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1、聚合酶链式反应聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction) 根据细胞分裂中根据细胞分裂中 DNA 半保留复制半保留复制机理，在体外快速扩增某一特定机理，在体外快速扩增某一特定 DNA 片段的方法。片段的方法。PCRPCR工作原理工作原理以要扩增的DNADNA分子为模板，以一对与模板55末端和33末端互补的寡核甘酸片段为引物4 4种脱氧核糖核甘酸存在的条件下依赖DNADNA聚合酶的酶促合成反应。 PCR PCR特异性特异性取决于取决于引物引物和模板和模板DNADNA结合特异性合特异性。 体外体外( (试管中管中) )扩增特异增特异DNADNA片段片段短短时间间内即可将所需
2、内即可将所需目的目的DNADNA片段片段扩增增至至100100万万倍以上倍以上PCRPCR技术特点 敏感度高、特异性强、产率高、 重复性好、操作简便、快速PCRPCR体系基本组成体系基本组成模板DNADNA： （10102-52-5）拷贝dNTPdNTP底物：2020020200umol/Lumol/L特异性引物： 0.10.5 0.10.5 umol/Lumol/LDNADNA聚合酶：Klenow T4 Klenow T4 、 T7 T7聚合酶 TaqDNATaqDNA聚合酶: :耐热稳定性、5-35-3聚合酶活性及3-53-5外切酶活性，可校正PCRPCR反应中某些单核甘酸的错配。含MgM
3、g2+2+的缓冲液： Mg Mg2+ 2+ 能影响反应特异性和扩增片段的产率，一般为1.52.01.52.0mmol/Lmmol/L，过量将增加非特异性条带的产生。循环次数取决于模板DNA的浓度30次扩增100万倍反应分反应分三步三步：1 变性 denaturationdenaturation： 加热90-9590-95，模板DNADNA双链解离形成单链DNADNA；2 2 退火 anneallingannealling： 温度突然降低, ,引物与模板DNADNA结合, , 40-6040-60, ,TmTm值 4 4（G+CG+C）+2+2（A+TA+T） -5. -5. 3 3 延伸 ex
4、tensionextension： TaqDNATaqDNA聚合酶以4 4dNTPdNTP为底物，在MgMg2+ 2+ 存在 的条件下，催化DNADNA合成。 70-7570-75时间-要扩增片段长度决定1. 长度：长度： 15 - 30 个核苷酸；个核苷酸；2. 避免嘌呤、嘧啶堆积，避免嘌呤、嘧啶堆积，GC ：40 - 60；引物设计的原则引物设计的原则Tm = 69.3 + 0.41 (G + C%)引物长度引物长度为为 18 - 24 个碱基个碱基：Tm ( C) 4 (GC) 2 (AT)5 ATGGCGGGCAGGTCAGAAAG 3 GC 12；AT 8Tm 4 X 12 2 X
5、8 64 C3. 四种碱基随机分布；四种碱基随机分布；4. 引物自身不应存在互补序列，以防引物自身不应存在互补序列，以防形成发夹结构；形成发夹结构；引物设计的原则引物设计的原则5GTTGACTTGATAT3GAACTCT5GTTGACTTGATATTCTCAAG3引物的自身互补序列形成引物的自身互补序列形成发夹结构发夹结构5ACCGGTAGCCACGAATTCGT33TGCTTAAGCACCGATGGCCA55ACCGGTAGCCACGAATTCGT3两个引物分子形成二聚体两个引物分子形成二聚体5. 引物之间不应存在互补序列，以防形成二聚体引物之间不应存在互补序列，以防形成二聚体 (dimer
6、)；引物设计软件：引物设计软件：Primer 3, Oligo引物设计的原则引物设计的原则6.引物引物3末端碱基原则上与模板配对，末端碱基原则上与模板配对，引物的引物的 5 端端可以游可以游离离,可添加限制性内切酶识别位点，便于可添加限制性内切酶识别位点，便于PCR 产物的定向产物的定向克隆。克隆。引物设计的原则引物设计的原则5 CATATG33TTCGAA 5NdeIHindIII待扩增片段：待扩增片段：1000 bp引物引物 Tm 55DNA 模板变性模板变性: 94, 5分钟分钟;PCR 循环循环 (30 次次):94, 30秒秒; 50, 30秒秒; 72, 1分钟分钟;最终延伸最终延
7、伸: 72, 7-10分钟分钟PCR 反应条件的设定反应条件的设定 PCRPCR产物的检测产物的检测琼脂糖凝胶电泳；（EBEB）分子杂交；限制性内切酶酶切分析；微孔板夹心杂交法；直接测序PCR 产物的检测产物的检测- 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳PCR 产物产物PCR 产物产物PCR 技术的应用技术的应用1. 基础研究基础研究(1) 基因或基因或 cDNA 克隆克隆：从基因数据库中获得某一基因或：从基因数据库中获得某一基因或 cDNA 的核的核 苷酸序列，用苷酸序列，用 PCR 方法扩增并克隆该基因或方法扩增并克隆该基因或 cDNA。(2) 基因表达：基因表达：用用 RT-PCR检测某一特定基
8、因在转录水平的表达检测某一特定基因在转录水平的表达。2. 医学医学(1) 感染性疾病感染性疾病病原体的诊断：病原体的诊断：HIV、结核分枝杆菌、乙肝病毒等。结核分枝杆菌、乙肝病毒等。(2) 遗传病相关基因遗传病相关基因的检测：镰刀型细胞贫血、血友病。的检测：镰刀型细胞贫血、血友病。(3) 恶性肿瘤的诊断恶性肿瘤的诊断3. 基因动、植物的检测基因动、植物的检测(1) 转基因动物的检测：检测某一基因的遗传稳定性。转基因动物的检测：检测某一基因的遗传稳定性。(2) 转基因植物的检测：玉米、大豆等。转基因植物的检测：玉米、大豆等。PCR新技术RT-PCRRT-PCR：用于RNARNA分析PCR-SSC
9、PPCR-SSCP：可用于点突变分析热启动PCRPCR：可提高特异性。不对称PCRPCR（asymmetric PCRasymmetric PCR）多重PCR(multiplex PCR) PCR(multiplex PCR) 巢式PCR(nested PCR)PCR(nested PCR)实时定量PCR(RealTimeQuantitativePCR,qRT-PCR)反转录反转录 PCR (RT-PCR) RT-PCR 将以将以 RNA 为模板的为模板的 cDNA 合成合成同同 PCR 结合结合在一起，提在一起，提供了一种供了一种分析基因表达分析基因表达的快速灵敏的的快速灵敏的方法。方法。5
10、3AAAAA535335533553RT-PCR 原理原理mRNA1st cDNA逆转录酶、逆转录酶、下游引物、下游引物、dNTPsTaq DNA聚合酶聚合酶、上游及下游引物、上游及下游引物、dNTPs5533特异特异 PCR 产物产物5533经经 30 个循环，产生个循环，产生 230 个分子拷贝个分子拷贝5533一步法一步法 RT-PCR RT 反应与反应与 PCR 反应在反应在同一个试管中进行。同一个试管中进行。两步法两步法 RT-PCR RT 反应与反应与 PCR 反应在反应在不同的试管中进行。不同的试管中进行。下游引物下游引物 特异性引物特异性引物 Oligo(dT) -actin
11、GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 18S rRNA用用作作内参内参的管家基因的管家基因实时实时荧光荧光定量定量PCRPCR技术技术 实现了PCRPCR从定性到定量的飞跃实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理指在PCRPCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCRPCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。特异性更强、 有效解决PCRPCR污染、 自动化程度高、 实时监测反应过程Ct Ct 值的定义值的定义在荧光定量PCRPCR技术中重要概念 CtCt值C C代表CycleCycle，t t代表
12、thresholdthreshold，CtCt值：每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历循环数CtCt值与起始模板的关系值与起始模板的关系每个模板CtCt值与该模板起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CtCt值越小。利用已知起始拷贝数标准品作标准曲线，横坐标起始拷贝数的对数，纵坐标代CtCt值。只要获得未知样品的CtCt值，即可从标准曲线上计算出该样品起始拷贝数。荧光定量PCR所使用的荧光化学荧光染料 SYBRGreenI荧光探针 TaqManTaqMan荧光探光探针 MoleculaeBeacons Scorpions TMScorpions TM探针 LightcyclerL
13、ightcyclerSYBRSYBR荧光染料荧光染料 在PCRPCR反应体系中，SYBRGreenI荧光染料特异性地掺入DNADNA双链后，发射荧光信号，光信号的增加与PCRPCR产物的增加完全同步。 对引物质量要求较高TaqMan荧光探针PCRPCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCRPCR扩增时，TaqTaq酶的5533外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNADNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCRPCR产物形成完全同步。R = Reporter (荧光报告染料荧光报告染料)Q = Quencher (淬灭物淬灭物)TaqMan 探针探针当当 TaqMan 探针完整时，探针完整时，荧光报告染料发射的荧荧光报告染料发射的荧光被淬灭物所淬灭。光被淬灭物所淬灭。在延伸反应中，在延伸反应中， 荧光报荧光报告染料被告染料被 DNA 聚合酶切聚合酶切除后与淬灭物分离，其除后与淬灭物分离，其荧光荧光信号被检测。信号被检测。
