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1、克隆及治疗性克隆克隆及治疗性克隆克隆与治疗性克隆克隆与治疗性克隆Clone一词来源于希腊文，原意是“扦插的枝条，及无性繁殖。1902年，德国植物学家Aberrant提出，植物的体细胞具有母体的全部遗传信息，并且能发育成为完整个体的能力。1903年，Webber将这一概念引入园艺学。至此，克隆这一概念逐渐被用于细胞生物学、动物学、医学等。克隆与治疗性克隆克隆与治疗性克隆第一节第一节克隆的概念克隆的概念一、克隆和治疗性克隆的一般概念一、克隆和治疗性克隆的一般概念克隆克隆(clone)指通过指通过无性方式无性方式由由单个单个细胞或个体产生细胞或个体产生的、和亲代非常相似的一的、和亲代非常相似的一群细
2、胞或生物体，在不发生突变的情况下，群细胞或生物体，在不发生突变的情况下，一个克隆内的所有员具有完全相同的遗传一个克隆内的所有员具有完全相同的遗传构成。构成。克隆与治疗性克隆克隆与治疗性克隆 克隆的概念强调两点：克隆的概念强调两点： 1 1、以无性的方式进行增殖或繁殖；、以无性的方式进行增殖或繁殖； 2 2、一个克隆中的每一成员其遗传构成完、一个克隆中的每一成员其遗传构成完全相同。全相同。 克隆与治疗性克隆克隆与治疗性克隆体细胞克隆：供体细胞核是体细胞的称为体细胞克隆。体细胞克隆：供体细胞核是体细胞的称为体细胞克隆。 体细胞克隆分为：体细胞克隆分为： 生殖性克隆或繁殖性克隆（生殖性克隆或繁殖性克
3、隆（reproductice reproductice cloningcloning） 治疗性克隆（治疗性克隆（therapeutic cloningtherapeutic cloning） 克隆与治疗性克隆克隆与治疗性克隆 生殖性克隆生殖性克隆是一种是一种“复制复制”动物个体动物个体的生物技术，是成体细胞核移植到去核的生物技术，是成体细胞核移植到去核卵母细胞中，或融合形成重组胚，使已卵母细胞中，或融合形成重组胚，使已分化的细胞核重新编程，再移植到代母分化的细胞核重新编程，再移植到代母或者供卵者子宫内发育成为新个体或者供卵者子宫内发育成为新个体。克隆与治疗性克隆克隆与治疗性克隆治疗性克隆治疗性
4、克隆则是将患者的体细胞核移入去核的则是将患者的体细胞核移入去核的卵细胞形成重构胚，经过一定处理，待发育至卵细胞形成重构胚，经过一定处理，待发育至囊胚（囊胚（14天以前），分离内细胞团，纯化，培天以前），分离内细胞团，纯化，培养、筛选、建立养、筛选、建立胚胎干细胞系胚胎干细胞系，定向诱导分化，定向诱导分化成为成为“预定预定”的细胞、组织器官；移植入病人的细胞、组织器官；移植入病人病变部位，或作为组织工程用的种子细胞，以病变部位，或作为组织工程用的种子细胞，以取代患者已丧失功能的细胞，修复或取代组织、取代患者已丧失功能的细胞，修复或取代组织、器官，达到治疗的目的。器官，达到治疗的目的。克隆与治疗性
5、克隆克隆与治疗性克隆治疗性克隆技术是体细胞克隆技术、治疗性克隆技术是体细胞克隆技术、胚胎干细胞技术和移植技术相结合的胚胎干细胞技术和移植技术相结合的一项新的生物技术。一项新的生物技术。克隆与治疗性克隆克隆与治疗性克隆克隆分为四个层次：克隆分为四个层次：分子克隆。分子克隆。细胞克隆细胞克隆组织器官克隆组织器官克隆个体克隆个体克隆植物克隆植物克隆动物克隆动物克隆克隆与治疗性克隆克隆与治疗性克隆指利用指利用DNA重组技术将特定基因或重组技术将特定基因或DNA序序列插入载体或列插入载体或PCR技术获得大量相同基因技术获得大量相同基因或或DNA序列的过程。序列的过程。分子克隆分子克隆克隆与治疗性克隆克隆
6、与治疗性克隆指一个祖先细胞经分裂，增殖而形成一群指一个祖先细胞经分裂，增殖而形成一群细胞（至少细胞（至少50个以上），这些细胞具有相个以上），这些细胞具有相同的遗传组成。亦称无性繁殖细胞系。同的遗传组成。亦称无性繁殖细胞系。细胞克隆细胞克隆克隆与治疗性克隆克隆与治疗性克隆二、克隆技术发展史二、克隆技术发展史克隆与治疗性克隆克隆与治疗性克隆（一）克隆技术的萌芽（一）克隆技术的萌芽先成论（先成论（TheoryofPriformationism）认为个体发生，其所应形成的形态构造于发生之始就预先存在，待认为个体发生，其所应形成的形态构造于发生之始就预先存在，待发育时则逐渐展开而形成明显的形态构造，这
7、种学说就是先成论。发育时则逐渐展开而形成明显的形态构造，这种学说就是先成论。为后成论的对应词。先成论的极端形式就是所谓生殖预成论。为后成论的对应词。先成论的极端形式就是所谓生殖预成论。从历史来看，在古希腊时代就已有先成论的思想；及至近代，特从历史来看，在古希腊时代就已有先成论的思想；及至近代，特别是由于显微镜的应用，对微小的形态结构得以掌握其轮廓，因而别是由于显微镜的应用，对微小的形态结构得以掌握其轮廓，因而成为有力的学说，成为有力的学说，17世纪和世纪和18世纪的著名生物学者马尔比基（世纪的著名生物学者马尔比基（MMalpighi）、勒文虎克（）、勒文虎克（ALeewenboek）、）、JS
8、wammerdam、CBonnet等对于这个学说曾有过不同的解释。等对于这个学说曾有过不同的解释。这种古典的先成论，随着显微镜的进一步发展，以及发生学研究这种古典的先成论，随着显微镜的进一步发展，以及发生学研究的进展的进展,不久就从根本上被推翻了。就现在的情况来看，对于发生不久就从根本上被推翻了。就现在的情况来看，对于发生因素问题，认为除遗传子组成以外，而没有任何其他东西，与古典因素问题，认为除遗传子组成以外，而没有任何其他东西，与古典的发生理论完全相同。的发生理论完全相同。克隆与治疗性克隆克隆与治疗性克隆（二）现代克隆技术的开端（二）现代克隆技术的开端克隆技术在现代生物学中被称为克隆技术在现
9、代生物学中被称为“生物放大技生物放大技术术”，它已经历了三个发展时期：，它已经历了三个发展时期：第一个时期是微生物克隆：第一个时期是微生物克隆：即用一个细菌很快复制即用一个细菌很快复制出成千上万个和它一模一样的细菌，而变成一个细出成千上万个和它一模一样的细菌，而变成一个细菌群；菌群；第二个时期是生物技术克隆：第二个时期是生物技术克隆：比如用遗传基因比如用遗传基因DNA克隆；克隆；第三个时期是动物克隆：第三个时期是动物克隆：即由一个细胞克隆成一个即由一个细胞克隆成一个动物。克隆绵羊动物。克隆绵羊“多利多利”由一头母羊的体细胞克隆由一头母羊的体细胞克隆而来，使用的便是动物克隆技术。而来，使用的便是
10、动物克隆技术。克隆与治疗性克隆克隆与治疗性克隆第二节第二节克隆及克隆及治疗性克隆技术路线治疗性克隆技术路线克隆与治疗性克隆克隆与治疗性克隆克隆动物克隆动物世界上第一只克隆哺乳动物世界上第一只克隆哺乳动物：19811981年，年，HoppeHoppe等发表文章，声称从早期胚胎细胞等发表文章，声称从早期胚胎细胞克隆出克隆出3 3只小鼠，当时对其结论学术界有只小鼠，当时对其结论学术界有争论。争论。19861986年，年，PratherPrather将早期牛胚胎细胞核移将早期牛胚胎细胞核移入到牛卵中，在绵羊输卵管中发育成囊入到牛卵中，在绵羊输卵管中发育成囊胚，再植入代孕母牛子宫，克隆小牛犊胚，再植入代
11、孕母牛子宫，克隆小牛犊出生。出生。以上实验所用供体细胞是早期胚胎，而以上实验所用供体细胞是早期胚胎，而不是分化细胞，或成体细胞。不是分化细胞，或成体细胞。克隆羊克隆羊Dolly克隆与治疗性克隆克隆与治疗性克隆克隆与治疗性克隆克隆与治疗性克隆克隆步骤：克隆步骤：a.取苏格兰黑脸母羊的未受精卵，去细取苏格兰黑脸母羊的未受精卵，去细胞核用作受体。胞核用作受体。b.取芬兰白脸母羊乳腺细胞取芬兰白脸母羊乳腺细胞,在培养基中在培养基中培养用作供体。培养用作供体。c.将供体细胞核移植到受体去核卵细胞将供体细胞核移植到受体去核卵细胞,放在放在培养器中，用电击法使其膜融合培养器中，用电击法使其膜融合.d.继续培
12、养继续培养6天后形成桑椹胚天后形成桑椹胚.e.将桑椹胚移入苏格兰黑脸母羊子宫将桑椹胚移入苏格兰黑脸母羊子宫.f.苏格兰黑脸母羊怀孕苏格兰黑脸母羊怀孕148天后产生白脸多莉天后产生白脸多莉.克隆与治疗性克隆克隆与治疗性克隆克隆与治疗性克隆克隆与治疗性克隆 在多莉羊诞生后，克隆技术取得了很大在多莉羊诞生后，克隆技术取得了很大的发展，美国夏威夷大学的科学家们于的发展，美国夏威夷大学的科学家们于19981998年年7 7月利用体细胞克隆技术克隆出卡姆月利用体细胞克隆技术克隆出卡姆莉娜鼠、莉娜鼠、50只，只，2000年年7月，相继克隆出猪、月，相继克隆出猪、猴、牛。猴、牛。克隆与治疗性克隆克隆与治疗性克
13、隆构建克隆胚原则和程序1、供体、供体（donordonor）细胞）细胞的条件：的条件：1）取取材材选选择择取取材材方方便便，受受外外界界条条件件（如如紫紫外外线线，化化学学物物质质等等）刺刺激激相相对对较较小小，细细胞胞活活力力相相对对较较高高的的细细胞胞作作核核供供体体；睾睾丸丸支支持持细细胞胞、神神经经细细胞胞、卵卵丘丘细细胞胞、尾尾尖尖成成纤纤维维细细胞胞、胎胎儿儿成成纤纤维维细细胞胞、成成熟熟B B细细胞胞和和T T细细胞胞等等均均可可作作供供体体细细胞。胞。2）年年龄龄年年龄龄越越小小越越好好。目目前前世世界界多多个个国国家家建建立立了了“细细胞胞银银行行”，收收集集、存存放放脐脐血
14、血干干细细胞胞及及个个人人早早期期干干细细胞胞，如如果果患患者者本本人人存存有有细细胞胞在在“银行银行”中，则可取之作为核供体。中，则可取之作为核供体。克隆与治疗性克隆克隆与治疗性克隆3 3）获得供体细胞方法）获得供体细胞方法 获取患者组织，获取患者组织，按常规机械方法、胰蛋白酶消化获得单按常规机械方法、胰蛋白酶消化获得单个细胞。个细胞。克隆与治疗性克隆克隆与治疗性克隆4 4）供体细胞培养）供体细胞培养：按常规方法培养，增殖。按常规方法培养，增殖。 在移植前使供核体细胞同步化于在移植前使供核体细胞同步化于G GO O/G1/G1期，期，以增加成功率。以增加成功率。克隆与治疗性克隆克隆与治疗性克
15、隆2. 2. 受体受体(recipient)(recipient)细胞细胞1 1）受受体体细细胞胞的的来来源源有有三三类类：去去核核卵卵细细胞胞、受受精精卵卵和和2-2-细细胞胞胚胚胎胎。其其中中以以卵卵细细胞胞作作为受体最多。为受体最多。克隆与治疗性克隆克隆与治疗性克隆2）受体卵细胞的准备：受体卵细胞的准备： 卵母细胞一般来源于医院或试管婴儿多余的卵母细胞一般来源于医院或试管婴儿多余的正常卵母细胞正常卵母细胞可用切除的卵巢中未成熟卵泡体外培养成熟。可用切除的卵巢中未成熟卵泡体外培养成熟。卵细胞的数量取决于通过体细胞核移植产生的卵细胞的数量取决于通过体细胞核移植产生的胚泡期胚胎的效率和从胚泡期
16、胚胎获得胚胎干胚泡期胚胎的效率和从胚泡期胚胎获得胚胎干细胞系的难易程度。细胞系的难易程度。 克隆与治疗性克隆克隆与治疗性克隆3 3）体细胞与去核）体细胞与去核, ,卵细胞融合技术或核移植卵细胞融合技术或核移植此方法与细胞核移植技术类似，所不同的是：此方法与细胞核移植技术类似，所不同的是：1、供体细胞不一定是核，可以是含部分细胞质、供体细胞不一定是核，可以是含部分细胞质的细胞核甚至可以是整个细胞。的细胞核甚至可以是整个细胞。2、不进行核移植，而是用细胞融合技术，使供、不进行核移植，而是用细胞融合技术，使供核细胞与去核卵细胞融合获重构胚。融合的方法核细胞与去核卵细胞融合获重构胚。融合的方法有电融合
17、、化学融合，病毒融合应用较少。有电融合、化学融合，病毒融合应用较少。克隆与治疗性克隆克隆与治疗性克隆4）将将病病人人体体细细胞胞核核直直接接转转入入去去核核的的已已分分离离并并稳稳定定传传代代的的ES细细胞胞，形形成成杂杂合合胚胚胎胎干干细细胞胞。目目前前这这种种方方法法由由于于存存在在技技术术及及伦伦理上的问题，实施起来有一定的难度。理上的问题，实施起来有一定的难度。克隆与治疗性克隆克隆与治疗性克隆5 5卵母细胞激活卵母细胞激活 在细胞融合或细胞核在细胞融合或细胞核移植后需激活卵母细胞。移植后需激活卵母细胞。克隆与治疗性克隆克隆与治疗性克隆二、重组胚培养和移植二、重组胚培养和移植重构胚的培养
18、有两种重构胚的培养有两种: :（一一）体体外外培培养养, ,即即在在适适当当的的条条件件下下培培养养到到桑桑椹椹胚胚或或囊囊胚胚; ;（二二）采采用用中中间间受受体体培培养养, ,在在核核质质融融合合后后, ,将将重重构构胚胚移移入入暂暂时时的的同同种种或或异异种种受受体体动动物物的的输输卵卵管管或或子子宫宫, ,几几天天后后收集桑椹胚或囊胚。收集桑椹胚或囊胚。 但是治疗性克隆不能将重构胚移入子宫。但是治疗性克隆不能将重构胚移入子宫。克隆与治疗性克隆克隆与治疗性克隆“同源克隆同源克隆”:从卵丘细胞中提取的从卵丘细胞中提取的DNA或细胞核或细胞核,注注入到同一位女性的无核卵细胞中去入到同一位女性
19、的无核卵细胞中去,并能发并能发育至胚泡期育至胚泡期,增殖近增殖近100个细胞。个细胞。克隆与治疗性克隆克隆与治疗性克隆三、克隆胚胎干细胞系的建立三、克隆胚胎干细胞系的建立1）分离）分离ICM细胞：用免疫外科法和机械分细胞：用免疫外科法和机械分离法从囊胚中分离离法从囊胚中分离ICM细胞。细胞。2 2）分离后的）分离后的ICMICM需要体外培养，筛选，建需要体外培养，筛选，建系。系。克隆与治疗性克隆克隆与治疗性克隆治疗性克隆策略中的关键问题治疗性克隆策略中的关键问题1.核移植重编程核移植重编程2.人胚胎干细胞的建系，扩增和分化人胚胎干细胞的建系，扩增和分化克隆与治疗性克隆克隆与治疗性克隆四、克隆四
20、、克隆ES细胞定向诱导分化及细胞定向诱导分化及基因修饰基因修饰克隆与治疗性克隆克隆与治疗性克隆克隆与治疗性克隆克隆与治疗性克隆注意：1 1避免肿瘤发生避免肿瘤发生2 2细胞存活细胞存活克隆与治疗性克隆克隆与治疗性克隆五、利用组织工程学的方法，把目五、利用组织工程学的方法，把目的细胞构建成患者的组织和器官并的细胞构建成患者的组织和器官并进行移植进行移植。克隆与治疗性克隆克隆与治疗性克隆克隆与治疗性克隆克隆与治疗性克隆第四节第四节 治疗性克隆的应用前景及存在治疗性克隆的应用前景及存在的问题的问题一、治疗性克隆潜在的应用前景一、治疗性克隆潜在的应用前景（一）神经系统疾病（一）神经系统疾病（二）心肌梗
21、塞（二）心肌梗塞（三）（三）I I型糖尿病型糖尿病（四）造血系统疾病（四）造血系统疾病克隆与治疗性克隆克隆与治疗性克隆第五节第五节治疗性克隆存在的问题治疗性克隆存在的问题克隆与治疗性克隆克隆与治疗性克隆一、克隆技术存在的理论和克隆技术不完善一、克隆技术存在的理论和克隆技术不完善问题问题:1、已已特特化化的的细细胞胞核核在在卵卵细细胞胞中中，基基因因如如何何编编程程而而成成为为全全能能性性？基基因因调调控控问问题题？重重构构胚胚中中基基因因突突变变及染色体畸变问题。及染色体畸变问题。克隆与治疗性克隆克隆与治疗性克隆外源供核在受体胞质的正确重新编程正确重新编程是决定克隆动物生长发育至正常个体的前提
22、条件,错误的重编程错误的重编程是导致克隆动物普遍存在生理缺陷的主要原因(Cezar等,2003;Tamashiro等,2002)。克隆与治疗性克隆克隆与治疗性克隆2 2、在胚胎干细胞发育分化过程中具有、在胚胎干细胞发育分化过程中具有极高的极高的非整倍体发生率非整倍体发生率，美国马萨诸塞州耶尼德研，美国马萨诸塞州耶尼德研究组研究发现，克隆动物的基因在构成没有究组研究发现，克隆动物的基因在构成没有缺陷的情况下，也不能像正常动物基因一样缺陷的情况下，也不能像正常动物基因一样准确表达出来，也就是说，克隆动物存在无准确表达出来，也就是说，克隆动物存在无法正确生长发育的危险。法正确生长发育的危险。克隆与治
23、疗性克隆克隆与治疗性克隆3、目前克隆技术无法保证安全性，、目前克隆技术无法保证安全性，4、体细胞克隆成功率很低，仅体细胞克隆成功率很低，仅1/277。主要表现在流产率高，发育异常，出生主要表现在流产率高，发育异常，出生后对环境适应性差，新生儿体重病理性后对环境适应性差，新生儿体重病理性增加。增加。克隆与治疗性克隆克隆与治疗性克隆5. 5. 体细胞克隆所需的卵细胞难以获得，体细胞克隆所需的卵细胞难以获得，成体干成体干细胞则可从患者自身获得，而不存在组织相容性细胞则可从患者自身获得，而不存在组织相容性的问题，治疗时可避免长期应用免疫抑制剂对患的问题，治疗时可避免长期应用免疫抑制剂对患者的伤害。此外
24、，少量的骨髓切除治疗有助于形者的伤害。此外，少量的骨髓切除治疗有助于形成部分造血嵌合，可使异体成体干细胞的治疗成成部分造血嵌合，可使异体成体干细胞的治疗成为可能为可能。克隆与治疗性克隆克隆与治疗性克隆6如何提高细胞核移植率，减少卵母细胞如何提高细胞核移植率，减少卵母细胞用量。用量。7异种卵可能存在以下问题：异种卵可能存在以下问题：1）重构胚中存在动物线粒体，使核基因组）重构胚中存在动物线粒体，使核基因组与线粒体基因组不相容；与线粒体基因组不相容；2）卵母细胞与供体核可能不相容；）卵母细胞与供体核可能不相容；3）人畜重构胚安全问题）人畜重构胚安全问题。克隆与治疗性克隆克隆与治疗性克隆8.胚胚胎胎
25、干干细细胞胞大大量量增增殖殖不不分分化化的的机机制制及及技术问题。技术问题。9.胚胚胎胎干干细细胞胞定定向向分分化化及及调调控控。ES细细胞胞是否能在成体器官中重建组织。是否能在成体器官中重建组织。10.ES细胞移植后肿瘤发生问题。细胞移植后肿瘤发生问题。克隆与治疗性克隆克隆与治疗性克隆二、治疗性克隆与伦理道德二、治疗性克隆与伦理道德1无性繁殖是一种低等的生殖方式无性繁殖是一种低等的生殖方式2. 2. 治疗性克隆治疗性克隆“格杀格杀”生命生命 3. 3. 动物卵代替人卵，有违伦理道德动物卵代替人卵，有违伦理道德4. 4. 治疗性克隆与克隆人（生殖性克隆）仅一步治疗性克隆与克隆人（生殖性克隆）仅一步之遥，如何控制有人借研究治疗性克隆之名，之遥，如何控制有人借研究治疗性克隆之名，进行克隆人的研究的问题。进行克隆人的研究的问题。克隆与治疗性克隆克隆与治疗性克隆
