2013-第三章生物大分子的分离纯化资料

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1、第四章第四章核酸的分离核酸的分离分离与纯化分离与纯化核酸的分离与纯化核酸的分离与纯化o临床分子诊断工作的主要对象是核酸。o核酸的分离纯化与鉴定是分子诊断学的基础工作，也是最常见、最基本的技术，对于分子诊断结果具有重要意义。第一节 核酸分离纯化 核酸（nucleic acid）种类种类: 脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA） 核糖核酸（ribonucleic acid，RNA） 分布分布: DNA：细胞核（真核细胞，原核细胞） 细胞器（叶绿体，线粒体） 病毒（DNA病毒） RNA：细胞核中产生，核仁中或运输到细胞质 RNA病毒 一、细胞内核酸的存在形式及理化性质 o

2、细胞内核酸的存在方式存在方式： DNA+ProteinDNP; RNA+ProteinRNPo分布不同；o核酸是多元酸，具有较强的酸性。 oDNA对碱相对稳定；RNA对酸相对稳定，但极端的酸碱均可导致二者的变性与降解。glycosidic bondphosphoester bondNucleosideDNA STRUCTURE (1)胞内核酸的理化性质o核酸分子为线状或环状，核酸分子为线状或环状，DNADNA是线性高分子，因此黏度极大，是线性高分子，因此黏度极大，RNARNA分子黏度较小。分子黏度较小。o嘌呤和嘧啶环中均含有共轭双键，故碱基、核苷、核苷酸、核酸嘌呤和嘧啶环中均含有共轭双键，故碱

3、基、核苷、核苷酸、核酸在在240-290nm240-290nm的紫外波段有强烈吸收，最大吸收峰在的紫外波段有强烈吸收，最大吸收峰在260nm260nm附近。附近。oDNADNA与与RNARNA的理化性质及细胞定位的差异决定了二者的最适分离与的理化性质及细胞定位的差异决定了二者的最适分离与纯化条件是不同的。纯化条件是不同的。o变性与复性。变性与复性。二、核酸分离制备的总原则1、保证核酸一级结构的完整性保证核酸一级结构的完整性 遗传信息全部储存在核酸一级结构之内，完整的一级结构是核酸结构与功能研究的前提。一级结构还决定其高级结构的形式及和其他大分子结合的方式。2、保证核酸的纯度、保证核酸的纯度，尽

4、量排除其他分子的污染。（一）材料与方法的选择 材料：材料：根据根据各自的研究目的，各自的研究目的，选择核酸含量丰选择核酸含量丰富，且易于采样富，且易于采样获得。常见如血获得。常见如血液、尿液、唾液、液、尿液、唾液、组织及培养细胞组织及培养细胞等。等。方法的选择方法的选择 核酸的提取方法很多，提取时主要考虑提取核酸的完整性、核酸纯度等因素，此外，还要考虑样品的种类、检测的目的及时间要求等因素。根据标本的类型、数量及制备核酸的用途等选择合适的方法。 手工提取； 试剂盒； 全自动仪器法。（二）如何保持核酸的完整性1 1、物理条件、物理条件：剪切力、高温等。简化提取步骤，缩短时间，避免剧烈震荡。2 2

5、、化学条件、化学条件：酸、碱、有机溶剂等。控制PH4-10。3 3、生物因素、生物因素：加入EDTA、低温等抑制DNase活性。4 4、样品、样品：应保持完整，细胞核和细胞器应没有明显破坏。5 5、用具、用具：提取用的各种器材或容器应提前消毒。三、核酸提取纯化的主要步骤（一）细胞裂解（一）细胞裂解：1 1、目的、目的：裂解细胞，释放核酸。2 2、方法、方法：机械与非机械 机械方法：超声波，液氮破碎，匀浆法，三氧化二铝粉研磨法等；缺点是容易导致DNA分子断裂。 非机械法：蛋白酶和去污剂法。条件相对温和，较好地保证DNA分子的完整性，应用广泛。3、常用的细胞裂解方法o匀浆法匀浆法 ：基于液相的剪切

6、力，适用面广，处理量大，速度快。但产热大，可能造成生物活性物质失活及DNA分子的断裂。o珠磨法珠磨法：利用研磨作用破碎，适用面广。但产热大，可能造成生物活性物质失活。o超声波超声波：利用超声波作用使细胞破碎， 产热量大，且散热不易，成本高，仅适用于小量样品破碎。 物理方法o干燥法干燥法：干燥后的菌体细胞膜渗透性变化，自溶较剧烈，易引起蛋白质或其他组分变性。o冻融法冻融法：胞内冰晶引起细胞膨胀破裂，较温和，但破碎作用较弱，常需反复冻融，仅适于在实验室中使用。o渗透压冲击法渗透压冲击法：渗透压突然变化，使细胞快速膨胀破裂，较温和，但破碎作用较弱，常与酶法合用。o化学法化学法：应用化学试剂溶解细胞或

7、抽提某些细胞组分，需选择合适的试剂，减小对活性物质的破坏，可应用于大规模生产。o酶解法酶解法：用酶反应分解破坏细胞壁上特殊的化学键，反应条件温和，但成本较高，一般仅适用于小规模应用。1、非核酸类大分子污染物：如蛋白质、多糖及脂类等；2、非所需的核酸分子；3、在分离过程中加入的溶剂与试剂。 分离纯化步骤越多，核酸纯度越高，但得率会逐步下降，完整性也受影响；相反，步骤少，核酸完整性较好，但纯度下降。需根据具体用途选择适当的方法。（二）核酸的抽提分离：（二）核酸的抽提分离： 核酸在水溶液中以多聚阴阳离子的化合物形式存在， 与一价阳离子形成盐，通过屏蔽带负电的磷酸基团，使DNA、RNA聚集在一起而不溶

8、于许多有机溶剂。 常用的盐有醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵等；常用的有机溶剂有乙醇、异丙醇和聚乙二醇；用70%-75%的乙醇洗涤共沉淀的盐。 核酸沉淀常含有少量共沉淀的盐，需用70-75%的乙醇洗涤去除。（三）核酸纯化：核酸的浓缩、沉淀与洗涤：（三）核酸纯化：核酸的浓缩、沉淀与洗涤：（四）核酸的鉴定与保存核酸的鉴定核酸的鉴定1 1、浓度测定、浓度测定紫外分光光度法（换算关系）荧光光度法（两种荧光试剂）2 2、纯度鉴定、纯度鉴定紫外分光光度法浓度鉴定1、紫外分光光度法、紫外分光光度法根据根据260nm的光吸收值算出其含量的光吸收值算出其含量 若260nm光吸收值为1 相当于50g/ml双螺旋DNA 或相

9、当于40g/ml单链DNA/RNA 或相当于33g/ml寡核苷酸。2、荧光光度法荧光染料：溴化乙锭（EB)-1-5ng SYBRGold -20pg核酸浓度计算公式：核酸浓度计算公式：o双链双链DNA浓度浓度( g/ml)=OD260稀释倍数稀释倍数50/1000o单链单链DNA或或RNA浓度浓度 ( g/ml)=OD260稀释倍数稀释倍数 50/1000纯度鉴定纯度鉴定-紫外分光光度法紫外分光光度法核酸纯度测定：核酸纯度测定：DNA样品：样品：OD260/OD2801.8 若样品中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明显降低；若含有RNA，则比值偏高。RNA样品：样品：OD260/OD

10、2801.8-2.03、完整性鉴定o总RNA中，rRNA占80-85%；tRNA scRNA snRNA占15-20%；mRNA占1-5%。o三条特针性区带原核生物：23S带，16S带，5S及tRNA带真核生物：28S带，18S带，5S、5.8 S及tRNA带o琼脂糖凝胶电泳法 DNA:是否拖尾 RNA：2比1关系。4、核酸的保存 DNA的储存：双蒸水及TE缓冲液。 RNA的储存：醋酸钠溶液或三蒸水中， RNA酶抑制剂。抑制抑制DNase： 可加柠檬酸钠、EDTA等金属螯合剂；或加去污剂 十二烷基硫酸钠（SDS）；或加蛋白变性剂。 抑制抑制RNase： （1）实验器皿高温，或高压灭菌，不能高压

11、灭菌的用 具用0.1%二乙基焦碳酸盐（diethyl pyrocarbonate, DEPC）处理。 （2）加入蛋白变性剂如硫氰酸胍、异硫氰酸胍等。 （3）加核糖核酸酶阻抑蛋白（RNasin）等RNase的抑制剂。 核酸酶抑制剂第二节 真核基因组DNA的分离纯化o一、酚抽提法提取哺乳动物高分子量DNAo二、NaI法提取人白细胞DNAo三、甲酰胺解聚法o四、玻璃棒缠绕法一、酚抽提法提取哺乳动物高分子量DNA o原理：原理： 将真核组织细胞破碎，用组织细胞裂解液溶解细胞膜、核膜，使组蛋白与DNA分离，再用酚、三氯甲烷或异戊醇抽提去除蛋白质，最后经乙醇沉淀DNA。 细胞裂解液：蛋白酶K、EDTA及十

12、二烷基磺酸钠（SDS）及RNA酶。有机相有机相中间层（变性蛋白质）中间层（变性蛋白质）水相（水相（DNADNA）酚抽提法提取基因组DNA 组织组织DNADNA的提取过程的提取过程匀浆匀浆组织组织SDS EDTASDS EDTA蛋白酶蛋白酶K K酚酚/ /氯仿抽提氯仿抽提乙醇沉淀乙醇沉淀重新溶解重新溶解DNADNA(TE(TE缓冲液缓冲液) )分离组织细胞分离组织细胞 离心离心取上层水相取上层水相水相水相/ /有机相有机相裂解细胞裂解细胞降解蛋白质降解蛋白质抑制抑制DNaseDNase蛋白质变性蛋白质变性提取提取DNADNA主要试剂及作用oEDTAEDTA：二价金属离子螯合剂，抑制DNase活性

13、，降低细胞膜稳定性。oSDSSDS：阴离子去垢剂，溶解细胞膜、核膜，乳化脂质、膜蛋白、胞内蛋白，将组蛋白与DNA分离，并使之变性沉淀。o无DNase的RNaseRNase：水解RNA避免降解DNA。o蛋白酶蛋白酶K K：广谱蛋白酶，在SDS存在保持较高活性，水解蛋白质。o酚与氯仿酚与氯仿：两种不同的蛋白质变性剂，联用可增加去除蛋白质的效果。氯仿还可加速有机相与水相的分层。o异戊醇异戊醇：抑制界面泡沫的形成。opH8.0的Tris缓冲液：保证提取时DNA进入水相；还可防止DNA变性。核酸的沉淀核酸的沉淀o原理：原理：核酸与钠、钾、镁形成的盐在许多有机溶剂中不溶，也不会变性。o醋酸钠为沉淀DNA、

14、RNA的最常用盐类。o有机溶剂：乙醇、异丙醇、聚乙二醇。o温度：冰水注：注：SDS法适用于大部分实验材料基因组法适用于大部分实验材料基因组DNA提取。如动物组织、提取。如动物组织、细胞、全血、细菌、酵母等。细胞、全血、细菌、酵母等。二、NaI法提取人白细胞DNA原理原理：在低渗的双蒸水中，血液中的红细胞膜及白细胞膜被破坏，释放出血红蛋白及细胞核。加入NaI，破坏核膜并解离DNA蛋白质复合物，使DNA以游离形式存在。再以三氯甲烷-异戊醇抽提使蛋白质变性沉淀并溶解脂质，离心。取上清，异戊醇沉淀DNA，弃上清。37%异戊醇或乙醇洗涤。三、甲酰胺解聚法 原理：原理：裂解细胞和消化蛋白的步骤以酚抽提法一

15、样；但不进行酚抽提；而是利用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合，然后透析处理DNA样品。 操作步骤操作步骤 1、裂解细胞和消化蛋白 2、50 3小时，蛋白酶K反应完毕后，将溶液冷却至0，加入甲酰胺，搅拌，15放置过夜； 3、火胶棉透析，直至A260/ A2801.75 4、条件温和，可获得200kb的DNA，但时间较长。四、玻璃棒缠绕法 原理： 本法用盐酸胍裂解细胞（6mol/L盐酸胍,0.1mol/LNaAc），提取的DNA分子量为80kb，其长度不适合构建基因组文库，但用于Southern杂交等，该法简便快速。英文名称英文名称:GuanidineHydrochloride中文名称：盐酸胍

16、中文名称：盐酸胍分子式：分子式：CH5N3HC盐酸胍溶液可溶解蛋白质，导致细胞结盐酸胍溶液可溶解蛋白质，导致细胞结构破坏，核蛋白二级结构破坏，从核酸构破坏，核蛋白二级结构破坏，从核酸上解离下来。上解离下来。操作步骤1、加入盐酸胍裂解细胞，室温慢速摇动1小时2、在另一试管中加入乙醇，小心将细胞裂解物铺于乙醇之上；3、用一带钩玻璃棒在裂解液与乙醇交界面慢慢搅动，沉淀出的胶状DNA将挂在玻璃棒上；4、将缠绕DNA的玻璃棒重新浸入一个含5ml乙醇中的离心管中，室温下浸泡2分钟。5、取出玻棒，室温下蒸发乙醇，这时DNA由胶状逐渐回缩；6、将带有DNA的玻棒置于TE缓冲液中，4过夜，使DNA溶解在TE缓冲

17、液中。DNA提取常见问题o DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应o DNA降解o DNA量少基因组DNA提取常见问题分析p DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应DNA中含有蛋白、多糖、多酚类物质 重复抽提纯化、高盐洗涤DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应 重新沉淀DNA中残留有金属离子 重新70%乙醇漂洗基因组DNA提取常见问题分析p DNA降解材料不新鲜或反复冻融材料不新鲜或反复冻融未很好抑制内源核酸酶的活性未很好抑制内源核酸酶的活性提取过程操作过于剧烈，提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断被机械打断外源核酸酶污染外源核酸酶污染p DNA提取量少实验材料不佳或量少 选取

18、新鲜（幼嫩）材料破壁或裂解不充分 充分研磨、破壁酶、延长裂解时间沉淀不完全 低温、延长沉淀时间洗涤使得丢失DNA基因组DNA提取常见问题分析五、基因组DNA片段的纯化 o1、目的： 进一步纯化去除少量RNA、蛋白质及小分子杂质； 获取某些片断；o2、方法： 透析、层析、电泳及选择性沉淀。其中电泳最常用。凝胶电泳o电泳：带电粒子在电场中向与其自身电荷相反电极电泳：带电粒子在电场中向与其自身电荷相反电极的运动称为电泳。的运动称为电泳。o原理：琼脂糖分子依靠氢键和其它力的作用使其相原理：琼脂糖分子依靠氢键和其它力的作用使其相互缠绕形成绳状琼脂糖束，构成细微多孔的网状结互缠绕形成绳状琼脂糖束，构成细微

19、多孔的网状结构。构。凝胶电泳兼有分子筛效应和电荷效应。o在核苷酸中的磷酸基团和碱基带电，是两性分子。在PH3.5时带正电；在PH8.5时带负电。o优点优点：简单、快速、灵敏、成本低。（一）电泳介质（一）电泳介质oDNA凝胶电泳常用两种支持材料，琼脂糖（AG）和聚丙烯酰胺凝胶（PAG），通过这两种介质的浓度变化调整所形成凝胶的分子筛网孔大小，分离不同分子量的核酸片段。o琼脂糖主要从海洋植物琼脂中提取来的，为聚合线状分子，一般还含有多糖、蛋白质和盐等杂质。（经化学修饰后熔点降低的琼脂糖叫低熔点琼脂糖，其机械强度无明显变化，主要用于DNA片段的回收）。琼脂糖凝胶的孔径大，可分离长度为100bp至60

20、kb的DNA分子；o聚丙烯酰胺凝胶的孔径小，可分离长度为5-500bp的DNA分子。 （二）影响因素（二）影响因素1、核酸样品的性状：包括分子大小、电荷多少性状及空间结构。DNA分子大小DNA分子构象：超螺旋线状开环2、琼脂糖浓度；3、电场强度：一般5V/cm，对于大分子量真核基因组DNA片段可采用0.51V/cm电泳过夜，以取得较好的分辨率和带型。 不同浓度琼脂糖的凝胶分离范围不同浓度琼脂糖的凝胶分离范围琼脂糖浓度琼脂糖浓度（，（，W/ V ) DNA分子的有效分离范围（分子的有效分离范围（kb)0.7 0.8-100.9 0.5-71.2 0.4-61.5 0.2-32.0 0.1-2+-

21、 双链双链DNA的电泳的电泳负极到正极：分子量由大到小负极到正极：分子量由大到小（三）染料溴化乙锭（EB）： 染色方法 EB对电泳的影响其它染料 SYBR Gold;SYBR Green及吖啶橙等溴乙锭（EB）oEB是一种荧光染料，这种扁平分子可以嵌入核酸双链的配对碱基之间，在紫外线的激发下，发出红色荧光。EB-DNA复合物的荧光比游离在凝胶中EB的荧光强度大10倍。o溴乙锭在凝胶中浓度0.5微克/ml，可用于一般性核酸监测；但由于溴乙锭本身带正电，可中和核酸分子的负电荷，同时它的嵌入增加了核酸分子的刚性，使迁移率减慢，故不宜用于核酸分子量的测定。利用凝胶电泳测定DNA含量时，也不适合在凝胶中

22、直接加入溴乙锭，因为EB带负电，会向负极移动，导致染色不均，可采用浸泡染色。SYBR Green I olSYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。SYBR Green I 的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。 （四）离子强度o缓冲液的组成及离子强度影响DNA的电泳迁移率。oTAE：Tris醋酸，价格低缓冲能力小，需经常更新；oTBE：Tris硼酸，推荐使用；oTPE：Tris磷酸，磷酸盐浓度高，容易干扰后续试验。（五）指示剂o电泳

23、指示剂：使用有颜色的标记物指示样品的迁移过程o溴酚兰：近似于自由电离，0.6%（1kb），1%（0.6kb），2%（0.15kb）o二甲苯青：携带的电荷比溴酚兰少，迁移率比溴酚兰慢（4kb）。o加样缓冲液（loading buffer）：蔗糖、聚蔗糖或甘油等。DNA is separated by gel electrophoresislargemoderate smallDNA can be visualized by staining the gel with fluorescent dyes, such as ethidium bromide (EB 溴化乙锭溴化乙锭)（六）琼脂糖凝胶电

24、泳（六）琼脂糖凝胶电泳o基本过程：基本过程： 制胶制胶 加样加样 电泳电泳 观察观察o注意：溴化乙锭具有致癌性，操作时要带手套注意：溴化乙锭具有致癌性，操作时要带手套主要试剂：主要试剂： 琼脂糖琼脂糖 电泳缓冲液：电泳缓冲液：TBE(Tris、硼酸、硼酸、EDTA) 上样缓冲液：溴酚蓝、二甲苯青、蔗糖上样缓冲液：溴酚蓝、二甲苯青、蔗糖 染色剂：溴化乙锭染色剂：溴化乙锭称量：称量：选择琼脂糖种类、确定浓度选择琼脂糖种类、确定浓度(根据核酸分大小根据核酸分大小)；琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶浓度浓度(%) 分离分离DNA的有效范围的有效范围(Kb)0.35600.61200.70.8100.90.571.

25、20.461.50.232.00.12 琼脂糖凝胶浓度与分离琼脂糖凝胶浓度与分离DNA的有效范围的有效范围加缓冲液加缓冲液加热：加热：90度左右度左右制胶制胶灌胶，插入灌胶，插入梳子（冷却梳子（冷却40-45度后凝度后凝固固 ）；）；拔出梳子，拔出梳子，加入电泳缓冲加入电泳缓冲液；液；将凝胶置于将凝胶置于电泳槽中电泳槽中上样：样品与上样缓冲液混合，加入胶孔中；上样：样品与上样缓冲液混合，加入胶孔中；接通电源，进行电泳；接通电源，进行电泳；染色：染色：溴化乙锭：一种荧光染料，溴化乙锭：一种荧光染料， 和双链和双链DNA结结 合后，在紫外合后，在紫外 光照射下发橙光照射下发橙 黄色荧光；黄色荧光；

26、 溴化乙锭溴化乙锭(ethidium bromide )染色方式染色方式 o溴化乙锭-DNA复合物的荧光产率；可以检测到少至10ng的DNA条带。o将EB加入到凝胶中； o电泳时不加入EB，电用完后浸泡于EB溶液中。o由于在该染料存在的情况下，线状DNA的电泳迁移率约降低15%，因此，当需要知道DNA片段的准确大小（如DNA限制酶酶切图谱的鉴定）时，凝胶应该在无EB情况下电泳，电泳结束后用EB染色。 关于关于EB的安全性的安全性o溴化乙锭可以嵌入碱基分子中，导致错配。但是溴化乙锭并不能进入通过皮肤进入细胞内。所以说溴化乙锭相对其他的致癌物质还是比较安全的 o目前还没有任何证据能证明直接接触EB

27、（溴化乙锭）能对任何动物有毒害性。所以说，EB并没有人们想象的那么可怕 关于关于EB的净化处理的净化处理o由于溴化乙锭具有一定的毒性，实验结束后，应对含EB的溶液进行净化处理再行弃置，以避免污染环境和危害人体健康 o将EB溶液用水稀释至浓度低于0.5mg/ml ；加入一倍体积的0.5mol/L KMnO4，混匀，再加入等量的2.5mol/L HCl，混匀，置室温数小时 ；加入一倍体积的2.5mol/L NaOH，混匀并废弃 。检测：检测：紫外透射仪紫外透射仪GIS2000型凝胶成像系统型凝胶成像系统 凝胶电泳的应用凝胶电泳的应用核酸分子量的检测核酸分子量的检测鉴别分子量相同而构型不同的鉴别分子

28、量相同而构型不同的DNA分子分子RNARNA样品质量的检测样品质量的检测28SrRNA28SrRNA18SrRNA18SrRNA聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide gel electrophoresis 。PAGE ） PAGE是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。 这种介质既具有分子筛效应，有具有静电效应，分辨率高于琼脂糖凝胶电泳，适用于分离低分子量蛋白质、寡聚核苷酸及DNA测序。 凝胶的制备凝胶的制备 丙烯酰胺丙烯酰胺（Acr）单体在催化剂TEMED和过过硫酸铵（硫酸

29、铵（AP）的存在下，丙烯酰胺产生聚合反应，形成长链，加入交联剂Bis，长链形成凝胶。从而形成三维网状结构。垂直电泳系统聚丙烯凝胶电泳的银染结果分析第三节 质粒DNA的提取与纯化o主要步骤主要步骤： 细菌培养； 细菌的裂解； 质粒DNA的分离纯化o方法概况方法概况： 碱裂解法 煮沸裂解法 培养细菌和扩增质粒培养细菌和扩增质粒 培养条件培养条件：3737，液体培养，液体培养基中，基中，150-250r/min150-250r/min的摇床旋转的摇床旋转的条件下培养细菌；的条件下培养细菌； 为增加质粒拷贝数可加入氯为增加质粒拷贝数可加入氯霉素；霉素； 生长情况生长情况： 大肠杆菌每大肠杆菌每20mi

30、n20min分裂分裂1 1次，直次，直到最大密度。到最大密度。 收获细菌和溶菌收获细菌和溶菌收获细菌： 离心收集细菌细胞沉淀 ，弃上清培养液。 3、溶菌：破坏细胞壁和细胞膜、溶菌：破坏细胞壁和细胞膜 机械法：超声波、捣碎机、匀浆器等；1.溶菌酶：破坏细胞壁溶菌酶：破坏细胞壁溶菌酶-化学试剂联合法：3.3.去污剂：去污剂：SDS(SDS(十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠) )； Triton X-100Triton X-100（曲拉通曲拉通X-100）等等 作用：溶解细胞膜。作用：溶解细胞膜。 2.EDTA(2.EDTA(乙二胺四乙酸盐乙二胺四乙酸盐) )：螯合：螯合CaCa2+2+( (维持细胞壁

31、必需维持细胞壁必需) )4 4、提取质粒、提取质粒: :去除染色体去除染色体DNADNAo利用ccc质粒DNA与染色体DNA在结构上的差异，在强碱性条件下使细胞破裂、染色体DNA及蛋白质变性，然后离心沉淀，取上清ccc质粒DNA，进一步纯化处理。碱裂解法o原理：利用ccc质粒DNA与染色体DNA在结构上的差异，在强碱性条件下使细胞破裂、染色体DNA及蛋白质变性，然后离心沉淀，取上清ccc质粒DNA，进一步纯化处理。 碱裂解法原理 pH12pH12（NaOHNaOH和和SDSSDS）染色体染色体DNADNA片段变性解链；片段变性解链；质粒质粒DNADNA部分解链部分解链将将pHpH调回中性调回中

32、性( (乙酸钾乙酸钾) )变性的染色体变性的染色体DNADNA片段相互缠绕，且与蛋白质结合片段相互缠绕，且与蛋白质结合沉淀；质粒沉淀；质粒DNADNA恢复天然状态。恢复天然状态。离心离心 上清液：质粒上清液：质粒DNADNA； 沉沉 淀：染色体淀：染色体DNADNA和蛋白质；和蛋白质；主要试剂组分1组分2液25 mM Tris-HCl （pH 8.0）10 mM EDTA（pH 8.0 ） 液0.2 M NaOH1% SDS 液3 M KAc （pH 4.2）RNase A10 g/ml RNase A洗脱液 EB10 mM Tris-HCl （pH 8.0） 1 mM EDTA （pH 8.

33、0 ）质粒DNA提取实验流程对数期菌体对数期菌体溶液溶液IIIIII中和中和溶液溶液I I充分重悬充分重悬溶液溶液IIII裂解裂解 上清液上清液 过柱过柱干燥溶解干燥溶解离心洗涤离心洗涤质粒质粒DNADNA溶液溶液离心详细实验步骤请参考说明书！详细实验步骤请参考说明书！步骤o在强碱性条件下（PH12.0-12.6），用SDS破坏细胞壁，裂解细胞，并使细胞的蛋白质和DNA发生变性，释放出质粒DNA；o加入乙酸钾缓冲溶液，小分子cccDNA可迅速复性变成天然、可溶状态；细胞壁及膜的碎片与变性的蛋白质和染色体DNA形成大的复合物，再高盐条件下可有效沉淀。o离心分离，质粒DNA保留在上清液中。o用冷无

34、水乙醇沉淀上清液中的质粒DNA，再用70%的乙醇洗涤。o碱溶液也可以破坏质粒DNA的碱基配对，但cccDNA因残绕紧密而不易解链，只要不在碱性条件下变性太久，当PH调至中性时，cccDNA就可以重新恢复天然的超螺旋。o精分离：LiCl沉淀法或PEG沉淀法。在LiCl存在下，大部分蛋白质和RNA可形成沉淀，离心除去，而质粒DNA则不沉淀，进一步用RNase去除残存的RNA，随后在PEG条件下沉淀cccDNA，而核苷酸不沉淀。o重新溶解，酚抽提。质粒DNA提取电泳检测p琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖凝胶电泳检测质粒质粒DNADNA的三种带型：的三种带型：1.1.共价闭合环状共价闭合环状DNADNA分子：

35、质粒分子：质粒双链没有断裂；超螺旋结构；泳双链没有断裂；超螺旋结构；泳动速度动速度最快最快；2.2.半开环半开环质粒质粒DNADNA分子：质粒的分子：质粒的一条链断裂；松弛的环状分子；一条链断裂；松弛的环状分子；泳动速度泳动速度最慢最慢；3.3.线性线性DNADNA分子：质粒的两条链分子：质粒的两条链均断裂；泳动速度均断裂；泳动速度居中居中。煮沸裂解法煮沸裂解法1、原理原理： TritonX-100+溶菌酶破坏细胞结构，加热煮沸使蛋白质、宿主染色体DNA变性。cccDNA因结构紧密不会解链，当温度下降后，可重新恢复其天然超螺旋结构，通过离心去除变性的蛋白质和染色体DNA，然后回收上清液中的质粒

36、DNA。2、方法使用范围方法使用范围：该法是一种条件比较剧烈的方法，只能用于小质粒DNA的制备。由于糖类很难去除，而且会抑制限制性内切酶和聚合酶的活性，故该法不适用于产生大量糖类的菌株。煮沸裂解法加热：使蛋白质和染色体DNA变性降温：质粒DNA复性，染色体DNA不能复性SDS裂解法 oSDS裂解法是将细菌悬浮于等渗的蔗糖溶液中，用溶菌酶和EDTA处理以破坏细胞壁，再用SDS裂解去壁细胞，从而温和地释放质粒到等渗液中;o然后用酚氯仿抽提，乙醇沉淀、洗涤DNA。质粒DNA的纯化o进一步去除质粒DNA中的蛋白质、线状DNA及RNA等。oCsCl-EB法法：离心介质CsCl形成一联系连续的密度梯度，在

37、过量EB存在的条件下，各种不同密度的物质经离心平衡后得以分开。oProtein:1.3-1.4g/ml,浮于液面；oRNA: 2.0g/ml,沉于管底；oDNA：1.5-1.7g/ml,位于管的中部； 氯化铯密度梯度离心氯化铯密度梯度离心不同种类的DNA密度均接近1.7g/ml，不易区分RNA: 2.0g/ml,沉于管底；溴化乙锭（EB）：降低线形DNA的密度cccDNA为超螺旋结构，EB不易参入而结合少，密度下降少，约为1.59g/ml染色体DNA、开环质粒DNA及带切口的环状DNA可以参入较多的EB，因而密度下降较多，约为1.54 g/ml，从而能与闭环质粒DNA分开经EB处理后，不同种类

38、的DNA与EB的结合能力不一致，因而密度下降不一致，进而有效分开回收的闭环质粒DNA含有参入的EB，可采用有机溶剂抽提或离子交换层析加以分离质粒DNA的纯化oLiCl沉淀法或沉淀法或PEG沉淀法沉淀法 在LiCl存在下，大部分蛋白质和RNA可形成沉淀，离心除去，而质粒DNA则不沉淀，进一步用RNase去除残存的RNA，随后在PEG条件下沉淀cccDNA，而核苷酸不沉淀。o重新溶解，酚抽提。质粒DNA提取常见问题p RNA残留p 质粒断裂p 量少质粒DNA提取常见问题分析p RNA残留 忘记加RNase A？ I液中RNase A失效？ 酶量不够？质粒DNA提取常见问题分析p 质粒断裂 II 液

39、裂解时间过长？ NaOH-SDS 裂解时动作过于剧烈？质粒DNA提取常见问题分析p 量少凝胶是否有问题？菌体量少菌体重悬不彻底裂解不完全菌株老化严谨型质粒第四节 真核细胞RNA的分离纯化oNorthern杂交等许多分子生物学实验均是以RNA为材料，RNA的数量、纯度与完整性将直接影响这些实验的结果。oRNA中rRNA的数量最多，占总量的80%85%；tRNA及核内小分子RNA占15%20%；mRNA仅占1%5%。o目前对RNA的分离与纯化，主要集中在总RNA与mRNA上。一、防止一、防止RNase对对RNA 的水解的水解o一要全力避免细胞外RNase的污染并抑制其活性。o二要尽快地抑制细胞内R

40、Nase的活性并极力地去除RNase。o对广泛存在的细胞外RNase，应在RNA制备的全过程中保持高度的警惕，并采取严格的措施以避免其污染和抑制其活性。创造一个无创造一个无RNase的环境的环境oRNase分布广泛，包括细胞内，环境、试剂、器皿、人体的汗液、唾液oRNase异常稳定，耐热、酸、碱，蛋白质变性剂仅能使其暂时失活，去除变性剂又恢复活性oRNase不需要辅助因子，EDTA对其活性无影响。防止防止RNase对对RNA 的水解的水解pRNase的来源样品试剂多次使用的器具裸露的手说话产生的唾沫空气RNase非常稳定，它非常稳定，它在一些极端的条件可在一些极端的条件可以暂时失活，但限制以暂

41、时失活，但限制因素去除后有迅速复因素去除后有迅速复性。用常规的高温高性。用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能使白抑制剂都不能使RNase完全失活。完全失活。RNase是导致RNA降解的最主要物质！去除外源性外源性RNase污染p玻璃器皿处理： 量筒、试剂瓶等玻璃器皿须260烘烤2小时以上。p塑料器皿处理： 0.1%DEPC水溶液浸泡过夜，再高温高压灭菌。p试剂处理： 氯仿、异丙醇、无水乙醇新开后RNA专用。专用的RNA操作室、专用器械。p操作时戴口罩、手套、帽子、穿实验服。避免内源避免内源RNase污染污染 细胞破裂的同时，RNase释放出来，这种内源性的RNase

42、是降解RNA的主要危险之一； 原则上要尽可能早地去除细胞内的蛋白质，加入RNA酶抑制剂。 不同组织细胞的RNase含量不等，胰、脾中最丰富。RNase 变性剂（联合使用）变性剂（联合使用）oRNase阻抑蛋白（阻抑蛋白（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取出来的酸性糖蛋白质，是RNase的非竞争性抑制剂。oDEPC（二乙基焦碳酸盐）（二乙基焦碳酸盐）：很强的核酸酶变性剂，与肝素联合使用具有极强的RNase抑制效果。o酚、氯仿酚、氯仿不但能使核蛋白质与核酸解聚而且可以利用其对蛋白质的变性作用抑制RNase的活力。o解偶剂（胍类）解偶剂（胍类）：盐酸胍、异硫氰酸胍是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解

43、蛋白质，并使蛋白质二级结构消失，细胞结构降解，核蛋白迅速于核酸分离，故又称解偶剂。 在变性剂中加入-巯基乙醇，巯基乙醇，DTT等还原剂可以还原RNase中的二硫键，有利于RNase的变性、水解与灭活。二、酸性异硫氰酸胍二、酸性异硫氰酸胍-酚酚-氯仿一步法分离总氯仿一步法分离总RNAo1、原理：o用含异硫氰酸胍、-巯基乙醇和十二烷基肌氨酸钠的强变性溶液裂解细胞，使RNA与蛋白质分离并进入溶液；oRNase被异硫氰酸胍、-巯基乙醇变性灭活；o在PH4.0的条件下抽提细胞裂解溶液，在酸性条件下，DNA是不溶性的，而RNA是可溶性的，DNA会随蛋白质一起除去，而RNA仍留在水相中；o最后通过异丙醇沉淀

44、与75%的乙醇洗涤而获得总RNA。匀浆组织匀浆组织4/4/细胞裂解液（异硫氰细胞裂解液（异硫氰酸胍、巯基乙醇、酸胍、巯基乙醇、SDSSDS等）等）苯酚苯酚/ /氯仿抽提氯仿抽提乙醇沉淀乙醇沉淀重新溶解重新溶解RNARNA (DEPC (DEPC水水) )提取流程提取流程取上层水相取上层水相离心离心三、总三、总RNA分离试剂盒（分离试剂盒（TRIzol） TRIzol是一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。其含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。 TRIzol在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，因此对纯化DNA及标准化RNA的生产十分有用

45、 。 TRIzol进口品牌当仁不让地选择Invitrogen公司，该公司的TRIzol市场占有率是最高的。现在国内也开发出很多同类产品，如天根公司的TRNzol，Vazyme生物的Isolater，广州捷倍斯的TRNsol等。真核细胞总真核细胞总RNA提取提取实验步骤实验步骤收集细胞收集细胞上层溶液上层溶液 离心洗涤离心洗涤裂解变性裂解变性异丙醇沉淀异丙醇沉淀 抽抽 提提RNARNA溶液溶液干燥溶解干燥溶解详细实验步骤请参考说明书！详细实验步骤请参考说明书！ RNA电泳电泳（完整性检测）（完整性检测）o基本过程同DNA电泳一样o必须用对RNA酶有抑制作用DEPC水来配置所有溶液，所有与RNA接

46、触的仪器和装置都要严格处理以尽量减少RNase对样品的降解。oRNA分子有二、三级结构可以影响其电泳结果，因此电泳时应在变性剂存在下进行，常用的变性剂为甲醛和戊二醛。四、四、RNA提取常见问题提取常见问题p RNA降解p DNA残留p OD260 /OD280 比值偏低p 电泳带型异常RNA提取常见问题分析p RNA降解外源RNase的污染裂解液质量裂解液用量不足样品本身富含RNase环境温度过高28S18S5SRNA提取常见问题分析p DNA残留样本量过多吸取到中间层及下层试剂解决办法： DNA酶（RNase free）消化，再抽提纯化处理。RNA提取常见问题分析p OD260 /OD280

47、 比值偏低蛋白污染/苯酚残留 加入氯仿后彻底混匀，并且离心分层的离心力 和时间要足够。 不要吸入中间层及有机相，宁愿多损失些上清。 减少起始样品量，确保裂解完全、彻底。 解决办法:重新抽提一次，再沉淀、溶解。RNA提取常见问题分析p 电泳带型异常上样量超过 3g 电压超过 8V/cm 电泳缓冲液陈旧 均可能导致 28S 和 18S 条带分不开五、五、mRNA的分离纯化的分离纯化o 除血红蛋白及组蛋白的mRNA外，绝大多数mRNA在其3末端带有长短不同的poly(A)尾巴，依据其结构特征，利用碱基配对原则，通过oligo(dT)-纤维素或poly(U)-琼脂糖凝胶的亲和层析，可以很容易地从总RN

48、A中分离到mRNA。oOligo（dT）纤维素柱层析法：以Oligo（dT）修饰的纤维素填充层析柱，加入总RNA提取物，其中mRNA在高盐条件下借助poly(A)尾巴与oligo(dT)互补配对形成杂交体，洗去未结合的其他RNA，然后以低盐缓冲液洗脱并回收杂交RNA。oOligo（dT）纤维素柱离心法：原理同上，但速度加快。oOligo（dT）纤维素液相结合离心法：不用填柱，直接加入，混合后吸附，离心收集分离，洗脱。mRNAmRNA的提取的提取Oligo(dTOligo(dT)-)-柱层析法柱层析法原理：真核原理：真核mRNA3mRNA3端具有端具有poly(Apoly(A) ) 利用具有利用具有Oligo(dTOligo(dT)-)-层析层析 柱分离；柱分离；2013.3.29