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1、利用利用转录组学和蛋白组学技术转录组学和蛋白组学技术研究研究乳酸菌乳酸菌胁迫胁迫条件下自身应答机制条件下自身应答机制 食品微生物专题食品微生物专题u 转录转录组（组（transcriptometranscriptome）：广义）：广义上指某一生理条件下，上指某一生理条件下，细胞内所有转录产物的集合，包括信使细胞内所有转录产物的集合，包括信使RNARNA、核糖体、核糖体RNARNA、转运转运RNARNA及非编码及非编码RNARNA；狭义上指所有；狭义上指所有mRNAmRNA的的集合。集合。1 1、转录组学测序技术介绍、转录组学测序技术介绍u基因组（基因组（genomegenome）：指的是细胞或
2、生物体中所有）：指的是细胞或生物体中所有的的DNADNA，包括所有的基因和基因间隔区。，包括所有的基因和基因间隔区。 v 转录组具有时空特转录组具有时空特异性异性 From Sanger to Next Generation Sequencing 2 2、蛋白组学技术的介绍、蛋白组学技术的介绍 u蛋白质组蛋白质组(Proteome)(Proteome)：指由一个基因组或一个细胞、指由一个基因组或一个细胞、组织表达的所有蛋白质。组织表达的所有蛋白质。 蛋白质双向电泳技术蛋白质双向电泳技术(2D -Gel)(2D -Gel) 荧光差异凝胶电泳技术（荧光差异凝胶电泳技术（2D-DIGE2D-DIGE
3、） iTRAQiTRAQ技术技术蛋白质双向电泳技术：蛋白质双向电泳技术：是是等电聚焦电泳等电聚焦电泳和和SDS-PAGESDS-PAGE的组合，即的组合，即先进行等电聚焦电泳（按照先进行等电聚焦电泳（按照pIpI分离），然后在垂直的方向再进分离），然后在垂直的方向再进行行SDS-PAGESDS-PAGE（按照分子大小），经染色得到的电泳图是个二维（按照分子大小），经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。分布的蛋白质图。优点：优点： 双向电泳技术具有很好双向电泳技术具有很好的分辨率和灵敏度，可以同时的分辨率和灵敏度，可以同时显示组织或细胞内各种蛋白，显示组织或细胞内各种蛋白，高分辨率确保蛋白质
4、最大程度高分辨率确保蛋白质最大程度的分离。的分离。缺点：缺点：重复性是很不理想。高重复性是很不理想。高重复性有利于凝胶间的对比。重复性有利于凝胶间的对比。 荧光差异凝胶电泳技术（荧光差异凝胶电泳技术（2D-DIGE2D-DIGE）采用专有的荧光染料与多重样本和图象分析的方法，在采用专有的荧光染料与多重样本和图象分析的方法，在同一块胶上可同时分离多个由同一块胶上可同时分离多个由不同荧光标记的样品。不同荧光标记的样品。 iTRAQiTRAQ技术技术When challenged with bile, bacteria are known to modify their cell envelope
5、properties such as cell membrane fatty acid composition, peptidoglycan composition and membrane charge . Exposure to bile is a serious challenge to the viability of probiotics because the concentration of bile acids in the human small intestine typically varies between 0.2 and 2%Bile stress can also
6、 cause deleterious effects, including protein misfolding anddenaturation, DNA damage, secondary structure formation in RNA, and intracellular acidification .14 and 22 spots were significantly overexpressed at the 0.6g/L and 1.2g/L bile salts.Only 4 spots were significantly down-regulated at the both
7、 concentrations. 3 spots were only detected only when bile salts were added to the medium.(1)Ox bile extract promotes induction of general stress response proteins the maturation of newly synthesized proteins, refolding and degradation of denatured proteins and DNA repairs, such as GroEL and DnaK（2）
8、Several enzymes involved in carbohydrate catabolism, includingthe key enzyme of the so-called bifidobacterial shunt, are overexpressed in cells grown in the presence of bile salts（4）Regulation by bile salts of proteins involved in transcription, translation, and metabolism of amino acids and nucleot
9、ides.（3）生理指标的检测：）生理指标的检测： End metabolic products （lactate, acetate and formate）and F6PPK were detected.利用利用2-D gel 2-D gel 结合实时定量进行研究，创新点是推测出丙酮酸的结合实时定量进行研究，创新点是推测出丙酮酸的代谢流向饱和脂肪酸，从而增强了膜的代谢流向饱和脂肪酸，从而增强了膜的rigidity and impermeability.rigidity and impermeability.转录组：基因芯片技术转录组：基因芯片技术 蛋白质组：蛋白质组：2D-DIGE2D-DI
10、GE技技术术在在0.2%0.2%的的 oxgaloxgal中培养，中培养，316316基因，基因，4242个蛋白质发生显著变个蛋白质发生显著变化。化。2011： Results and Discussion（1）GG Alter cell surface properties and expression multiple ABC-type multidrug transporter in response to bile.（2）Two-component regulatory systems and bile salt hydrolase modulate cellular response
11、 to bile（3） Bile induces common stress response in GG. （4） Bile affects central metabolic processes典型文章典型文章实验手段：实验手段：DNA 芯片和实时定量芯片和实时定量PCR。推测结果：推测结果：通过转录组发现通过转录组发现Genes encodingthree transport systems belonging to the major facilitator superfamily (MFS), Bbr_0838, Bbr_0832, and Bbr_1756, and threeAB
12、C-type transporters, Bbr_0406-0407, Bbr_1804-1805, and Bbr_1826-1827在胆盐胁迫下表达水平发生显著变化，推测可能参与胆盐胁迫。在胆盐胁迫下表达水平发生显著变化，推测可能参与胆盐胁迫。创新点：创新点：利用胆盐缺陷型的利用胆盐缺陷型的L. lactis NZ9000 lmrCD 作为宿主，通过异源表作为宿主，通过异源表达证明其参与胆盐抗性。达证明其参与胆盐抗性。u问题：问题：酸奶对人体具有重要的益生保健功能，但是后酸酸奶对人体具有重要的益生保健功能，但是后酸化是制约酸奶行业发展的主要问题化是制约酸奶行业发展的主要问题。u原因：原因：
13、当当pHpH值从值从6.56.5下降到下降到 5.5 5.5时，嗜热链球菌的生长逐时，嗜热链球菌的生长逐渐减慢，渐减慢，pHpH值下降到值下降到5.05.0后，保加利亚乳杆菌控制了酸奶后，保加利亚乳杆菌控制了酸奶的发酵（郭清泉等，的发酵（郭清泉等，20012001）。）。 立题的背景立题的背景u 后酸化：后酸化：酸奶在正常发酵结束后的贮存、运输和销酸奶在正常发酵结束后的贮存、运输和销售过程中，发酵微生物的继续生长会导致产品售过程中，发酵微生物的继续生长会导致产品pHpH值持值持续降低，进而发生后酸化现象（徐成勇等，续降低，进而发生后酸化现象（徐成勇等，20062006） 乳酸菌酸耐受机制的研究
14、进展乳酸菌酸耐受机制的研究进展1.质子泵质子泵F0F1-ATPase （Arikado et al., 1999）2.谷氨酸脱羧酶途径谷氨酸脱羧酶途径GAD （Sanders et al., 1998）3.精氨酸脱氨酶途径精氨酸脱氨酶途径ADI （Curran et al., 1995; De Angelis et al., 2002）4.应激蛋白和分子伴侣蛋白应激蛋白和分子伴侣蛋白（Hartke et al., 1996； Cox et al., 2000 ）5.改变细胞膜的脂肪酸构成改变细胞膜的脂肪酸构成（Cotter and Hill, 2003）（ Cotter and Hill, 2
15、003 ）保加利亚乳杆菌的酸耐受机制的特殊性保加利亚乳杆菌的酸耐受机制的特殊性u对保加利亚乳杆菌全基因组序列的分析表明对保加利亚乳杆菌全基因组序列的分析表明, ,仅具仅具有有F F0 0F F1 1-ATPase-ATPase基因簇基因簇u缺失一些存在于其他乳酸菌中的缺失一些存在于其他乳酸菌中的pHpH调节相关的基因，调节相关的基因，如如ADIADI途径中的途径中的arcA,B,C, T ,D ,RarcA,B,C, T ,D ,R基因和基因和GADGAD途径中的途径中的gadC,BgadC,B基因（基因（van de Guchte et al., 2006van de Guchte et a
16、l., 2006） 保加利亚乳杆菌的酸适应机制研究情况保加利亚乳杆菌的酸适应机制研究情况1.1.利用蛋白组学技术研究保加利亚乳杆菌经低利用蛋白组学技术研究保加利亚乳杆菌经低pHpH诱导后诱导后的全蛋白表达情况的全蛋白表达情况如，如， Lim et al., 2000Lim et al., 2000； Fernandez et al., 2008Fernandez et al., 2008； Streit Streit et al., 2008et al., 20082.2.利用反转录和实时定量利用反转录和实时定量PCRPCR的方法，考察保加利亚乳杆的方法，考察保加利亚乳杆菌中酸耐受相关基因的转
17、录水平变化菌中酸耐受相关基因的转录水平变化如， Penaud et al., 2006中发现酸处理后铜离子转运蛋白CPX-Type ATPase的Ldb0660和Ldb1239基因大幅上调对于保加利亚乳杆菌感受环境压力并作出适应性调节这一对于保加利亚乳杆菌感受环境压力并作出适应性调节这一过程的分子调控机制缺少系统性的研究过程的分子调控机制缺少系统性的研究 2. 2. 研究目的及研究目的及意义意义本课题拟采用蛋白组学、本课题拟采用蛋白组学、RT-qPCRRT-qPCR、乳酸乳球菌表达系统、细菌、乳酸乳球菌表达系统、细菌单杂交和单杂交和EMSAEMSA等分子生物学技术，对酸胁迫反应中的关键基因等分
18、子生物学技术，对酸胁迫反应中的关键基因进行分离鉴定及功能研究。进行分离鉴定及功能研究。进一步揭示保加利亚乳杆菌酸耐受机制；进一步揭示保加利亚乳杆菌酸耐受机制；为制备弱后酸化的保加利亚乳杆菌奠定基础；为制备弱后酸化的保加利亚乳杆菌奠定基础；为开发具有自主知识产权的酸奶发酵剂提供理论依据。为开发具有自主知识产权的酸奶发酵剂提供理论依据。3. 3. 研究内容研究内容134蛋白组学方法分析保加利亚乳杆菌蛋白组学方法分析保加利亚乳杆菌应对酸胁迫过程中的差异表达蛋白应对酸胁迫过程中的差异表达蛋白细菌单杂交和细菌单杂交和EMSAEMSA实验分析抗酸胁实验分析抗酸胁迫中新转录因子迫中新转录因子Ldb0667L
19、db0667的功能的功能2RT-qPCRRT-qPCR分析差异基因转录水平的变分析差异基因转录水平的变化化提出保加利亚乳杆菌酸耐受模型提出保加利亚乳杆菌酸耐受模型4.4.研究结果研究结果Survival of L. bulgaricus CAUH1 after acid adaptation. Acid adapted (40 min at the indicated pH) and control (pH 6.5) samples were subjected to an acid challenge (60 min at pH 3.7). OD600 nm = 0.4pH 4.8, 40m
20、in -700倍倍确定酸胁迫处理条件：确定酸胁迫处理条件：致死处理条件：致死处理条件：pH 3.7, 60min蛋白质双向电泳蛋白质双向电泳蛋白质双向电泳蛋白质双向电泳处理组处理组对照组对照组47pI47pIMW10904020MW10904020平均每块胶得到平均每块胶得到644644个蛋白点，经个蛋白点，经Image Master 2D Platinum Image Master 2D Platinum softwaresoftware 分析，选取变化幅度大于分析，选取变化幅度大于1.51.5倍的蛋白点倍的蛋白点4141个进行质谱鉴定个进行质谱鉴定Results 通过通过MALDI-TOF
21、/TOF MALDI-TOF/TOF 二级质谱鉴定了二级质谱鉴定了2727个差异蛋白（个差异蛋白（1717个上调，个上调，1010个下调），利用个下调），利用NCBI BLASTNCBI BLAST、KEGGKEGG等数据库，确定其功能和等数据库，确定其功能和参与的代谢途径参与的代谢途径(i)(i)糖类代谢糖类代谢: : 10 proteins (GlcK, Eno, Pyk, GpmA, GpmB, 10 proteins (GlcK, Eno, Pyk, GpmA, GpmB, Gap, Ack, Gap, Ack, Gpd, Xfp and Pgl) Gpd, Xfp and Pgl)(
22、i)(i)核苷酸代谢核苷酸代谢: : 3 proteins (PyrG, Cmk and PurR)3 proteins (PyrG, Cmk and PurR)(ii)(ii)翻译过程翻译过程: : 7 proteins (Tuf, FusA, TypA, Der, RplM, 7 proteins (Tuf, FusA, TypA, Der, RplM, RpsS and RpsA) RpsS and RpsA) (iii)(iii)氨基酸代谢氨基酸代谢: : 2 proteins (PepO1 and PepN)2 proteins (PepO1 and PepN)(iv)(iv)胁迫反
23、应胁迫反应: :1 1 proteins (ClpC)proteins (ClpC)(v)(v)未知功能未知功能: : proteins (RnjA, proteins (RnjA, Ldb0677 Ldb0677 and PthA)and PthA)蛋白点质谱鉴定结果蛋白点质谱鉴定结果蛋白点质谱鉴定结果蛋白点质谱鉴定结果IDSpot no.Expression factor A/NAGeneProteinAccession no.2-DERT-qPCR糖酵解途径糖酵解途径K144561.823.14glcKGlucokinase（葡萄糖激酶）（葡萄糖激酶）YP_618316.1K226643
24、.7229.86Ldb1036Fructose-2,6-bisphosphatase（果糖（果糖-2,6-二磷酸酶）二磷酸酶） YP_619006.1M15596-1.85-14.42gapGlyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase（3-磷磷酸甘油醛脱氢酶）酸甘油醛脱氢酶）YP_618713.1M236141.8313.45enoEnolase （烯醇化酶）（烯醇化酶）YP_619161.1L111751.8610.78pykPyruvate kinase（丙酮酸激酶）（丙酮酸激酶）YP_618880.1K45801.595.10gpmAPhosphogl
25、ycerate mutase（磷酸甘油酸变位酶）（磷酸甘油酸变位酶）YP_618404.1L6304-1.61-22.32ackAcetate kinase（乙酸激酶）（乙酸激酶）YP_618754.1戊糖磷酸途径戊糖磷酸途径M12180-1.51-6.68gpdGAPDH （磷酸葡萄糖脱氢酶）（磷酸葡萄糖脱氢酶）YP_619397.1M2110-1.53-24.76Ldb0534phosphoketolase （磷酸酮醇酶）（磷酸酮醇酶）YP_618635.1K103821.704.92Ldb0588putative 3-carboxymuconate cyclaseYP_618678 蛋白
26、点质谱鉴定结果蛋白点质谱鉴定结果IDIDSpot Spot no.no.Expression Expression factor factor A/NAA/NAGeneGeneProteinProteinAccession Accession no.no.2-DE2-DERT-qPCRRT-qPCR伴侣蛋白伴侣蛋白L4L47 7-2.04-2.04-13.45-13.45clpCclpCATP-binding subunit ClpCATP-binding subunit ClpCgb|EGD26863.gb|EGD26863.1|1|核苷酸代谢核苷酸代谢K3K37575-1.48-1.48-
27、20.25-20.25pyrGpyrGCtp synthase Ctp synthase （CTPCTP合成酶）合成酶）YP_00403333YP_004033330.10.1M17M175435431.511.5123.4323.43Ldb0774Ldb0774Cytidylate kinase Cytidylate kinase （胞苷酸激酶）（胞苷酸激酶）YP_812822.1YP_812822.1L13L13554554-1.62-1.62-21.86-21.86purRpurRPur Pur operon operon repressor repressor （purpur操操纵纵子
28、子阻阻遏遏蛋蛋白）白）YP_812402.1YP_812402.1肽类降解肽类降解M2M264641.621.6218.9018.90pep01pep01Endopeptidase Endopeptidase （肽链内切酶）（肽链内切酶）YP_618394.1YP_618394.1M20M203273271.501.509.979.97pepNpepNAminopeptidase N Aminopeptidase N （氨肽酶（氨肽酶N N）YP_619704.1YP_619704.1转录转录- -翻译相关翻译相关K24K247477472.732.7323.7523.75tuftufPuta
29、tive elongation factor TuPutative elongation factor TuYP_618840.1YP_618840.1M1M13563561.881.885.665.66fusAfusAElongation factor GElongation factor GYP_618520.1YP_618520.1N17N175135131.471.47fusAfusAElongation factor GElongation factor GYP_618520.1YP_618520.1K9K9142142-1.74-1.74-13.55-13.55engAengAGT
30、P-binding protein EngAGTP-binding protein EngAYP_618891.1YP_618891.1K11K113203201.541.542.692.69typAtypAGTP-binding protein TypAGTP-binding protein TypAYP_618827.1YP_618827.1 蛋白点质谱鉴定结果蛋白点质谱鉴定结果IDSpot no.Expression factor A/NAGeneProteinAccession no.2-DERT-qPCR核糖体蛋白核糖体蛋白M13 7941.762.18rplM50S ribosom
31、al protein L13YP_812477.1K19533-1.52-10.93rpsA30S ribosomal protein S1YP_812823.1N38462.2711.88rpsS30S ribosomal protein S19YP_618526.1其他其他L588-2.10-22.63Ldb0760Ribonuclease J1YP_004033720.1L98242.0013.92Ldb0589PTS system, enzyme IIA componentYP_618679.1N12 4161.8410.41Ldb0677UPF0082 protein Ldb0677
32、YP_618747.1Ldb0677 属于属于YebC/DUF28/UPF0082 family ，可能具有转录因子，可能具有转录因子的作用的作用(Zhang et al., 2012)；Ldb0677同已知转录因子同已知转录因子PmpR相似度较高（相似度较高（51%的的AA相似度，相似度，保守位点保守位点Gly-2, His-3, Gly-93, Asp-164 and Val-184）；）；3. Ldb0667的异源表达验证其功能的异源表达验证其功能Ldb0667Ldb0667在在NZ900NZ900中的表达提高其抗酸能力中的表达提高其抗酸能力200200倍倍 4.细菌单杂交实验细菌单杂交实验TF binding site转录因子（转录因子（TF）融合表达载体）融合表达载体pB1H2w；携有携有TF binding site的的“诱饵诱饵”载体载体pH3U3；受体菌受体菌 E. coli US0： hisB pyrF rpoZ:ZeoSensing the external acid stress and rerouting of carbohydrate metabolic pathways during acid adaptation in L. bulgaricus CAUH1.
