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1、完整版教学课件完整版教学课件6.4药品的微生物限度检查第一节 概述第二节 药物的体外抗菌试验第三节 药品的无菌检查第四节 药品的微生物限度检查第五节 活螨检查 第六章 药品微生物学检查 微生物限度检测法是检测非规定灭菌制剂（即允许有菌的制剂）及其原、辅料受微生物污染程度的方法。 第四节 药品的微生物限度检查微生物限度检查项目需氧菌总数检查霉菌和酵母菌检查控制菌检查l大肠埃希菌l耐胆盐革兰阴性菌l铜绿假单胞菌l沙门菌l金黄色葡萄球菌l梭菌l白色念珠菌非全检，检查种类与剂型、给药途径、原料来源等有关（一）检查标准中国药典（2015年版）四部 微生物总数检查参照通则1105；控制菌检查法参照通则11
2、06。一、药品微生物限度检查总则（二）检查环境洁净度不低于D级背景下的局部B级环境（三）微生物限度检查的药品种类 口服制剂及大部分外用制剂1.口服制剂液体制剂、半固体制剂、部分口服固体制剂。2.外用制剂除眼用制剂及注明无菌药品外，其余所有外用制剂。3.原辅料含菌的药用原辅料。（四）检验数量和检验量1.抽样方法：随机性、有代表性、可疑 2.检验数量 应从2个以上最小包装单位中抽取,大蜜丸不得少于4丸,膜剂不得少于4片。3.检验量 l固体：l半固体： 10gl黏性制剂：l液体制剂：10mll膜剂：100cm2 （五）检查项目及培养条件检查项目培养基培养温度培养时间需氧菌总数胰酪大豆胨琼脂培养基(T
3、SA)303535d霉菌和酵母菌总数沙氏葡萄糖琼脂培养基(SDA)202557d 控制菌不同控制菌采用的培养基不同3035不同控制菌培养时间不同1.水溶性供试品：10g(ml)+稀释液1:10供试液（一）供试液制备方法 稀释液和冲洗液lpH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液lpH7.2磷酸盐缓冲液l胰酪大豆胨液体培养基等10g或10ml适量稀释液100ml 1:10供试液匀浆仪 二、微生物总数检查2.油脂性供试品10g(ml)+乳化剂+稀释液 1:10供试液10g或10ml100ml 1:10供试液十四烷酸异丙酯或聚山梨酯80等40乳化加稀释液匀浆仪 （二）需氧菌总数检查l检查单位重量、体积或面积（g
4、 、ml 或10cm2）的非规定灭菌制剂药品中所污染活的需氧菌数量（包括细菌和真菌）。 1.平皿法：适用于含菌量高 的供试品2.薄膜过滤法：适用于有抑菌活性 或菌量不太高的供试品3.最可能数法(MPN)：适用于含菌量太 低、不能用前两法检查的供试品检查方法倾注法涂布法需氧菌总数(TAMC)检查培养条件培养基培养温度培养时间胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA)303535d 1.平皿法（1）基本程序：数据处理 结果观察与计数书写检验记录平板接种需氧菌的培养供试液的制备配培养基和稀释液l倾注法l涂布法 倒置培养35d3035TSA 不少于 0.1ml10-110-110-210-210-310-3阴性对
5、照阴性对照(2)平皿法-涂布法：需氧菌总数检查操作示意图 先加 后加 涂布 稀释液10g/10ml/100cm2供试品9ml10-1 1ml1ml100ml供试液10-310-2倒置培养35d3035TSA10-110-110-210-210-310-3阴性对照阴性对照(2)平皿法-倾注法：需氧菌总数检查操作示意图 后加 先加 混合各1ml 稀释液10g/10ml/100cm2供试品9ml10-1 1ml1ml100ml供试液10-310-210g/10ml/100cm2供试品取相当于1g、1ml或10cm2供试液用滤膜过滤、冲洗取下滤膜,菌面朝上贴胰酪大豆胨琼脂平板上培养结果观察 与计数数据
6、处理书写检验 记录2.薄膜过滤法 1010-1-1100ml供试液（1）基本程序：（1）基本程序：数据处理 结果观察,查MPN检索表书写检验记录连续3个稀释级接种TSB管,3管/稀释级需氧菌 培养供试液的制备配培养基和稀释液3.MPN法(最可能数法) (2)MPN法操作示意图 910mlTSB各3管 10-1 10-1 10-1 10-2 10-2 10-2 10-3 10-3 10-3 稀 稀 稀9ml稀释液10g/10ml/100cm2供试品10-11ml1ml100ml供试液10-210-3每管加1ml3035培养35d，结果观察，查最可能检索表点计菌落数，菌落数乘于稀释倍数即为1g、1
7、ml或10cm2供试品中的微生物总数。按菌落报告规则报告结果。4.结果观察及计算 （三）霉菌和酵母菌总数检查l检查单位重量、体积或面积（g 、ml 或10cm2）的非规定灭菌制剂药品中所污染活的霉菌和酵母菌数量（也包括细菌菌落）。 1.平皿法：适用于含菌量较多 的供试品2.薄膜过滤法：适用于有抑菌活性或 菌数不太多的供试品检查方法倾注法涂布法注意：MPN法不适用于真菌霉菌和酵母菌总数(TYMC)检查培养条件培养基培养温度培养时间沙氏葡萄糖琼脂培养基(SDA)202557d含抗生素的胰酪大豆胨琼脂培养基玫瑰红钠琼脂培养基*真菌总数检查除培养基、培养温度、培养时间不同外，操作方法与需氧菌总数检查完
8、全相同。l若需氧菌、霉菌和酵母菌总数均在限度标准内，判微生物计数符合规定。l若仅需氧菌超出限度标准，判微生物计数不符合规定，不再复检。l若仅霉菌和酵母菌总数因细菌超出限度标准，可重新复检1次，以复检结果报告。 微生物计数检查结果判断：阴性对照不得有菌生长，否则检验结果无效三、控制菌检查法 （一）耐胆盐革兰阴性菌（二）大肠埃希菌（三）铜绿假单胞菌（四）沙门菌（五）金黄色葡萄球菌（六）梭菌（七）白色念珠菌l阴性对照：无菌生长l阳性对照：检出阳性菌l供试品控制菌检查未特别说明,控制菌培养温度为3035未检出：判符合规定检出：判不符合规定(除耐胆盐革兰阴性菌限量)以一次检出结果为准,不再复检 阳性对照
9、：l阳性菌l供试品供试品l相应控制菌规定菌株l菌量为l00cfu 供试品检查：阴性对照：稀释液l无菌生长l检出阳性菌l未检出：符合规定l检出：不符合规定（一）耐胆盐革兰阴性菌检查 耐胆盐革兰阴性菌指在胆汁酸中可以存活并繁殖的革兰阴性菌。 2015年版中国药典规定呼吸道吸入给药制剂、含药材原粉的口服中药制剂、中药提取物、中药饮片等需检查耐胆盐革兰阴性菌，其数量不得超过限度标准。肠道增菌肉汤供试液的制备书写检验记录1.耐胆盐革兰阴性菌检查程序 配培养基和稀释液无菌落紫红胆盐葡萄糖琼脂平板查耐胆盐革兰阴性菌的可能菌数表定性定量10g/10ml/100cm2供试品做定量检查2.耐胆盐革兰阴性菌定性检查
10、操作示意图以TSB制备100ml供试液 肠道增菌液2025,2h 预增菌10ml 2448h紫红胆盐葡萄糖平板1010-1-1无菌落 1824h有菌落报告未检出10g/10ml/100cm2供试品3.耐胆盐革兰阴性菌定量检查操作示意图以TSB为稀释液制供试液一定量肠道增菌肉汤2025,2h预增菌1ml 2448h紫红胆盐葡萄糖平板报告结果1010-1-1 1824h1010- -2 21010-3-31ml1010-1-11010-2-21010-3-3各管加1ml查可能菌数表9ml稀释液有/无菌落 （二）大肠埃希菌检查 大肠埃希菌作为检验供试品是否受粪便污染的指示菌。 2015年版中国药典规
11、定经口及呼吸道服给药的制剂，每1g、1ml或10cm2不得检出大肠埃希菌。 TSB增菌培养供试液的制备书写检验记录1.大肠埃希菌检查程序 配培养基和稀释液无菌落MacC琼脂平板 确证试验最终结果判断MacC肉汤有菌落10g/10ml/100cm2供试品确证试验2.供试品大肠埃希菌检查操作示意图 100ml 供试液适宜体积TSB增菌液10ml营养琼脂纯培养100mlMacC肉汤1824h1ml4244 2448hMacC平板报告未检出1010-1-1无菌落 1872h有菌落阴性阳性报告检出 1824h 沙门菌属是通过消化道传播、肠杆菌科的重要肠道致病菌。 （三）沙门菌检查 2015年版中国药典规
12、定含脏器提取物或药材原粉的口服制剂、研粉口服、直接口服及泡服的中药饮片每10g或10ml不得检出沙门菌。 RV肉 汤增 菌 培养TSB中预培养书写检验记录木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂划线分离无菌落或无特征菌落配培养基和稀释液有特征菌落三糖铁琼脂培养基穿刺接种最终结果判断确证试验1.沙门菌检查程序10g/10ml 供试品适宜体积TSB预培养10mlRV肉汤增菌培养 报告未检出无菌或无疑似菌落有疑似 菌落三糖铁 斜面无疑似现象有疑似现象1824h 确证试验2.供试品沙门菌检查操作示意图 1824h0.1ml 1824h木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂1848h阴性阳性报告检出 革兰阴性无芽胞杆菌，能产生蓝绿色
13、的水溶性色素，俗称绿脓杆菌，是常见的化脓性感染菌，可引起局部感染和败血症。 2015年版中国药典规定局部给药的外用制剂，每1g、1ml或10cm2不得检出铜绿假单胞菌。（四）铜绿假单胞菌检查TSB增菌培养供试液的制备书写检验记录溴化十六烷基三甲铵平板分离无菌落配培养基和稀释液最终结果判断氧化酶试验等确证试验1.铜绿假单胞菌检查程序有菌落10g/10ml/100cm2供试品 100ml 供试液1824h溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基 报告未检出有菌落无菌落 阳性 确证试验 1872h 2.供试品铜绿假单胞菌检查操作示意图氧化酶试验 阴性 1010-1-1阴性阳性报告检出阳性:30s粉色变紫红;阴性
14、:不变色或仅粉色 适宜体积TSB增菌液10ml 金黄色葡萄球菌是葡萄球菌属中致病性最强的一种化脓性病原菌，也是人类食物中毒症中常见的病原菌之一 ，可引起局部感染和败血症 。 2015年版中国药典规定局部给药的外用制剂，每1g、1ml或10cm2不得检出金黄色葡萄球菌。（五）金黄色葡萄球菌检查TSB增菌 培养供试品液制备书写检验记录甘露醇氯化钠琼脂平 板1.金黄色葡萄球菌检查程序 无菌落或无特征菌落 确证试验 配培养基和稀释液有特征菌落纯培养最终结果判断10g/10ml/100cm2供试品适宜体积TSB增菌液 10ml1824h甘露醇氯化钠琼脂 报告未检出有疑似 菌落无菌或无疑似菌落纯培养确证试
15、验 1872h 2.供试品金黄色葡萄球菌检查操作示意图1010-1-1 100ml 供试液阴性阳性报告检出 革兰阳性杆菌，芽胞多大于菌体，成梭形，多为专性厌氧菌。有些种能产生外毒素使人和动物致病。 2015年版中国药典规定阴道、尿道给药的中药制剂每1g、1ml或10cm2不得检出梭菌。 （六）梭菌的检查 梭菌增菌培养基供试液的制备书写检验记录哥伦比亚琼脂培养基分离1.梭菌检查程序 无菌落生长过氧化氢酶试验 配培养基和稀释液最终结果判断有菌落确证试验10g/10ml/100cm2供试品2.供试品梭菌检查操作示意图 各10ml分别接种一份80保温10min后迅速冷却 厌氧,48h 报告检出适宜体积
16、的梭菌增菌培养液无菌落厌氧,4872h 哥伦比亚琼脂平板 1010-1-1 100ml 供试液G+杆菌有/无芽孢无气泡,阴性报告未检出有菌落革兰染色、镜检过氧化氢酶试验 又称白色假丝酵母，卵圆形真菌，革兰染色阳性，有芽生孢子，能形成厚膜孢子和假菌丝。感染后可引起呼吸系统、消化系统和泌尿生殖系统的疾病。 2015年版中国药典规定阴道、尿道给药的制剂每1g、1ml或10cm2不得检出白色念珠菌。 （七）白色念珠菌检查 沙氏葡萄糖肉汤增菌培养供试液的制备书写检验记录沙 氏 葡萄 糖 琼脂 培 养基分离 1.白色念珠菌检查程序 念珠菌显色培养基平板 配培养基和稀释液有疑似菌落最终结果判断无菌落或无特征
17、菌落确证试验 10g/10ml/100cm2供试品100ml沙氏葡萄糖液体培养基 10ml35d沙氏葡萄糖琼脂平板 报告未检出有疑似 菌落无菌或无疑似菌落 2448h 2448h 念珠菌显色培养基无疑似菌落有绿色或翠绿色菌落2.供试品白色念珠菌检查操作示意图1010-1-1 100ml 供试液报告检出确证试验 阴性阳性微生物限度检查结果判断：l三项均合格,判 符合规定l任一项不合格, 判不符合规定需氧菌、控制菌以一次检出结 果报告，不再复检；真菌因细菌原因一次检出不符 ,可再复检一次,以第二次检查结果报告需氧菌总数霉菌和酵母菌总数控制菌主要内容重点小结检查依据2015版中国药典四部检查环境无菌室：背景不低于D级的局部B级内容和方法需氧菌总数检查胰酪大豆胨琼脂培养基，3035，培养35d，设阴性，应无菌长霉菌和酵母菌总数检查沙氏葡萄糖琼脂培养基，2025，培养57d，设阴性，应无菌长控制菌检查(非全检)大肠埃希菌、耐胆盐革兰阴性菌、沙门菌、铜绿假单孢菌、金黄色葡萄球菌、梭菌、白色念珠菌，每种菌检查均要设阳性对照，应检出阳性菌；阴性对照应无菌长。 结果判断三项检查结果均符合标准,判供试品符合规定；任一项不符合标准，判供试品不符合规定。小结
