设置加热、冷却装置2. 操作较麻烦3. 染菌的机会较多4. 不适合于含大量固体物料的灭菌5. 对蒸汽的要求高间歇灭菌1. 设备要求低，不需另外设置加热、冷却装置2. 操作要求低，适于手动操作3. 适合于小批量生产规模4. 适合于含有大量固体物质的培养基的灭菌1. 培养基的营养物质损失较多，灭菌后培养基的质量下降2. 需进行反复的加热和冷却，能耗较高3. 不适合于大规模生产过程的灭菌4. 发酵罐的利用率较低 纤维素原料生产燃料乙醇的研究进展 。