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1、第十二章 高效液相色谱法分析化学（仪器分析部分） 12-1 高效液相色谱特点与仪器12-1-1 流程12-1-2 特点与应用12-1-3 主要部件12-2 基本原理与主要分离类型12-3 固定相与流动相 12-3-1 液相色谱固定相 12-3-2 液相色谱流动相12-4 影响分离的因素12-5 离子色谱法12-6 超临界色谱 12-6-1 超临界流体色谱的特点与原理 12-6-2 超临界流体色谱仪的结构流程 12-6-3 超临界流体色谱的应用目 录12-1 高效液相色谱特点与仪器12-1-1 流程12-1-2 特点与应用1. 高效液相色谱法的特点 特点：高压、高效、高速特点：高压、高效、高速
2、高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。2. 高效液相色谱法的应用化合物的分离、鉴定、纯化以及定量。化合物的分离、鉴定、纯化以及定量。 溶质在液体中的扩散系数比气体中约小105倍 液体粘度比气体约大102倍 液体表面张力比气体约大104倍 液体密度比气体约大103倍 液体不可压缩12-1-3 主要部件(1) 高压输液泵主要部件之一，压力：主要部件之一，压力：150350105 Pa。为为了了获获得得高高柱柱效效而而使使用用粒粒度度很很小小的的固固定定相相（ 甲酰胺甲酰胺 乙腈乙腈 甲醇甲醇 乙醇乙醇 丙醇丙醇 丙酮丙酮 二氧六环二氧六
3、环 四氢呋喃四氢呋喃 甲乙酮甲乙酮 正丁醇正丁醇 乙酸乙酯乙酸乙酯 乙醚乙醚 异丙醚异丙醚 二氯甲烷二氯甲烷氯仿氯仿溴乙烷溴乙烷苯苯四氯化碳四氯化碳二硫化碳二硫化碳环己烷环己烷己烷己烷煤油煤油(最小最小)4. 选择流动相时应注意的几个问题（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。
4、相等。（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。淀并在柱中沉积。（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。检测器时，流动相不应有紫外吸收。12-4 影响分离的因素1. 影响分离的因素与提高柱效的途径 在在高高效效液液相相色色谱谱中中, 液液体体的的扩扩散散系系数数仅仅为为气气体体的的万万分分之之一一，则则速速率率方方程程中中的的分分子子扩扩散散项项B/U较较小小，可可以以忽忽略略不不计计，即：即： H = A + C u 故液相色谱故液相色谱H-u
5、曲线与气相色谱的形状不同，如图所示。曲线与气相色谱的形状不同，如图所示。 液液体体的的黏黏度度比比气气体体大大一一百百倍倍，密密度度为为气气体体的的一一千千倍倍，故故降低传质阻力是提高柱效主要途径。降低传质阻力是提高柱效主要途径。 由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。 液相色谱中，不可能通过液相色谱中，不可能通过增加柱温来改善传质。恒温增加柱温来改善传质。恒温 改变淋洗液组成、极性是改变淋洗液组成、极性是改善分离的最直接的因素。改善分离的最直接的因素。 2. 流速 流速大于流速大于0.5 cm/s时时, Hu曲线是一段斜率不大的直线。曲线是一段斜率不大的
6、直线。降低流速，柱效提高不是很大。降低流速，柱效提高不是很大。但在实际操作中，流量仍是一但在实际操作中，流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重个调整分离度和出峰时间的重要可选择参数。要可选择参数。 3. 固定相及分离柱 气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。但在高效液相色谱中，分离柱选用原则与气相色谱一样。但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。4. 液相制备色谱 获得高纯物质（色谱纯）的有效方法。获得高纯物质（色谱纯）的有效方法
7、。 半制备柱（内径半制备柱（内径8mm，长度长度15 30cm），），一次制备量一次制备量.1mg；色谱柱的柱容量（柱负荷） 对分析柱：对分析柱：不影响柱效时的最大进样量； 对制备柱：对制备柱：不影响收集物纯度时的最大进样量； 超载：超载：进样量超过柱容量。柱效迅速下降，峰变宽。 超载可提高制备效率，以柱效下降一半或容量因子超载可提高制备效率，以柱效下降一半或容量因子k降降低低10%为宜。为宜。液相制备色谱的方法收集组分时，通常有以下情况：收集组分时，通常有以下情况： （1）可获得良好分离，主峰）可获得良好分离，主峰 使用制备柱，超载提高效率；使用制备柱，超载提高效率； （2）两主成分之间的小
8、组分；）两主成分之间的小组分； 超载，分离切分使待分离组分成超载，分离切分使待分离组分成为主成分（富集）后，再次分离为主成分（富集）后，再次分离制备。制备。 以无机、特别是无机阴离子混合物为主要分析对象以无机、特别是无机阴离子混合物为主要分析对象, , 在七十年代出现、八十年代迅速发展。在七十年代出现、八十年代迅速发展。 传统离子交换色谱存在着两个难于解决的问题：传统离子交换色谱存在着两个难于解决的问题：(1)(1)需要高浓度淋洗液洗脱且洗脱时间很长；需要高浓度淋洗液洗脱且洗脱时间很长；(2)(2)洗脱后的组分缺乏灵敏、快速的在线检测方法。洗脱后的组分缺乏灵敏、快速的在线检测方法。12-5 离
9、子色谱法1. 离子色谱法原理 离离子子交交换换原原理理，与与传传统统离离子子交交换的不同点：换的不同点：采采用用交交换换容容量量非非常常低低的的特特制制离离子子交换树脂为固定相；交换树脂为固定相；细细颗颗粒粒柱柱填填料料，高高柱柱效效；采采用用高高压输液泵；压输液泵；低低浓浓度度淋淋洗洗液液或或本本底底电电导导抑抑制制（在在分分离离柱柱后后，采采用用抑抑制制柱柱来消除淋洗液的高本底电导）；来消除淋洗液的高本底电导）；可采用电导检测器，快速分离分析微量无机离子混合物；可采用电导检测器，快速分离分析微量无机离子混合物；各种抑制装置及无抑制方法的出现，发展迅速。各种抑制装置及无抑制方法的出现，发展迅
10、速。2. 离子色谱具有以下优点（1 1）分析速度快）分析速度快 可在数分钟内完成一个试样的分析；（2 2）分离能力高）分离能力高 在适宜的条件下，可使常见的各种阴离子混合物分离；例：使用双柱法，在十几分钟内，可使七种阴离子完全分离。（3）分离混合阴离子的最有效方法）分离混合阴离子的最有效方法（4）耐腐蚀，仪器流路采用全塑件，玻璃柱）耐腐蚀，仪器流路采用全塑件，玻璃柱抑制型：抑制柱型、连续抑制型 分分离离柱柱中中离离子子交交换换树树脂脂的的交交换换容容量量通通常常在在0.010.010.050.05毫摩尔毫摩尔/ /克干树脂。克干树脂。非抑制型: 当进一步降低分离柱中树脂的交换容量当进一步降低分
11、离柱中树脂的交换容量(0.007(0.0070.070.07毫摩尔毫摩尔/ /克干树脂克干树脂),),使用低浓度、低电离度使用低浓度、低电离度的有机弱酸及弱酸盐作淋洗液，如苯甲酸、苯甲酸盐等。的有机弱酸及弱酸盐作淋洗液，如苯甲酸、苯甲酸盐等。检测器可直接与分离柱相连，不需抑制柱。检测器可直接与分离柱相连，不需抑制柱。3. 离子色谱装置离子色谱连续抑制装置图4 离子色谱的应用阴离子分析: 双柱；薄壳型阴离子交换树脂分离柱双柱；薄壳型阴离子交换树脂分离柱(3250mm), 流流动动相相：0.003molL-1 NaHCO3 / 0.0024 molL-1 Na2CO3，流量流量138 mL/hr。
12、 七七种种阴阴离离子子在在20分分钟钟内内基基本本上上得得到到完完全全分分离离，各各组组分含量在分含量在350 ppm。1.概述 超超临临界界流流体体：在在高高于于临临界界压压力力与与临临界界温温度度时时，物物质质的的一一种状态。性质介于液体和气体之间。种状态。性质介于液体和气体之间。 超超临临界界流流体体色色谱谱( (SFC) )，8080年年代代快快速速发发展展，具具有有液液相相、气气相色谱不具有的优点相色谱不具有的优点: :（1）可可处处理理高高沸沸点点、不不挥挥发发试试样；样；（2）比比LC有有更更高高的的柱柱效效和和分分离离效率。效率。12-6 超临界色谱Supercritical
13、Fluid Chromatograph12-6-1 超临界流体色谱的特点与原理2. 超临界流体性质（1 1）性质介于液体和气体之间）性质介于液体和气体之间; ; 具具有有气气体体的的低低黏黏度度、液液体体的的高高密密度度，扩扩散散系系数数位位于于两两者之间。者之间。（2 2）可可通通过过改改变变超超临临界界流流体体的的密密度度（程程序序改改变变）调调节节组组分分分分离离（类类似似于于气气相相色色谱谱的的程程序序升升温温，液液相相色色谱谱中中的的梯梯度度淋淋洗）。洗）。 超临界流体的密度与压力有关。超临界流体的密度与压力有关。3.原理 SFC的流动相的流动相：超临界流体；超临界流体；CO2、N2
14、O、NH3 SFC的固定相的固定相：固体吸附剂（硅胶）或键合到载体（或毛细固体吸附剂（硅胶）或键合到载体（或毛细管壁）上的高聚物；可使用液相色谱的柱填料。填充柱管壁）上的高聚物；可使用液相色谱的柱填料。填充柱SFC和和毛细管柱毛细管柱SFC； 分离机理：吸附与脱附。组分在两相间的分配系数不同而分离机理：吸附与脱附。组分在两相间的分配系数不同而被分离；被分离； 通过调节流动相的压力（调节流动相的密度），调整组分通过调节流动相的压力（调节流动相的密度），调整组分保留值；保留值；压力效应： SFC的柱压降大（比毛细管色谱大的柱压降大（比毛细管色谱大30倍），对分离有倍），对分离有影响（柱前端与柱尾端
15、分配系数相差很大，产生压力效影响（柱前端与柱尾端分配系数相差很大，产生压力效应）；应）； 超临界流体的密度受压力在临界压力处最大，超过该超临界流体的密度受压力在临界压力处最大，超过该点，影响小，超过临界压力点，影响小，超过临界压力20%，柱压降对分离的影响，柱压降对分离的影响小；小； 压力效应：在在SFC中，压力变化对容量因子产生显著中，压力变化对容量因子产生显著影响，超流体的密度随压力增加而增加，密度增加提高影响，超流体的密度随压力增加而增加，密度增加提高溶剂效率，淋洗时间缩短。溶剂效率，淋洗时间缩短。 CO2流动相，当压力改变：流动相，当压力改变：7.09.0106 Pa，则：则： C16
16、H34的保留时间的保留时间 25min 5min。程序升压HPLC与SFC比较1.结构流程 12-6-2 超临界流体色谱仪的结构流程2.主要部件（1）SFC的高压泵的高压泵 无脉冲的注射泵；通过电子压力传感器和流量检测器，计无脉冲的注射泵；通过电子压力传感器和流量检测器，计算机控制流动相的密度和流量；算机控制流动相的密度和流量； （2）SFC的色谱柱和固定相的色谱柱和固定相 可以采用液相色谱柱和交联毛细管柱；可以采用液相色谱柱和交联毛细管柱； SFC的固定相的固定相：固体吸附剂（硅胶）或键合到载体（或毛固体吸附剂（硅胶）或键合到载体（或毛细管壁）上的高聚物；专用的毛细管柱细管壁）上的高聚物；专
17、用的毛细管柱SFC；（3）流动相）流动相 SFC的流动相的流动相：超临界流体；超临界流体；CO2、N2O、NH3。CO2应用应用最广泛；无色、无味、无毒、易得、对各类有机物溶解性好，最广泛；无色、无味、无毒、易得、对各类有机物溶解性好，在紫外光区无吸收；缺点：极性太弱；可加少量甲醇等改性；在紫外光区无吸收；缺点：极性太弱；可加少量甲醇等改性；（4）检测器）检测器 可采用液相色谱检测器，也可采用气相色谱的可采用液相色谱检测器，也可采用气相色谱的FID检测器检测器1.聚苯醚低聚物的分析色谱柱：色谱柱：10m10m 63m i.d. 63m i.d. 毛细管柱，毛细管柱，固定相：固定相：键合二甲基聚
18、硅氧烷；键合二甲基聚硅氧烷；流动相：流动相：CO2 ；柱温：；柱温：120 120 C C； 程序升压；程序升压；12-6-3 超临界流体色谱的应用2.甘油三酸酯的分析 四四种种组组分分仅仅双双键键数数目目和和位位置置不不同同，难难分离；分离； 色谱柱：色谱柱：DB-225 SFC毛细管柱；毛细管柱； 流动相：流动相： CO2 ；从；从15MPa程序升压到程序升压到27MPa；2.5hr完全分完全分离。离。目标 DNA附 录 分子信标核酸探针的合成与纯化 分子信标是个呈发夹结构、设计十分巧妙的短链DNA分子。由于它特殊的结构，自从1996年被首次合成出来以后，它已经被非常广泛地应用于PCR定量
19、、基因分型、基因芯片、活细胞内mRNA分析以及蛋白质（酶）研究等领域。步骤： 采用固相合成法合成核酸探针； 利用HPLC对粗产物进行纯化； 利用基质辅助激光解析飞行时间质谱仪对产物进行表证； 对产物进行杂交实验来验证其性能。采用固相合成法合成核酸探针POLYGEN 10 column DNA合成仪利用HPLC对粗产物进行纯化EquilibrationSample applicationElutionRegenerationKTA purifier高效液相色谱仪色 谱 图 保留时间为26.13min处的第一个峰，推测其为FAM-oligo DNA，保留时间为33.07min处的第二个峰，推测其为
20、目标产物。 谱图解析出的分子量为11014.17Da，严格计算出的分子量11018.896 Da，相差4.726 Da。分子量为5521.679 Da的是双质子产物，为目标产物。分子量为10882.048 Da的是在质谱过程中损失掉一个A碱基的目标产物。 质 谱 图（ultraflex MALDI-TOF/TOF） HITACHI Fluorescence Spectrophotometer F-2500FeaturesCapable of delivering sensitivity two times higher than the conventional model. (S/N rat
21、io: 450 or better) Equipped with a multi-step slit of 2.5 to 20 nm, making it applicable to a variety of samples. Incorporates flexible software features such as versatile quantitative analysis function, data export function for Excel, print preview function, etc. Easy to control with a mouse in an icon-based operating environment. 分 子 信 标 的 特 性
