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1、植物组织培养Plant tissue culture【实验目的】n n熟悉植物组织培养技术熟悉植物组织培养技术n n了解培养基的配置及原理了解培养基的配置及原理n n掌握无菌操作的原理及过程掌握无菌操作的原理及过程【实验原理】n n植物的组织和细胞培养是基于高等植物细胞具植物的组织和细胞培养是基于高等植物细胞具有全能性，在高等植物细胞分化过程中，他们有全能性，在高等植物细胞分化过程中，他们的遗传潜力并没有丧失，的遗传潜力并没有丧失，仍保持着潜在的全能仍保持着潜在的全能性。性。n n已分化成熟的活细胞已分化成熟的活细胞在一定的营养因素的作用在一定的营养因素的作用下下，有可能回复遗传全能性，类似合
2、子的发育，有可能回复遗传全能性，类似合子的发育功能，有单细胞发育成为胚状体，继而形成完功能，有单细胞发育成为胚状体，继而形成完整的植株。整的植株。【实验步骤】n1.MS培养基母液的配置培养基母液的配置n按照表按照表1配置配置MS培养基母液培养基母液培养基配制培养基配制培养基灭菌培养基灭菌材料消毒材料消毒接种接种培养观察培养观察愈伤组织分化愈伤组织分化愈伤组织培养基诱导实验培养基1.MS培养基的配制成分成分成分成分母液母液母液母液MSMS培养基培养基培养基培养基大量元素大量元素大量元素大量元素NHNH4 4NONO3 3KNOKNO3 3CaClCaCl2 2 H H2 2O OKHKH2 2P
3、OPO4 4MgSOMgSO4 4 7H7H2 2O O mg/L(100)mg/L(100)165000165000190000190000440004400017000170003700037000mg/Lmg/L1650165019001900440440170170370 370 【实验步骤实验步骤】微量元素微量元素微量元素微量元素mg/L(100)mg/L(100) mg/Lmg/LMnSOMnSO4 4 4H4H2 2O OZnSOZnSO4 4 4H4H2 2O OH H3 3BOBO3 3KIKINaNa2 2MoOMoO4 4 2H2H2 2O OCuSOCuSO4 4 5H
4、5H2 2O OCoClCoCl2 2 6H6H2 2O O 22302230860860620620838325252.52.52.5 2.5 22.322.38.68.66.26.20.830.830.250.250.0250.0250.025 0.025 【实验步骤实验步骤】铁盐铁盐NaNa2 2EDTAEDTAFeSOFeSO4 4 7H7H2 2O O mg/L(100)mg/L(100)372537252785 2785 mg/Lmg/L37.2537.2527.85 27.85 有机物有机物有机物有机物质质甘氨酸甘氨酸硫硫铵铵素素烟酸烟酸盐盐酸吡哆醇酸吡哆醇肌醇肌醇 mg/L(1
5、00)mg/L(100)20020040405050505010000 10000 mg/Lmg/L2.02.00.40.40.50.50.50.5100 100 【实验步骤实验步骤】2.MS固体培养基的配制 取取1000ml烧杯杯，分分别取取各各种种成成分分的的母母液液100ml，加加入入烧杯杯，称称取取蔗蔗糖糖30g，琼脂脂6.5g，按按照照需需要要的的浓度度分分别加加入入激激素素，加加水水至至800ml。加加热使使琼脂脂溶溶解解，定定容容至至1000ml，用用10NaOH调节pH至至5.8和和6.0。 加入激素加入激素:2,4-D 0.1mg/L【实验步骤实验步骤】培养基的灭菌 将配好的
6、培养基迅速分装至将配好的培养基迅速分装至50ml三角瓶中，用棉花塞好，用牛皮纸或三角瓶中，用棉花塞好，用牛皮纸或报纸包扎。放入灭菌锅报纸包扎。放入灭菌锅121，灭菌，灭菌20min。【实验步骤实验步骤】材料的脱毒 选取胡萝卜含形成层的部分选取胡萝卜含形成层的部分,横切厚度横切厚度约为约为2cm。用水洗净，用。用水洗净，用70酒精浸泡酒精浸泡15-30s，然后放入，然后放入5-7的次氯酸钠溶的次氯酸钠溶液浸泡液浸泡20min，进行材料脱毒，然后用无，进行材料脱毒，然后用无菌水冲洗多次。菌水冲洗多次。【实验步骤实验步骤】接 种 (1)(1)将初步洗涤及切割的材料放人烧杯，带入超净台上，将初步洗涤及
7、切割的材料放人烧杯，带入超净台上，用无菌水冲洗，最后沥去水分，取出放置在灭过菌用无菌水冲洗，最后沥去水分，取出放置在灭过菌的滤纸上。的滤纸上。(2)(2)材料吸干后，一手拿镊子，一手拿剪子或解剖刀，材料吸干后，一手拿镊子，一手拿剪子或解剖刀，对材料进行适当的切割。胡萝卜切成对材料进行适当的切割。胡萝卜切成1cm1cm见方的小见方的小块块( (含形成层含形成层) )；在接种过程中要经常灼烧接种器械，；在接种过程中要经常灼烧接种器械，防止交叉污染。防止交叉污染。(3)(3)用灼烧消毒过的器械将切割好的胡萝卜放置到培养用灼烧消毒过的器械将切割好的胡萝卜放置到培养基上。具体操作过程是：先解开包口纸，将
8、三角瓶基上。具体操作过程是：先解开包口纸，将三角瓶几乎水平拿着，使试管囗靠近酒精灯火焰，并将管几乎水平拿着，使试管囗靠近酒精灯火焰，并将管口在火焰上方转动，使瓶口里外灼烧数秒钟。然后口在火焰上方转动，使瓶口里外灼烧数秒钟。然后用镊子夹取一块切好的材料送入瓶内，轻轻帖到培用镊子夹取一块切好的材料送入瓶内，轻轻帖到培养基养基, ,以放以放1313块为宜。至于材料放置方法除茎尖、块为宜。至于材料放置方法除茎尖、茎段要正放茎段要正放( (尖端向上尖端向上) )外，其他尚无统一要求。接外，其他尚无统一要求。接完种后，将管口在火焰上再灼烧数秒钟。并用棉塞，完种后，将管口在火焰上再灼烧数秒钟。并用棉塞，塞好
9、后，包上包口纸，包囗纸里面也要过火。塞好后，包上包口纸，包囗纸里面也要过火。【实验步骤实验步骤】培 养 本实验将已接种好的培养瓶,在最适条件下培养 ,采取暗培养、25温度的条件 ，使之生长，分裂和分化形成愈伤组织或进一步分化成再生植株的过程。 【实验步骤实验步骤】【实验结果实验结果】【资料【注意事项】1 1、实验所使用的器材要严格灭菌，注意无菌操作，避免因、实验所使用的器材要严格灭菌，注意无菌操作，避免因、实验所使用的器材要严格灭菌，注意无菌操作，避免因、实验所使用的器材要严格灭菌，注意无菌操作，避免因染菌导致实验失败；染菌导致实验失败；染菌导致实验失败；染菌导致实验失败；2 2、配制贮存母液
10、时，要算好各种成分逐次加入，等第一种、配制贮存母液时，要算好各种成分逐次加入，等第一种、配制贮存母液时，要算好各种成分逐次加入，等第一种、配制贮存母液时，要算好各种成分逐次加入，等第一种成分完全溶解后再加入第二种成分，切忌成分完全溶解后再加入第二种成分，切忌成分完全溶解后再加入第二种成分，切忌成分完全溶解后再加入第二种成分，切忌“ “一锅煮一锅煮一锅煮一锅煮” ”。有。有。有。有机物质配好以后要装入棕色瓶放入电冰箱内保存，其它三机物质配好以后要装入棕色瓶放入电冰箱内保存，其它三机物质配好以后要装入棕色瓶放入电冰箱内保存，其它三机物质配好以后要装入棕色瓶放入电冰箱内保存，其它三种母液可在常温下保
11、存但最多不能超过一个月；种母液可在常温下保存但最多不能超过一个月；种母液可在常温下保存但最多不能超过一个月；种母液可在常温下保存但最多不能超过一个月；3 3、pHpH值对培养基的硬度有影响，值对培养基的硬度有影响，值对培养基的硬度有影响，值对培养基的硬度有影响，pHpH过高培养基变硬，过高培养基变硬，过高培养基变硬，过高培养基变硬，pHpH过低培养基不能凝固，所以要调整好培养基的过低培养基不能凝固，所以要调整好培养基的过低培养基不能凝固，所以要调整好培养基的过低培养基不能凝固，所以要调整好培养基的pHpH值；值；值；值；4 4、材料脱毒时不要在酒精中停留过长时间，以免材料被杀、材料脱毒时不要在酒精中停留过长时间，以免材料被杀、材料脱毒时不要在酒精中停留过长时间，以免材料被杀、材料脱毒时不要在酒精中停留过长时间，以免材料被杀死；死；死；死；5 5、接种后进行培养时，为确保实验成功，可以首先进行、接种后进行培养时，为确保实验成功，可以首先进行、接种后进行培养时，为确保实验成功，可以首先进行、接种后进行培养时，为确保实验成功，可以首先进行7-7-10d10d的暗培养，然后再进行光照培养。的暗培养，然后再进行光照培养。的暗培养，然后再进行光照培养。的暗培养，然后再进行光照培养。
