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1、第十五章第十五章 干细胞干细胞第一节第一节 概述概述 l一、干细胞的定义和分类一、干细胞的定义和分类l干细胞是具有干细胞是具有自我更新自我更新和和产生分化后代产生分化后代两种基本特性的细胞两种基本特性的细胞. l机体由两类不同的组织和器官构成。一类由体细胞组成机体由两类不同的组织和器官构成。一类由体细胞组成,另一另一类是以生殖细胞为主类是以生殖细胞为主,包括一些由体细胞组成的组织和器官构包括一些由体细胞组成的组织和器官构成。前者执行机体生命活动的各种生理功能成。前者执行机体生命活动的各种生理功能;后者一切为了保后者一切为了保证卵巢和辜丸中的卵子和精子的发育和成熟并延续生命。证卵巢和辜丸中的卵子
2、和精子的发育和成熟并延续生命。l自我更新指干细胞可进行均等分裂自我更新指干细胞可进行均等分裂,产生两个遗传特性上完全产生两个遗传特性上完全一样的干细胞一样的干细胞,均等分裂是大多数细胞的特性均等分裂是大多数细胞的特性,而而产生分化后代产生分化后代指干细胞可进行不均等分裂指干细胞可进行不均等分裂,产生的两个子代细胞中一个仍是产生的两个子代细胞中一个仍是干细胞干细胞, 另一个开始走上分化道路的定向祖细胞。另一个开始走上分化道路的定向祖细胞。施珊灌齐衬景汪目屎淄耍攀居耽抉箕桌珐镁酣塑亨价褥狼浮屁遁撇遭乓练A-第15章 干细胞A-第15章 干细胞l早期胚胎细胞是全能的早期胚胎细胞是全能的,它既可产生体
3、细胞它既可产生体细胞,又能产生生殖细胞又能产生生殖细胞, 包括从早期的卵裂球和囊胚期的包括从早期的卵裂球和囊胚期的ICM细胞以及后来胚胎的细胞以及后来胚胎的3个个胚层已分化后的生殖嵴区的原始生殖细胞胚层已分化后的生殖嵴区的原始生殖细胞.l而分化的后代细胞可从包括全能细胞向多能细胞和细胞谱系的而分化的后代细胞可从包括全能细胞向多能细胞和细胞谱系的各级祖细胞发展各级祖细胞发展,这些细胞仍旧可通过均等和不均等两种分裂这些细胞仍旧可通过均等和不均等两种分裂方式进行繁殖方式进行繁殖,一直到最后的终未分化体细胞。一直到最后的终未分化体细胞。l干细胞分为两类干细胞分为两类：l一类干细胞包括从早期囊胚一类干细
4、胞包括从早期囊胚ICM (inner cell mass)细胞分离并在体细胞分离并在体外培养和建系的外培养和建系的胚胎干细胞胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESC)和从胚胎生殖和从胚胎生殖嵴原始生殖细胞嵴原始生殖细胞(primordial germ cells, PGC)分离建系的分离建系的胚胎生殖细胚胎生殖细胞胞(embryonic germ cells, EGC)；l另一类是先在成年组织和器官另一类是先在成年组织和器官,以后在胎儿组织被证明其存在以后在胎儿组织被证明其存在,随后个别也在体外培养和建系成功的干细胞随后个别也在体外培养和建系成功的干细胞, 称为称为组织干
5、细胞组织干细胞(tissue stem cells) ,又称成体干细胞又称成体干细胞(adult stem cells) 。陈纺躺崖昨笑悟存岳腮驶刘酚呕雷虐袱躯炼滁起稗憨俞舶纬韵琼占繁诱秩A-第15章 干细胞A-第15章 干细胞l二、干细胞二、干细胞(stem cells)与个体发育与个体发育l正常生物个体发育的过程是按严格的时空程序进行的一系列细正常生物个体发育的过程是按严格的时空程序进行的一系列细胞分裂、分化和细胞凋亡相互协调作用的结果。胞分裂、分化和细胞凋亡相互协调作用的结果。l从一个受精卵、全能胚胎干细胞或组织谱系干细胞最终分化为从一个受精卵、全能胚胎干细胞或组织谱系干细胞最终分化为具
6、有独特功能体细胞所组成的组织器官具有独特功能体细胞所组成的组织器官, 这一过程通常被称为这一过程通常被称为发育的遗传程序发育的遗传程序(genetic program) ,被记录在细胞基因组的结构中被记录在细胞基因组的结构中.不同物种有不同的遗传程序。不同物种有不同的遗传程序。l在哺乳动物个体发育的不同阶段在哺乳动物个体发育的不同阶段,包括胚胎、幼年和成年个体包括胚胎、幼年和成年个体的各个发育时期的各个发育时期,都存在着发育潜能参差不同的干细胞都存在着发育潜能参差不同的干细胞。l干细胞最终演变为独特结构和功能的体细胞或成熟生殖细胞干细胞最终演变为独特结构和功能的体细胞或成熟生殖细胞,即细胞分化
7、即细胞分化。从分子水平而言。从分子水平而言,可以认为细胞分化是部分基因可以认为细胞分化是部分基因选择性地被激活或差异性表达选择性地被激活或差异性表达,从而控制专一性蛋白质的合成从而控制专一性蛋白质的合成和排布的结果。对正常细胞分化来说和排布的结果。对正常细胞分化来说,最重要的是多个基因表最重要的是多个基因表达过程在数量和时空上的精确联系和密切配合达过程在数量和时空上的精确联系和密切配合,并受不同层次并受不同层次的基因调控网络系统精确无误地调节和控制。的基因调控网络系统精确无误地调节和控制。 据义化坚馆快洪泉神阜辛广凌杯宾场迂卉拱丽雪趾搓暖狮扭姐趣刊谎挡煽A-第15章 干细胞A-第15章 干细胞
8、l三、胚胎干细胞研究简史三、胚胎干细胞研究简史l从从50年代开始年代开始,人们就寻找既能在体外增殖人们就寻找既能在体外增殖,又具有胚胎细胞全又具有胚胎细胞全能性能性(totipotency)或多能性或多能性 (pluripotency),并通过适当条件诱导分化并通过适当条件诱导分化为各种类型分化细胞的模型。为各种类型分化细胞的模型。50年代末美国发育生物学家年代末美国发育生物学家Stevens 将将着床前发育阶段的小鼠胚胎或着床前发育阶段的小鼠胚胎或12天胚龄天胚龄的胚胎生殖嵴移植到同的胚胎生殖嵴移植到同系成年小鼠辜丸或肾脏被膜下系成年小鼠辜丸或肾脏被膜下,移植后移植后7天天,发现有发现有80
9、%接种灶出接种灶出现并发展为畸胎瘤。从中分离、培养和建立了现并发展为畸胎瘤。从中分离、培养和建立了胚胎性癌细胞胚胎性癌细胞(embryonal carcinoma cell, EC)系。系。EC细胞具有恶性生长又具早期胚胎细胞具有恶性生长又具早期胚胎细胞发育多潜能性的双重性质。细胞发育多潜能性的双重性质。70年代年代 EC细胞常用作研究哺乳细胞常用作研究哺乳动物发育遗传以及细胞分化的实验模型动物发育遗传以及细胞分化的实验模型, 后后因因EC细胞核型异常细胞核型异常,分化细胞类型有限分化细胞类型有限等缺点而不再被使用。等缺点而不再被使用。l80年代初年代初,英国英国Evans和及美国和及美国Ma
10、rtin 2家实验室家实验室独立地从小鼠囊胚独立地从小鼠囊胚成功地建立了能在体外不断增殖成功地建立了能在体外不断增殖,并维持不分化状态的并维持不分化状态的多潜能胚多潜能胚胎干胎干(ES)细胞系细胞系。90年代初年代初,美国美国Matsui等从小鼠等从小鼠9天胚胎生殖嵴天胚胎生殖嵴建立了多潜能的建立了多潜能的胚胎生殖细胞系胚胎生殖细胞系。98年年美国威斯康星大学美国威斯康星大学Thomson等人利用等人利用36枚新鲜或冻存的人工体外受精胚胎枚新鲜或冻存的人工体外受精胚胎,获得人获得人ICM细胞细胞,经体外培养经体外培养,首次成功建立了首次成功建立了5株株人类人类ES细胞系细胞系,同年同年, Jo
11、hn Hopkins医学院医学院Shamblott等人从等人从5 -9周人流胚胎的生殖嵴和肠系膜周人流胚胎的生殖嵴和肠系膜首次培养出人首次培养出人EG细胞系。细胞系。颇葬凝椅两夸奎寝阁蔓骏什址供郁线淋替域梳弗扦减汕欺脊袜招体坦烷日A-第15章 干细胞A-第15章 干细胞l第二节第二节 胚胎干细胞胚胎干细胞l胚胎干细胞是指早期胚胎的卵裂球、囊胚胚胎干细胞是指早期胚胎的卵裂球、囊胚ICM细胞分离培养和细胞分离培养和建系的细胞。而从胚胎生殖嵴中建系的细胞。而从胚胎生殖嵴中PGC分离培养建成的称胚胎分离培养建成的称胚胎生殖细胞。这生殖细胞。这2类干细胞统称为胚胎性干细胞。类干细胞统称为胚胎性干细胞。l
12、一、一、ES和和EG细胞培养、建系技术细胞培养、建系技术l体外培养建系技术以小鼠的最为成熟体外培养建系技术以小鼠的最为成熟,基本原则是有赖于获得基本原则是有赖于获得全能性胚胎细胞或细胞团并建立体外适合其增殖和抑制分化的全能性胚胎细胞或细胞团并建立体外适合其增殖和抑制分化的培养系统培养系统。l由于早期胚胎细胞离体后极易发生分化由于早期胚胎细胞离体后极易发生分化,首先要解决阻止其分首先要解决阻止其分化、确保维持其全能性或多能性问题。目前常用的化、确保维持其全能性或多能性问题。目前常用的细胞分化抑细胞分化抑制物有制物有3种种：饲养层细胞饲养层细胞(feeder layer cells)、特殊细胞的条
13、件培液特殊细胞的条件培液(conditioned medium) ,如如BRL (Buffalo rat liver)细胞条件培液细胞条件培液,分化抑分化抑制因子制因子(differentiation inhibitory factor, DIF) ,如白血病抑制因子如白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor, LIF) 。此外此外,也有添加通过也有添加通过gp130信号转导信号转导途径的细胞因子途径的细胞因子,如白介素如白介素6 (lL一一6)、Oncostatin M和睫状神经和睫状神经营养因子营养因子(ciliary neurotrophic factor,
14、CNTF)等同样可维持小鼠等同样可维持小鼠ES细细胞的不分化胞的不分化.逆虹吼下搁屠纶咬穷殴且砧说隘镀账沥闹甚躲漾柄召豹衍树沽帧行菠衍讽A-第15章 干细胞A-第15章 干细胞l体外培养体外培养ES和和EG细胞可划分为两大类：饲养层培养法和无饲细胞可划分为两大类：饲养层培养法和无饲养层培养法。养层培养法。l(一一)饲养层细胞培养法饲养层细胞培养法l不论不论ES细胞或细胞或EG细胞细胞,原代或初期培养阶段一般都需依赖于原代或初期培养阶段一般都需依赖于能分泌使它们在体外存活和增殖所必需生长因子的饲养层细胞能分泌使它们在体外存活和增殖所必需生长因子的饲养层细胞.l不同类型的饲养层细胞分泌的生长因子略
15、有不同。但都要求在不同类型的饲养层细胞分泌的生长因子略有不同。但都要求在ES或或EG细胞培养过程中的饲养层细胞细胞培养过程中的饲养层细胞保持不分裂增殖保持不分裂增殖,而仍而仍然保持细胞的代谢活性。然保持细胞的代谢活性。l常用的饲养层细胞有下列两种常用的饲养层细胞有下列两种:l一种是取自各种品系小鼠交配后一种是取自各种品系小鼠交配后12 dpc (days post coitum)的的胚胎成胚胎成纤维细胞纤维细胞(embryonic fibroblast, MEF) 。经丝裂霉素经丝裂霉素C (mitomycin C)处理处理以终止细胞分裂后以终止细胞分裂后,用作用作ES细胞培养的饲养层。细胞培
16、养的饲养层。l另一种是来自另一种是来自SIM小鼠小鼠 (S)胚胎的对硫代鸟嘌岭胚胎的对硫代鸟嘌岭(thioguanine, T)和乌本苷和乌本苷(ouabain, O )有抗性的有抗性的成纤维成纤维STO细胞系细胞系,主要分泌干细主要分泌干细胞生长因子胞生长因子(stem cell factor, SCF)和白血病抑制因子和白血病抑制因子(LIF)。 鸭由辰菱暑儡谬楔恩佳停釜惭维勋哟味崔腾霸符骨岳念她姻洁稠踌咀趴艺A-第15章 干细胞A-第15章 干细胞l(二二)无饲养层培养法无饲养层培养法l以添加某些特定细胞的条件培养液和以添加某些特定细胞的条件培养液和LIF生长因子至含胎牛血生长因子至含胎
17、牛血清清(FCS)的正常培养液的正常培养液,替代饲养层细胞。替代饲养层细胞。l有有3种条件培养液可用于小鼠种条件培养液可用于小鼠ES细胞培养：细胞培养：l直接在直接在ES细胞基础培养液中加入重组生长因子和细胞基础培养液中加入重组生长因子和LIF等。等。lBuffalo大鼠肝细胞条件培养液大鼠肝细胞条件培养液(BRL-CM)。l2 -3周龄幼年大鼠心肌细胞条件培养液周龄幼年大鼠心肌细胞条件培养液(RH - CM) 。l一般以一般以2 -3份上述细胞条件培养液加份上述细胞条件培养液加1 - 2份新鲜的份新鲜的ES细胞培养细胞培养液液,再添加再添加10% - 20%胎牛血清胎牛血清,共同组合成无饲养
18、层的共同组合成无饲养层的ES 细细胞培养系统。胞培养系统。l但在胚胎干细胞原代和建系初期缺乏饲养层时但在胚胎干细胞原代和建系初期缺乏饲养层时,用这种条件培用这种条件培养液培养养液培养ES和和EG细胞成功率不高。细胞成功率不高。沾庸冶空早介想蜂柞琉裹莹稻酋谷榜翅裸鹿盅染自浇被奢亲樱见届丛峭枷A-第15章 干细胞A-第15章 干细胞l(三三) ES和和EC细胞的体外培养细胞的体外培养l1. ES细胞细胞l不同动物不同动物,甚至同种不同品系动物的胚胎发育速度和方式存在甚至同种不同品系动物的胚胎发育速度和方式存在着较大差异着较大差异, 如猪如猪ICM细胞生长与细胞生长与 小鼠不一样小鼠不一样,生长速率
19、慢生长速率慢,且且有一个休眠有一个休眠(quiescent)期。因此期。因此,ES细胞培养建系需细胞培养建系需根据各个物根据各个物种而选择不同发育阶段的早期胚胎种而选择不同发育阶段的早期胚胎。l如一般小鼠多选用如一般小鼠多选用3 -4 d的囊胚或的囊胚或2 - 3 d的桑椹胚的桑椹胚,猪取猪取8 - 10 d 的囊胚的囊胚,绵羊取绵羊取8 -9 d的囊胚的囊胚,人和牛取人和牛取7 -8 d的囊胚。同时的囊胚。同时,经经体外受精的胚胎或由核移植获得的重构胚胎在体外培养至所需体外受精的胚胎或由核移植获得的重构胚胎在体外培养至所需适当的发育阶段也是选取适当的发育阶段也是选取ES细胞培养的有效材料来源
20、。细胞培养的有效材料来源。l基本培养液基本培养液为含为含15% - 20% FCS、0.1 mmol/L-疏基乙醇和疏基乙醇和50IV/mL青霉素、青霉素、50g/mL链霉素的链霉素的DMEM液液.将桑椹胚或囊将桑椹胚或囊胚接种于预先铺有作为饲养层而无有丝分裂活性的单层胚接种于预先铺有作为饲养层而无有丝分裂活性的单层MEF细胞的细胞的35 mm培养皿中。培养培养皿中。培养2 -3天后按下列方法之一分离出天后按下列方法之一分离出ICM细胞进一步培养细胞进一步培养.屯拴教哄左锅准宛唤毁咽支啃哭度原跋羊腮职框躯夏注埠杭枫始嫩填驰钦A-第15章 干细胞A-第15章 干细胞l方法一：方法一：免疫手术法免
21、疫手术法(immunosurgery).l由于由于4 - 4.5 dpc的小鼠囊胚由己分化的滋养外胚层的小鼠囊胚由己分化的滋养外胚层(trophectoderm)和未分化的和未分化的ICM细胞组成细胞组成,前者细胞表面一般已表达主要组织前者细胞表面一般已表达主要组织相容性复合体相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC),能识别其相应抗能识别其相应抗体和形成免疫复合物体和形成免疫复合物,在补体存在时可导致细胞发生免疫溶解在补体存在时可导致细胞发生免疫溶解.l囊胚去除透明带囊胚去除透明带,直接暴露于稀释的兔抗直接暴露于稀释的兔抗JCR小鼠脾细胞抗血小
22、鼠脾细胞抗血清清(抗抗H - 2b)。再移到新鲜豚鼠血清中再移到新鲜豚鼠血清中, 囊胚的滋养外胚层细胞呈囊胚的滋养外胚层细胞呈泡状泡状,发生免疫溶解发生免疫溶解;而而ICM细胞不具细胞不具H -2b抗原抗原,不发生免疫溶不发生免疫溶解解,故细胞完整元损。故细胞完整元损。ICM细胞经细胞经Hanks液洗涤后液洗涤后,移至移至96孔孔铺有铺有MEF或或STO饲养层细胞和饲养层细胞和DMEM基本培液的板内进一步基本培液的板内进一步培养。培养。 蔼韵买咐将果选箕琶求钝战颜尽弓宠护轴挛瞥缠蜘免料戒讳扁颗钝述牡创A-第15章 干细胞A-第15章 干细胞l方法二方法二:常规培养常规培养l桑椹胚或囊胚在铺有桑
23、椹胚或囊胚在铺有MEF饲养层的饲养层的DMEM基本培养液中基本培养液中,未去未去透明带的桑椹胚或囊胚培养透明带的桑椹胚或囊胚培养3 -4 d,ICM细胞团从贴壁的囊胚内细胞团从贴壁的囊胚内长出来。吸出长出来。吸出ICM细胞团细胞团,用用0.25% (m/V)胰蛋白酶胰蛋白酶(trypsin)和和0.2 mmol/L EDTA混合消化液在混合消化液在370C消化消化5 min.部分解离的细部分解离的细胞团移至铺有胞团移至铺有MEF饲养层的饲养层的24孔培养板孔培养板, ICM细胞首先出现贴细胞首先出现贴壁生长壁生长,继续培养继续培养4 d,可在一些孔内见到巢状集落生长的可在一些孔内见到巢状集落生
24、长的ES细细胞团胞团.用胰蛋白酶消化巢状用胰蛋白酶消化巢状ES细胞团细胞团,并继续培养并继续培养,一般一般4 -5 d间隔用胰蛋白酶消化间隔用胰蛋白酶消化,克隆和纯化克隆和纯化ES细胞细胞,视视ES细胞密度逐渐细胞密度逐渐转移到较大容积的培养皿或培养瓶。转移到较大容积的培养皿或培养瓶。lES细胞在培养过程中细胞在培养过程中,有时在巢状干细胞团周边出现少量分化有时在巢状干细胞团周边出现少量分化细胞细胞,这时除了需继续维持饲养层细胞外这时除了需继续维持饲养层细胞外,在培液中再添加适量在培液中再添加适量的的LIF生长因子生长因子,可克服细胞进一步分化的现象。可克服细胞进一步分化的现象。碧遂藏钮信讯署
25、鞋大市崖拓烧娘熊孙墟雹拜羚贩暂野炭显雄瀑距通断斥贡A-第15章 干细胞A-第15章 干细胞lES细胞常用培养基的添加物除胎牛和小牛血清外细胞常用培养基的添加物除胎牛和小牛血清外,主要有多种主要有多种生长因子生长因子,例如表皮生长因子例如表皮生长因子(ECF) ,可促进细胞可促进细胞DNA合成和合成和 mRNA转录转录,使细胞周期的使细胞周期的S期提前期提前,周期缩短周期缩短;胰岛素样生长因胰岛素样生长因子子(ICF)对对ICM细胞有促进增殖作用细胞有促进增殖作用; 干细胞生长因子干细胞生长因子(SCF)对对干细胞有调控和促分裂作用干细胞有调控和促分裂作用,同时可抑制细胞凋亡。此外同时可抑制细胞
26、凋亡。此外,在培在培液中还需添加还原剂液中还需添加还原剂-巯基乙醇巯基乙醇,可使血清中的含硫化合物还原可使血清中的含硫化合物还原成谷胱甘肽成谷胱甘肽,以消除以消除ES细胞培养过程中产生的毒性过氧化物细胞培养过程中产生的毒性过氧化物,同同时时,-巯基乙醇有诱导细胞增殖和促进胚胎细胞贴壁作用。巯基乙醇有诱导细胞增殖和促进胚胎细胞贴壁作用。l 2. EG细胞细胞lPGC取材根据其在不同物种的早期胚胎中所处迁移位置而定。取材根据其在不同物种的早期胚胎中所处迁移位置而定。l小鼠小鼠EG细胞建系基本过程如下：收集细胞建系基本过程如下：收集8. 5 - 10. 5 dpc小鼠胚胎小鼠胚胎,在解剖镜下用镊子剖
27、取包含原始生殖细胞在解剖镜下用镊子剖取包含原始生殖细胞(PGC)的生殖嵴组织的生殖嵴组织,以以0.02% EDTA液孵育含液孵育含PGC细胞的生殖嵴组织细胞的生殖嵴组织,37 0C, 15 min.吸管轻吹打散吸管轻吹打散,接种于铺有接种于铺有MEF或或STO饲养层细胞的饲养层细胞的4孔培养板孔培养板内。接种细胞首先出现贴壁生长内。接种细胞首先出现贴壁生长,每天或隔天更换培养液。每天或隔天更换培养液。泰襟泽高逐重邵诚刷寐螟佰秀柜同辛扬神陛鼎峦酷便铣算抄步株炽驳闪振A-第15章 干细胞A-第15章 干细胞l生殖嵴组织培养物在饲养层细胞上分裂增殖生殖嵴组织培养物在饲养层细胞上分裂增殖,4 - 6
28、d后在显微后在显微镜下将包含原始生殖细胞的细胞团用胰蛋白酶消化并转移至新镜下将包含原始生殖细胞的细胞团用胰蛋白酶消化并转移至新的饲养层细胞上的饲养层细胞上,继续培养增殖。继续培养增殖。l重复用胰蛋白酶消化并移至新的饲养层细胞重复用胰蛋白酶消化并移至新的饲养层细胞,经过同上经过同上2 -3次过次过程程,可产生巢状可产生巢状(nests)生长的干细胞集落。最后将它转移到铺生长的干细胞集落。最后将它转移到铺有饲养层细胞的培养瓶内进一步扩增。有饲养层细胞的培养瓶内进一步扩增。lEG细胞的饲养层常用细胞的饲养层常用STO细胞细胞,培养液基本同培养液基本同ES细胞细胞,但除但除LIF外还要添加干细胞因子外
29、还要添加干细胞因子(SCF)和碱性成纤维细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。l二、二、ES和和EG细胞系基本特性细胞系基本特性l(一一)体外能无限增殖体外能无限增殖l建系后的建系后的ES细胞在体外培养不仅能存活细胞在体外培养不仅能存活,还能无限增殖还能无限增殖,是干是干细胞自我更新特性在体外培养中的延续。但实际上细胞自我更新特性在体外培养中的延续。但实际上,传代次数传代次数愈多愈多,ES细胞会像常规细胞一样细胞会像常规细胞一样,出现核型不正常的情况出现核型不正常的情况,并失并失去了去了ES细胞原有的一些重要特性。细胞原有的一些重要特性。塔励享刺瘤劫哩屯殉惫学欢久基鸣宋版竹坞凝晾份
30、洪罐解属庶节滩粕虐孜A-第15章 干细胞A-第15章 干细胞l129品系小鼠的品系小鼠的ICM细胞非常容易建立细胞非常容易建立ES细胞系细胞系,而其他品系的而其他品系的小鼠不容易小鼠不容易,说明遗传因素制约说明遗传因素制约ES细胞建系。细胞建系。l(二二)体外产生分化细胞体外产生分化细胞l产生分化细胞是干细胞基本特性在体外培养中的延续。由于早产生分化细胞是干细胞基本特性在体外培养中的延续。由于早期胚胎细胞离体后极易发生分化期胚胎细胞离体后极易发生分化,因此因此,ES和和EG细胞体外培养细胞体外培养的首要条件是建立适合其增殖、抑制其分化、确保维持其多能的首要条件是建立适合其增殖、抑制其分化、确保
31、维持其多能性的培养体系。性的培养体系。lICM细胞一般接种于铺有灭活的小鼠细胞一般接种于铺有灭活的小鼠MEF细胞作为饲养层的琼细胞作为饲养层的琼脂平板上脂平板上,加有含抑制分化的加有含抑制分化的LIF的培养液的培养液,或再添加适当的分或再添加适当的分化诱导物质化诱导物质(如维甲酸等如维甲酸等),或通过悬滴培养成拟胚体或通过悬滴培养成拟胚体 (embryoid bodies, EB)等等,易分化产生包括易分化产生包括3个胚层的各种类型的分化细胞个胚层的各种类型的分化细胞,常常见的是几种类型细胞混在一起见的是几种类型细胞混在一起,单一类型细胞要靠定向诱导分单一类型细胞要靠定向诱导分化化. l体外培
32、养的体外培养的ES细胞也能产生雌、雄两性的生殖细胞细胞也能产生雌、雄两性的生殖细胞,实现了体实现了体外培养的外培养的ES细胞也能表达细胞也能表达全能性全能性 (totipotency)概念概念桂茹大苔师严盂仲第顷浑校苛抵供梁洁廊兑磐字岗雕酞果击谴甘白奸彤阎A-第15章 干细胞A-第15章 干细胞l(三三)体内产生畸胎瘤体内产生畸胎瘤lES和和EG细胞若接种于免疫缺损小鼠细胞若接种于免疫缺损小鼠(裸鼠或裸鼠或SCID小鼠小鼠)腋窝下腋窝下,或或接种于同种同基因小鼠的皮下、眼窝和器官包膜下接种于同种同基因小鼠的皮下、眼窝和器官包膜下,均可形成均可形成由内胚层、中胚层和外胚层多种类型细胞构成的畸胎瘤
33、。后者由内胚层、中胚层和外胚层多种类型细胞构成的畸胎瘤。后者通过组织学检查通过组织学检查, 可以用作分析和鉴定可以用作分析和鉴定ES或或EG细胞的发育多细胞的发育多潜能性潜能性,判断所产生分化细胞种类的多寡。判断所产生分化细胞种类的多寡。l(四四)巢状生长有多能胚胎干细胞分子标记巢状生长有多能胚胎干细胞分子标记lES和和EG细胞在体外彼此呈现单层或多层紧密堆积细胞在体外彼此呈现单层或多层紧密堆积,而形成岛而形成岛状或巢状集落群体的生长形态。将这种岛状或巢状群体细胞的状或巢状集落群体的生长形态。将这种岛状或巢状群体细胞的克隆挑出克隆挑出,用胰蛋白酶轻度消化后接种于新的饲养层或特定的用胰蛋白酶轻度
34、消化后接种于新的饲养层或特定的条件培养液中条件培养液中,继续培养继续培养3 -4天后天后,分散的分散的ES细胞或细胞或EG细胞又细胞又重新长出彼此紧密接触的岛状或巢状群体细胞克隆。重新长出彼此紧密接触的岛状或巢状群体细胞克隆。l巢状集落生长是巢状集落生长是ES和和EG细胞最具特征性的生长方式。不同动细胞最具特征性的生长方式。不同动物物ES和和EG细胞巢状集落有所不同细胞巢状集落有所不同.如猪如猪EG细胞集落常是圆的细胞集落常是圆的,比小比小鼠鼠ES和和EG细胞集落较扁平和较不透明细胞集落较扁平和较不透明.日档敢邻倡嗅堑佑嗓焦幸水咙镭歌宛屋柏滔鱼裴淹坑翼岁碘险唯隐畏碉谰A-第15章 干细胞A-第
35、15章 干细胞l小鼠、猪和人类等灵长类动物的小鼠、猪和人类等灵长类动物的ES和和EG细胞都具有特征性的细胞都具有特征性的多能胚胎干细胞的分子标记多能胚胎干细胞的分子标记, 表表19.2.l除牛的除牛的ES细胞不表达碱性磷酸酶细胞不表达碱性磷酸酶(AKP)活性外活性外,其他动物和人其他动物和人的的ES或或EG细胞都表达细胞都表达AKP的活性。分化的的活性。分化的ES或或EG细胞都不细胞都不表达表达AKP。因此因此,AKP活性可作为活性可作为ES或或EG细胞是否分化的重要细胞是否分化的重要标记之一标记之一。l胚胎发育阶段特异性抗原胚胎发育阶段特异性抗原(stage specific embryon
36、ic antigen, SSEA)是早是早期胚胎细胞表面的一类糖蛋白期胚胎细胞表面的一类糖蛋白,不同种类的不同种类的SSEA因糖基化不同因糖基化不同而区分为而区分为SSEA -1、SSEA -3和和SSEA -4不同的表位分子。未分不同的表位分子。未分化的早期胚胎细胞化的早期胚胎细胞 SSEA呈阳性呈阳性,而分化的细胞为阴性。而分化的细胞为阴性。人和人和灵长类灵长类ES细胞表达细胞表达SSEA -3和和SSEA -4,而而SSEA-1仅在人仅在人EG 细细胞及刚开始分化的胞及刚开始分化的ES细胞中表达。细胞中表达。小鼠的小鼠的ES和和EG细胞只表达细胞只表达SSE A-1.钧曾讣循遁同说亡簇尤
37、趣贝银啼梯氢阂成渗乔症暖修枯候涤正死遭不偏佬A-第15章 干细胞A-第15章 干细胞l肿瘤相关抗原肿瘤相关抗原(tumor related antigen, TRA)是一种对唾液酸酶敏感的是一种对唾液酸酶敏感的细胞表面糖蛋白细胞表面糖蛋白,生殖细胞肿瘤标记生殖细胞肿瘤标记(germ cell tumor marker, GCTM)是是另一类抗原决定簇不同于另一类抗原决定簇不同于TRA的细胞表面糖蛋白。人及猴的的细胞表面糖蛋白。人及猴的ES细胞与细胞与TRA -1 -60、TRA -1 - 80和和GCTM -2抗体均可起反应。抗体均可起反应。人与猴是近亲人与猴是近亲,因此因此,人与猴的人与猴的
38、ES细胞都表达细胞都表达 TRA分子分子,而啮齿而啮齿动物小鼠却缺动物小鼠却缺(见表见表19.2),推测推测TRA可能是灵长类多能胚胎干细胞可能是灵长类多能胚胎干细胞特异性的分子标记特异性的分子标记。lOct -4是生殖系专一性转录因子是生殖系专一性转录因子,在小鼠胚胎发育早期、生殖细在小鼠胚胎发育早期、生殖细胞谱系以及体外培养的多能胚胎干细胞中特异地表达胞谱系以及体外培养的多能胚胎干细胞中特异地表达,被认为被认为是全能和多能性的一种标志基因。是全能和多能性的一种标志基因。小鼠、猪和包括人类在内的小鼠、猪和包括人类在内的灵长类动物的灵长类动物的ES和和 EG细胞都表达细胞都表达Oct - 4。
39、l(五五)染色体数目和核型正常染色体数目和核型正常l无论是小鼠或人的无论是小鼠或人的ES和和EG细胞细胞,经体外传代培养后经体外传代培养后,具有正常具有正常的染色体数目和二倍体核型的染色体数目和二倍体核型,即使冻存复苏后应仍然保持这种即使冻存复苏后应仍然保持这种特性特性.l新建立的新建立的ES细胞系常有不正常的核型细胞系常有不正常的核型,因此因此,需对新建系的需对新建系的ES细胞进行染色体数目和核型进行分析确认。细胞进行染色体数目和核型进行分析确认。播寻淳槐滋沦敏康浓埋膜渭验镊揖佯趣酬卸霹汽潘莫绚拣拖稍埃徽铰忻监A-第15章 干细胞A-第15章 干细胞l(六六)遗传可操作性遗传可操作性lES细
40、胞遗传操作的可行性是由于细胞遗传操作的可行性是由于ES细胞在体外可以不断地自细胞在体外可以不断地自我增殖我增殖,又是具有发育的全能或多能性又是具有发育的全能或多能性, 并能通过构建嵌合体并能通过构建嵌合体而产生有功能的生殖细胞。这为通过基因工程途径改造物种提而产生有功能的生殖细胞。这为通过基因工程途径改造物种提供了独特的、无与伦比的受体细胞。供了独特的、无与伦比的受体细胞。lES细胞遗传操作主要有细胞遗传操作主要有2类方法：一是通过同源重组技术去剔类方法：一是通过同源重组技术去剔除除ES细胞基因组的一个目的基因细胞基因组的一个目的基因,所谓所谓基因剔除基因剔除(knock out);二二是转染
41、一个外源基因定点整合到是转染一个外源基因定点整合到ES细胞基因组的正确位置细胞基因组的正确位置,所所谓谓基因定点敲入基因定点敲入(knock in)技术。技术。l(七七)形成嵌合体实现种系传递形成嵌合体实现种系传递l参与嵌合体实现种系传递是参与嵌合体实现种系传递是ES细胞生物学的重要概念。细胞生物学的重要概念。l只有通过形成嵌合体实现种系传递即要分析干细胞是否能参与只有通过形成嵌合体实现种系传递即要分析干细胞是否能参与形成生殖腺中卵子和精子才能鉴定体外培养建系的形成生殖腺中卵子和精子才能鉴定体外培养建系的ES和和 EG细细胞是否具有全能性。胞是否具有全能性。售咨馅谰埔辉媒五胀娶屏乏抱酶颖档黍硝
42、茨广辽宅核琵馅揽图唇励冷疮聊A-第15章 干细胞A-第15章 干细胞l三、三、ES和和EG细胞定向诱导分化细胞定向诱导分化l(一一)基本原理基本原理l细胞诱导分化是一个细胞与其微环境相互间复杂而又精密协调细胞诱导分化是一个细胞与其微环境相互间复杂而又精密协调的分子细胞学过程。的分子细胞学过程。l早在早在20世纪六七十年代前世纪六七十年代前,实验胚胎学家就发现蛙类早期原肠实验胚胎学家就发现蛙类早期原肠胚胚(gastrula)的背唇的背唇(dorsal lip)背方区域能够诱导外胚层分背方区域能够诱导外胚层分化为神经管化为神经管,而靠近腹侧面则诱导出尾部结构。接着又发现胚而靠近腹侧面则诱导出尾部结
43、构。接着又发现胚胎发育中组织发生和身体构造形成是一连串的诱导连锁过程胎发育中组织发生和身体构造形成是一连串的诱导连锁过程, 如神经组织听囊形成后如神经组织听囊形成后,则诱导邻近的间质细胞形成软骨囊则诱导邻近的间质细胞形成软骨囊;水水晶体则剌激覆盖的外胚层诱导出角膜晶体则剌激覆盖的外胚层诱导出角膜. l在体胚胎细胞分化过程中在体胚胎细胞分化过程中, 诱导作用的结果不只是决定于各种诱导作用的结果不只是决定于各种诱导物质的性质和专一性诱导物质的性质和专一性,同时也决定于被诱导细胞的反应能同时也决定于被诱导细胞的反应能力力(competence),后者受遗传、发育潜能等内在因素的限制。后者受遗传、发育
44、潜能等内在因素的限制。咖榆尿日滚黔括献判潞戊旅蜗帽找腔罢统契螟醉答听恿碉汾睡蓉扔英克肉A-第15章 干细胞A-第15章 干细胞lES细胞是体外研究诱导分化的较理想的模型。细胞是体外研究诱导分化的较理想的模型。l在胚胎细胞被诱导分化中在胚胎细胞被诱导分化中,所用所用诱导物质诱导物质种类繁多种类繁多, 大致分两大致分两类类:l一类是一类是使被诱导细胞可逆性地轻度损伤使被诱导细胞可逆性地轻度损伤:例如无机物、有机酸、例如无机物、有机酸、醇、亚甲基盐、硫氢化物、氨水甚至蒸馏水或缺钙的盐水醇、亚甲基盐、硫氢化物、氨水甚至蒸馏水或缺钙的盐水,都都能使两栖类胚胎细胞渗透压改变致成轻度损伤能使两栖类胚胎细胞渗
45、透压改变致成轻度损伤,导致神经细胞导致神经细胞分化。分化。 l另一类诱导物另一类诱导物,如类固醇激素、维甲酸衍生物如类固醇激素、维甲酸衍生物(RA等等) ,多肽生多肽生长因子长因子(bFGF、TGF、Activin)等等,则是则是通过与被诱导细胞表面通过与被诱导细胞表面各自的受体结合而介导的细胞诱导分化各自的受体结合而介导的细胞诱导分化。同一种诱导物可以诱。同一种诱导物可以诱导出不同类型细胞或变化多端的构造。导出不同类型细胞或变化多端的构造。lES和和EG细胞定向诱导分化是当前细胞定向诱导分化是当前ES细胞生物学研究中的热点细胞生物学研究中的热点之一。之一。 冀叼举避庇货疼书犬鲍烬邱债洽疤旁蛊
46、钠谣籽杏钳义育荧婪佬纠毯源阿戎A-第15章 干细胞A-第15章 干细胞l(二二)定向诱导分化的类型定向诱导分化的类型l体外定向诱导分化可分为体外定向诱导分化可分为谱系分化谱系分化(lineage differentiation)和和定向分定向分化化(committed differentiation)。l谱系分化包括谱系分化包括ES细胞经谱系祖细胞细胞经谱系祖细胞(lineage progenitors)、谱系定型谱系定型细胞细胞(lineage committed cell) 到终末分化细胞的整个细胞分化的全到终末分化细胞的整个细胞分化的全过程过程。在这过程中。在这过程中,会出现一些不稳定的
47、、过渡型的前体细胞。会出现一些不稳定的、过渡型的前体细胞。由于由于ES细胞也是一种具有不受约束的和无序的自我发育特性细胞也是一种具有不受约束的和无序的自我发育特性, ES细胞在体外被诱导时常同时出现不同胚层类型的多种分化细胞在体外被诱导时常同时出现不同胚层类型的多种分化细胞细胞,这增加了识别谱系祖细胞和谱系定型细胞的困难性。这增加了识别谱系祖细胞和谱系定型细胞的困难性。l定向分化要设法控制定向分化要设法控制ES细胞导向产生单一类型的终末分化细细胞导向产生单一类型的终末分化细胞胞,这是当今临床细胞移植或细胞治疗迫切需要的。对这是当今临床细胞移植或细胞治疗迫切需要的。对ES细胞细胞转染细胞专一的转
48、录因子、标志基因或有关细胞分化因子等遗转染细胞专一的转录因子、标志基因或有关细胞分化因子等遗传操作传操作,并结合报道基因和添加特定细胞因子诱导条件选择等并结合报道基因和添加特定细胞因子诱导条件选择等手段手段,可能是探索可能是探索ES细胞定向诱导分化的一条有效途径。细胞定向诱导分化的一条有效途径。 租式锤哉段检可壮嘿调苯电辈俗店碾闸懂沧盂否厨吩占烩秩逾尼撒瑚评聊A-第15章 干细胞A-第15章 干细胞l(三三) ES细胞体外诱导分化的基本途径细胞体外诱导分化的基本途径l1.单层单层ES细胞培养和诱导分化细胞培养和诱导分化l单层单层ES细胞在撤除细胞在撤除LIF并添加适当浓度的细胞分化诱导剂并添加
49、适当浓度的细胞分化诱导剂,如如维甲酸维甲酸(retinoic acid, RA),二甲亚矾二甲亚矾(DMSO)和环六亚甲基双乙酰胶和环六亚甲基双乙酰胶(HMBA)等并添加适当的生长因子条件下等并添加适当的生长因子条件下,每隔每隔2天天,更换含诱导剂更换含诱导剂的新鲜培养液。的新鲜培养液。l细胞分化类型随诱导剂和生长因子性质及其浓度细胞分化类型随诱导剂和生长因子性质及其浓度,细胞浓度细胞浓度,培培养条件等因素养条件等因素,特别是特别是ES细胞本身的分化潜能和特性而异。通细胞本身的分化潜能和特性而异。通常单层培养的常单层培养的ES细胞较难分化为单一类型的细胞细胞较难分化为单一类型的细胞,常出现以某
50、常出现以某种类型分化细胞为优势的情况下种类型分化细胞为优势的情况下,杂有一些其他类型的分化细杂有一些其他类型的分化细胞。胞。l2. ES细胞拟胚体形成和诱导分化细胞拟胚体形成和诱导分化l形成拟胚体方式是形成拟胚体方式是ES细胞定向诱导分化的常用途径细胞定向诱导分化的常用途径.有两类方有两类方法法 盅遗吼滇绦筒赋畔古簧血远梦虐见拆龄轴苏彼坪棠掷虑鹃时猖膨容雨键剧A-第15章 干细胞A-第15章 干细胞l(1)软琼脂培养软琼脂培养lES细胞经胰蛋白酶消化细胞经胰蛋白酶消化,吹打成单个细胞吹打成单个细胞,接种于预先以软琼接种于预先以软琼脂铺底的培养皿内脂铺底的培养皿内,ES细胞呈悬浮生长细胞呈悬浮生
51、长,增殖增殖,彼此粘附聚集而彼此粘附聚集而形成拟胚体。形成拟胚体。l(2)悬滴培养悬滴培养lES细胞经胰蛋白酶消化细胞经胰蛋白酶消化,制备成单个细胞悬浮液制备成单个细胞悬浮液,滴种在直径滴种在直径为为10 cm培养皿的盖子上培养皿的盖子上,制成许多悬浮细胞小滴制成许多悬浮细胞小滴,培养皿内加培养皿内加入适量入适量PHS,然后小心盖上带有许多小滴的盖子然后小心盖上带有许多小滴的盖子,使盖子上的许使盖子上的许多小滴倒置成悬滴。置多小滴倒置成悬滴。置370C,5% CO2培养箱。培养培养箱。培养3天后天后,悬滴悬滴中的中的ES细胞聚集形成拟胚体。细胞聚集形成拟胚体。l将拟胚体移至含细胞分化诱导剂将拟
52、胚体移至含细胞分化诱导剂(如如RA)的培养皿或微孔板进的培养皿或微孔板进一步培养。然后移放人铺有一步培养。然后移放人铺有 0.1%白明胶的培养皿或微孔板内白明胶的培养皿或微孔板内,在含有或不含细胞分化诱导剂在含有或不含细胞分化诱导剂,并缺乏并缺乏LIF的培养液中进一步的培养液中进一步培养培养,可被诱导分化为不同类型的细胞可被诱导分化为不同类型的细胞.馏涡柜嗅绢艺酪喊碍杏霍仙丢长矢地愈诈汽缎铸卸叠篓垮伪讹轮忱江伍爆A-第15章 干细胞A-第15章 干细胞l(四四) ES细胞体外诱导分化的几种细胞细胞体外诱导分化的几种细胞l人类人类ES/EG细胞建系成功细胞建系成功,人们借鉴小鼠人们借鉴小鼠ES细
53、胞体外诱导分化细胞体外诱导分化的成功经验的成功经验,致力于将人致力于将人ES 细胞改造成以临床基因、细胞治疗细胞改造成以临床基因、细胞治疗和组织工程种子细胞为目的的各种定向诱导分化细胞研究和组织工程种子细胞为目的的各种定向诱导分化细胞研究.目目前至少有前至少有20余种从余种从ES细胞诱导分化来的体细胞获得成功细胞诱导分化来的体细胞获得成功(表表19.3)l造血细胞造血细胞(hematopoitic cell)是报道最多的一种分化细胞类型。小是报道最多的一种分化细胞类型。小鼠鼠ES细胞拟胚体在体外可分化为类似于早期胚胎卵黄囊血岛细胞拟胚体在体外可分化为类似于早期胚胎卵黄囊血岛样的结构样的结构,分
54、化产生红细胞、髓细胞和淋巴细胞等各种造血系分化产生红细胞、髓细胞和淋巴细胞等各种造血系统的细胞。一般常采用分阶段诱导小鼠统的细胞。一般常采用分阶段诱导小鼠ES细胞分化为造血干细胞分化为造血干细胞和细胞和B淋巴细胞淋巴细胞:首先使首先使ES细胞发育成拟胚体细胞发育成拟胚体,然后然后,用胰蛋用胰蛋白酶消化成单个细胞白酶消化成单个细胞,经干细胞因子经干细胞因子(SCF)、血小板生成素、血小板生成素(TPO)和胚胎细胞的条件培养液处理和胚胎细胞的条件培养液处理,使其定向分化为造血干细使其定向分化为造血干细胞胞;再用原代骨髓基质细胞作饲养层和再用原代骨髓基质细胞作饲养层和SCF及及IL-6细胞因子处细胞
55、因子处理理,可进一步使可进一步使ES细胞来源的造血干细胞分化为细胞来源的造血干细胞分化为B淋巴细胞系。淋巴细胞系。撕仕潜钎纸蔷仓槐伞束名璃拿岸趣筒肘篷舰贸典格寒醚卑瞄椽射沿辗睹柳A-第15章 干细胞A-第15章 干细胞l在体胚胎研究表明在体胚胎研究表明, 7.5 d的小鼠胚胎最初在卵黄囊的小鼠胚胎最初在卵黄囊(yolk sac)内内出现大而有核的前成红细胞。当胚胎长至出现大而有核的前成红细胞。当胚胎长至10 -12 d肝形成时肝形成时, 则则卵黄囊前成红细胞逐渐消失。表明胚胎造血器官是从卵黄囊转卵黄囊前成红细胞逐渐消失。表明胚胎造血器官是从卵黄囊转移到胚胎肝脏的。而在移到胚胎肝脏的。而在ES细
56、胞体外分化实验中细胞体外分化实验中,生长生长4d的拟胚的拟胚体首先出现前成红细胞体首先出现前成红细胞,拟胚体生长至第拟胚体生长至第10 -12 d时前成红细胞时前成红细胞逐渐消失。成熟红细胞和成髓细胞都是在前成红细胞出现后不逐渐消失。成熟红细胞和成髓细胞都是在前成红细胞出现后不久才产生。久才产生。利用骨髓基质细胞或其条件培养液利用骨髓基质细胞或其条件培养液,可以诱导小鼠可以诱导小鼠ES细胞在体外分化为造血干细胞细胞在体外分化为造血干细胞。l小鼠在体胚胎的卵黄囊血岛内小鼠在体胚胎的卵黄囊血岛内,前成红细胞的产生总是伴随着前成红细胞的产生总是伴随着内皮细胞的出现内皮细胞的出现,因而认为内皮细胞和前
57、成红细胞来源于共同因而认为内皮细胞和前成红细胞来源于共同的祖细胞。同样的祖细胞。同样,ES细胞体外分化时细胞体外分化时,拟胚体的血岛样结构中前拟胚体的血岛样结构中前成红细胞集落周围也有内皮细胞出现。成红细胞集落周围也有内皮细胞出现。ES细胞衍生的拟胚体分细胞衍生的拟胚体分化的管状结构是由内皮细胞排列组成的化的管状结构是由内皮细胞排列组成的,管道内还含有一些造管道内还含有一些造血细胞血细胞,类似于胚胎发育中的早期血管发生。类似于胚胎发育中的早期血管发生。l将将ES细胞单层培养在含重组细胞单层培养在含重组TGF1的的I型胶原蛋白为基质的三型胶原蛋白为基质的三维系统内维系统内,或将过度表达或将过度表
58、达TGF1的的ES细胞单层培养在细胞单层培养在I型胶原蛋型胶原蛋白为基质的三维系统内都能获得内皮细胞组成的血管样结构白为基质的三维系统内都能获得内皮细胞组成的血管样结构,而缺乏重组而缺乏重组TGF1处理或无过度表达处理或无过度表达TGF1的正常的正常ES细胞在细胞在I型胶原蛋白为基质的三维系统内培养型胶原蛋白为基质的三维系统内培养, 不形成血管样结构不形成血管样结构.因此因此, TGF1可能是通过细胞外基质行使其形成血管的功能可能是通过细胞外基质行使其形成血管的功能.桥灸笔衍盘翔妥新蚁匪披柴差版卜标患厚汐秘津罐剪追县距饵扣夹酱扩萍A-第15章 干细胞A-第15章 干细胞l单层培养的小鼠单层培养
59、的小鼠ES细胞的诱导分化实验中细胞的诱导分化实验中,在在10mol/L维甲酸维甲酸(RA)与与1 mmol/L双丁酰基环腺苷磷酸双丁酰基环腺苷磷酸(dibutyryl cyclic adenosine monophosphate, dBcAMP )共同作用下共同作用下,90% -95%的分化细胞为神经的分化细胞为神经胶质细胞。小鼠胶质细胞。小鼠ES细胞也可在体外被诱导分化为少突神经胶细胞也可在体外被诱导分化为少突神经胶质细胞质细胞(oligodendrocytes)和运动神经元。和运动神经元。ES细胞拟胚体在特定条细胞拟胚体在特定条件贴壁培养时也能被诱导分化为件贴壁培养时也能被诱导分化为神经元
60、神经元。用悬浮培养。用悬浮培养4 d的拟的拟胚体在含胚体在含RA的培养液中继续培养的培养液中继续培养 4 d,再使拟胚体贴壁培养则再使拟胚体贴壁培养则可高效重复地分化出神经细胞可高效重复地分化出神经细胞,不仅表达专一性的神经微丝不仅表达专一性的神经微丝M和和微管蛋白微管蛋白,还有钠、钾、钙等离子信号通道的特征。还有钠、钾、钙等离子信号通道的特征。l分化的神经细胞还表达神经递质分化的神经细胞还表达神经递质GABA、glycine和受体和受体NMDA等不同物质。甚至在体外诱导分化早期的拟胚体中检测到神经等不同物质。甚至在体外诱导分化早期的拟胚体中检测到神经元和神经胶质细胞的共同前体细胞的专一性标志
61、巢蛋白元和神经胶质细胞的共同前体细胞的专一性标志巢蛋白(nestin)。用用RA诱导诱导ES细胞分化为表达细胞分化为表达-氨基丁酸的神经细胞植入氨基丁酸的神经细胞植入Huntingtons病病(一种遗传性舞蹈病一种遗传性舞蹈病)大鼠模型体内大鼠模型体内,具有神经细胞功能的移植物具有神经细胞功能的移植物使患鼠症状有所改善使患鼠症状有所改善,并存活了并存活了6周。周。l因此因此,ES细胞体外诱导分化细胞有可能成为临床细胞治疗的移细胞体外诱导分化细胞有可能成为临床细胞治疗的移植物来源的新途径之一。植物来源的新途径之一。痢滤贱畦百掂糖虐谚滞勇染赞呕匣抖践菇酪枕百苏唁遇职巨旦困刊呸兰奏A-第15章 干细
62、胞A-第15章 干细胞l悬浮或悬滴培养的小鼠悬浮或悬滴培养的小鼠ES细胞的拟胚体在细胞的拟胚体在RA诱导条件下贴壁诱导条件下贴壁生长数天生长数天,常出现某些分化细胞集落具节律性自发收缩现象常出现某些分化细胞集落具节律性自发收缩现象.电电镜观察证实镜观察证实,收缩的细胞内存在着收缩的细胞内存在着肌原纤维、肌小节和闰盘肌原纤维、肌小节和闰盘等等典型心肌细胞特有结构。发现心肌细胞分化过程中典型心肌细胞特有结构。发现心肌细胞分化过程中,分化细胞分化细胞团刚开始收缩时团刚开始收缩时型肌球蛋白重链型肌球蛋白重链(MHC)表达占优势表达占优势,继续培养继续培养数天数天,则则型型MHC逐渐占优势逐渐占优势,最
63、终在分化的心肌细胞中最终在分化的心肌细胞中,27 % 表达表达型型MHC,33 %同时表达同时表达和和型型MHC,40 %表达表达型型MHC。这种这种MHC亚型的转变与在体胚胎心肌发育过程极相似。除心亚型的转变与在体胚胎心肌发育过程极相似。除心肌细胞外肌细胞外,决定骨骼肌发育的基因决定骨骼肌发育的基因myf-5、myogenin, myoD等等在在ES细胞拟胚体的分化细胞中都能够表达细胞拟胚体的分化细胞中都能够表达,而且表达时序与在而且表达时序与在体胚胎发育中相同。体胚胎发育中相同。ES细胞拟胚体贴壁培养细胞拟胚体贴壁培养1- 2周后一般都能周后一般都能出现肌细胞出现肌细胞,继续培养则融合成肌
64、管继续培养则融合成肌管,显示出骨略肌发育的典型显示出骨略肌发育的典型特征。分化的肌细胞常表达成熟肌细胞专一的特征。分化的肌细胞常表达成熟肌细胞专一的Ca2+信号通道和信号通道和烟碱受体烟碱受体(nicotinic receptor)。二甲亚矾诱导二甲亚矾诱导ES细胞拟胚体可形成细胞拟胚体可形成心肌、平滑肌和骨骼肌等多种类型肌细胞心肌、平滑肌和骨骼肌等多种类型肌细胞,用肌肉专一性的调用肌肉专一性的调节因子节因子myoD基因转染基因转染ES细胞并结合细胞并结合DMSO诱导处理诱导处理,额外表额外表达达myoD基因的基因的ES细胞细胞,则主要分化为骨骼肌则主要分化为骨骼肌,没有心肌和平滑没有心肌和平
65、滑肌类型细胞出现肌类型细胞出现,且骨骼肌常融合形成肌管。且骨骼肌常融合形成肌管。l因此因此,通过改造通过改造ES细胞某种基因和给予适当培养条件的途径细胞某种基因和给予适当培养条件的途径,是诱导是诱导ES细胞向特定单一类型细胞分化的可行方法之一。细胞向特定单一类型细胞分化的可行方法之一。 刘娟范涂携潞师虏污价昭创暖院缀垮甥殆将玩坤腰森坷寺与桌削习梗嘉接A-第15章 干细胞A-第15章 干细胞l小鼠小鼠ES细胞或细胞或EG细胞通过悬滴培养法细胞通过悬滴培养法,形成的拟胚体被转移形成的拟胚体被转移到铺有琼脂的培养皿中到铺有琼脂的培养皿中,悬浮培养悬浮培养3 d, 每天更换含有诱导剂二每天更换含有诱导
66、剂二甲亚矾甲亚矾(DMSO)的培养液。的培养液。3 d后后,经过诱导剂处理的拟胚体移人经过诱导剂处理的拟胚体移人表面事先用明胶表面事先用明胶 (gelatin)包被的培养皿中进一步贴壁培养。包被的培养皿中进一步贴壁培养。这时给培养液中加入胰岛素、三腆甲腺原氨酸这时给培养液中加入胰岛素、三腆甲腺原氨酸(triiodothyronine) 和胎牛血清和胎牛血清,10 -15 d后大部分拟胚体分化为后大部分拟胚体分化为脂肪细胞脂肪细胞。脂肪细。脂肪细胞中的脂滴含有甘油三酯胞中的脂滴含有甘油三酯(triglycerides),很容易用油红很容易用油红O (oil red O)染色鉴定染色鉴定,显示特异
67、性红色。显示特异性红色。l小鼠小鼠ES细胞通过形成拟胚体并结合添加转化生长因子家族细胞通过形成拟胚体并结合添加转化生长因子家族(如如TGF1 ,BMP-2和和BMP-4)可诱导分化为表达软骨相关基因和蛋白的可诱导分化为表达软骨相关基因和蛋白的软骨细胞。软骨细胞。ROSA-geo基因转染的小鼠基因转染的小鼠ES细胞细胞,在缺乏在缺乏G418的的情况下聚集成拟胚体。用情况下聚集成拟胚体。用10%小牛血清代替胎牛血清小牛血清代替胎牛血清,培养液培养液中含有分化诱导剂中含有分化诱导剂1mol/L地塞米松地塞米松(dexamethasone),2 - 3 d更换更换培养液培养液,50 d后后,这种拟胚体
68、发育成软骨细胞这种拟胚体发育成软骨细胞,经经Alcian blue液液染色染色,显示出明确的软骨细胞特征显示出明确的软骨细胞特征,细胞间存在着细胞间存在着11型胶原。型胶原。 五摄找演又隔爽瞧沃擒抠秃烦恫毅励私铬冕蜡母悠吊惯丘烘鱼弹茁佩具纬A-第15章 干细胞A-第15章 干细胞l小鼠小鼠ES细胞经过拟胚体阶段细胞经过拟胚体阶段,结合无血清和多种生长因子、有结合无血清和多种生长因子、有丝分裂原处理丝分裂原处理,可被诱导分化为分泌胰岛素的、类似胰岛的结可被诱导分化为分泌胰岛素的、类似胰岛的结构。近来利用人构。近来利用人ES细胞经过悬浮培养获得胚体细胞经过悬浮培养获得胚体,再经如再经如bFGF等生
69、长因子诱导可分化为以产生胰岛素为特征的等生长因子诱导可分化为以产生胰岛素为特征的胰岛胰岛样细胞样细胞。lES细胞定向诱导分化为细胞定向诱导分化为肝细胞肝细胞。用。用RA、肝细胞生长因子、肝细胞生长因子 (HGF)、-神经生长因子神经生长因子(-NGF)共同添加至细胞培养液共同添加至细胞培养液,被诱导分化被诱导分化细胞从形态学、生化和肝细胞功能性标记等指标都证明是具有细胞从形态学、生化和肝细胞功能性标记等指标都证明是具有功能性的肝细胞。但仅使用功能性的肝细胞。但仅使用RA,虽能分化为上皮样细胞虽能分化为上皮样细胞,可并可并不表达各种肝功能的生化指标不表达各种肝功能的生化指标,例如例如,白蛋白、白
70、蛋白、AFP、G-6-P、1-AT、肝核因子、肝核因子-4和和SAPK/ERK激酶激酶-1 (SEK1)等等,表明表明 HGF和和-NGF是诱导小鼠是诱导小鼠ES细胞分化为功能性肝细胞的重要因子。细胞分化为功能性肝细胞的重要因子。祷访脏鸳妒串塘祷治牵玲饼定垣多橡免候腆析粘撬渠凛构萧茬翁勾割坞晕A-第15章 干细胞A-第15章 干细胞l第三节第三节 成体干细胞成体干细胞l20世纪初世纪初, Pappenheim根据对骨髓中的造血细胞发生过程的形根据对骨髓中的造血细胞发生过程的形态学观察态学观察,提出了骨髓中存在着未分化干细胞的设想提出了骨髓中存在着未分化干细胞的设想,认为未分认为未分化的干细胞通
71、过各个中间阶段的前体细胞最终生成成熟的多种化的干细胞通过各个中间阶段的前体细胞最终生成成熟的多种类型血细胞。首次提出了类型血细胞。首次提出了成体干细胞成体干细胞(adult stem cell)的概念。的概念。l成体干细胞是一群分布在成体组织中尚未分化的、具有自我更成体干细胞是一群分布在成体组织中尚未分化的、具有自我更新潜能并负有构建和补充某种组织的各种类型细胞的干细胞新潜能并负有构建和补充某种组织的各种类型细胞的干细胞,故又名故又名组织干细胞组织干细胞。l成体组织中存在干细胞是个体发育进化史的产物成体组织中存在干细胞是个体发育进化史的产物, 涉及组织器涉及组织器官的再生能力和创伤修复等基本特
72、性官的再生能力和创伤修复等基本特性。如骨髓组织的造血干细。如骨髓组织的造血干细胞可分裂、分化为血液系统的各种细胞胞可分裂、分化为血液系统的各种细胞,定期补充细胞成分或定期补充细胞成分或失血。小肠和皮肤中的干细胞也分别能分化、补充和更新小肠失血。小肠和皮肤中的干细胞也分别能分化、补充和更新小肠和皮肤组织的一些细胞。和皮肤组织的一些细胞。 驶省澈迁提掣醋辣珊阴贼襄针认束懂哗辖忌泣算赌恃具肖肺寓情鸣步扫离A-第15章 干细胞A-第15章 干细胞l传统的观点传统的观点认为认为,干细胞一旦分化成熟干细胞一旦分化成熟,就不再分裂增殖了就不再分裂增殖了;人人体除了血液、皮肤、消化管上皮和肝脏的组织干细胞有一
73、定的体除了血液、皮肤、消化管上皮和肝脏的组织干细胞有一定的再生能力外再生能力外,其他组织器官如神经组织基本上不再具有再生能其他组织器官如神经组织基本上不再具有再生能力力.同时也认为在成体中存在的属于某组织器官的成体干细胞同时也认为在成体中存在的属于某组织器官的成体干细胞是是专能或限能专能或限能的的,如造血干细胞只能分化为血液系统的各种细如造血干细胞只能分化为血液系统的各种细胞等胞等.l新近的研究表明新近的研究表明,这些这些成体干细胞的发育潜能可跨越组织或胚成体干细胞的发育潜能可跨越组织或胚层的界限层的界限。如从成年小鼠脑组织分离的神经干细胞移植入经。如从成年小鼠脑组织分离的神经干细胞移植入经X
74、射线照射过的小鼠骨髓部位射线照射过的小鼠骨髓部位,则分化出血液细胞。此后则分化出血液细胞。此后,发现人发现人和小鼠的神经干细胞具有分化为肌细胞和胚胎多种组织细胞的和小鼠的神经干细胞具有分化为肌细胞和胚胎多种组织细胞的潜能潜能.l因此因此,神经干细胞同样具有可塑性神经干细胞同样具有可塑性,能分化为非神经类型的细胞能分化为非神经类型的细胞.人们把成体干细胞具有跨越组织或胚层分化的这一特性称为人们把成体干细胞具有跨越组织或胚层分化的这一特性称为干干细胞的可塑性细胞的可塑性(plasticity)或跨越分化或跨越分化(transdifferentiation).霹症烯殉条赋糖采龙塑袜腹蘑信竟劫荒唁爬毅
75、服危吓报臆意块彬蹄拈惶烟A-第15章 干细胞A-第15章 干细胞l成体干细胞分化的多能性表明：细胞的命运不是一成不变的成体干细胞分化的多能性表明：细胞的命运不是一成不变的,这为许多疾病的细胞治疗提供了新的思路和有希望的前景。这为许多疾病的细胞治疗提供了新的思路和有希望的前景。l成体干细胞是一种处于尚未终末分化的、处于干成体干细胞是一种处于尚未终末分化的、处于干/祖或前体细祖或前体细胞状态的成体细胞胞状态的成体细胞,它来源于成年和未成年个体的组织干细胞。它来源于成年和未成年个体的组织干细胞。在正常生理条件下在正常生理条件下,倾向于分化成并更新所在组织的各种细胞。倾向于分化成并更新所在组织的各种细
76、胞。但在特定的外界条件诱导下但在特定的外界条件诱导下,一种组织的成体干细胞能超越该一种组织的成体干细胞能超越该特定组织、胚层分化成其他组织的功能性细胞特定组织、胚层分化成其他组织的功能性细胞,补充参与其他补充参与其他组织损伤的修复等。组织损伤的修复等。l一、成体干细胞具分化可塑性一、成体干细胞具分化可塑性l成体干细胞具有可塑性成体干细胞具有可塑性(plasticity).证据大多数来自小鼠的实验证据大多数来自小鼠的实验,人们确信机体中成体干细胞的可塑性现象具有普遍性。人们确信机体中成体干细胞的可塑性现象具有普遍性。 欺粤屏萤除骆猿芦皱腻寇敢近纂歇龄督虏勉难侮绕冀盅蛊显知躇滥柏茎狐A-第15章
77、干细胞A-第15章 干细胞l(一一)骨髓干细胞骨髓干细胞l骨髓是由不同类型多种细胞成分组成的组织骨髓是由不同类型多种细胞成分组成的组织,除了分化的血细除了分化的血细胞和间质细胞外胞和间质细胞外, 有二类成体干细胞：一类是有二类成体干细胞：一类是造血干细胞造血干细胞(hematopoietic stem cell, HSC),能生成各种血细胞能生成各种血细胞;另一类是另一类是间质干细间质干细胞胞(mesenchymal stem cell, MSC),能生成内皮细胞、脂肪细胞和成纤维能生成内皮细胞、脂肪细胞和成纤维细胞等。细胞等。l通过全骨髓移植实验证明通过全骨髓移植实验证明,骨髓中的细胞在不同
78、微环境的位点骨髓中的细胞在不同微环境的位点,除形成各种血细胞和衍生于间质干细胞的各类细胞外除形成各种血细胞和衍生于间质干细胞的各类细胞外,还可被还可被诱导分化为神经细胞、肌细胞、骨和肝细胞等外、中、内诱导分化为神经细胞、肌细胞、骨和肝细胞等外、中、内3个个胚层的不同类型的分化细胞胚层的不同类型的分化细胞(表表19.4)。证明骨髓组织中含有的干证明骨髓组织中含有的干细胞具有多潜能性细胞具有多潜能性,在特定的条件下可跨越组织或胚层分化的在特定的条件下可跨越组织或胚层分化的能力能力,能够分化为内皮、神经元、胶质细胞和肝细胞等。能够分化为内皮、神经元、胶质细胞和肝细胞等。l目前已知骨髓中存在目前已知骨
79、髓中存在造血干细胞造血干细胞(HSC)和和间质干细胞间质干细胞(MSC)两类干两类干细胞细胞,为区别这两类干细胞在分化潜能上的不同为区别这两类干细胞在分化潜能上的不同,便把骨髓干细便把骨髓干细胞分离和纯化。体外培养的骨髓细胞胞分离和纯化。体外培养的骨髓细胞,HSC细胞呈悬浮集落生长细胞呈悬浮集落生长;而而MSC细胞则贴壁生长。两者都具有多潜能性。细胞则贴壁生长。两者都具有多潜能性。 棋勤位珊羹鬃绊福拔侨俭围秆汐索躲能沿土嘻我禁刺载二乞吗梳盅糠醚墙A-第15章 干细胞A-第15章 干细胞l1.间质干细胞间质干细胞lMSC细胞在体外单独培养细胞在体外单独培养,证明具有分化为包括骨细胞、软骨证明具有
80、分化为包括骨细胞、软骨细胞、腱、脂肪细胞和肌细胞等潜能细胞、腱、脂肪细胞和肌细胞等潜能,也能分化成内皮细胞和也能分化成内皮细胞和内胚层的肝细胞。内胚层的肝细胞。MSC细胞移植至脑中细胞移植至脑中,可分化为非间质细胞可分化为非间质细胞性质的神经细胞。当性质的神经细胞。当MSC细胞注射入早期囊胚细胞注射入早期囊胚,然后移植入假然后移植入假孕母鼠孕母鼠,分析嵌合体动物分析嵌合体动物,发现发现MSC细胞可参与大多数体细胞细胞可参与大多数体细胞类型的分化类型的分化;当当MSC细胞移植入正常宿主时细胞移植入正常宿主时,则除了肝、肺和则除了肝、肺和肠的上皮外肠的上皮外,主要分化为造血细胞的谱系世代。当主要分
81、化为造血细胞的谱系世代。当MSC细胞移细胞移植入小量射线照射的宿主植入小量射线照射的宿主,则造血系统和胃肠道组织有所增加。则造血系统和胃肠道组织有所增加。l2.造血干细胞造血干细胞lHSC细胞是研究得最早和最多的一种异质性很强的干细胞。已细胞是研究得最早和最多的一种异质性很强的干细胞。已知知HSC细胞表面存在着一些标志细胞表面存在着一些标志,可用流式细胞仪或免疫磁性可用流式细胞仪或免疫磁性分选技术从骨髓细胞中分离和纯化出分选技术从骨髓细胞中分离和纯化出HSC细胞。经移植至不同细胞。经移植至不同的体内微环境的体内微环境,可分化为三胚层的各种类型细胞可分化为三胚层的各种类型细胞,包括心肌、骨包括心
82、肌、骨骼肌、血管内皮系统骼肌、血管内皮系统,肝细胞、肺泡、食管、肠肝细胞、肺泡、食管、肠 道、胃、胆管道、胃、胆管以及皮肤和神经细胞等。以及皮肤和神经细胞等。l因此因此,骨髓中的骨髓中的HSC与与MSC一样一样,分化潜能具有很大的可塑性分化潜能具有很大的可塑性,可分化为跨越胚层的各种类型细胞。可分化为跨越胚层的各种类型细胞。谢撑众秽疼赎彭砧瘸这浇惯职纱忠赂证碉狙日缩讹肤诞欺山求忠鄙领专滩A-第15章 干细胞A-第15章 干细胞l(二二)神经干细胞神经干细胞l神经发育过程中未成熟的、增殖中的各类细胞称为神经前体细神经发育过程中未成熟的、增殖中的各类细胞称为神经前体细胞胞(progenitor c
83、ell).神经干细胞是神经系统中一类能自我更新并产神经干细胞是神经系统中一类能自我更新并产生神经元和神经胶质细胞的前体细胞生神经元和神经胶质细胞的前体细胞.早期研究确证胚胎的神经早期研究确证胚胎的神经系统中普遍存在着这类神经干细胞系统中普遍存在着这类神经干细胞.其后其后,进行成体神经干细胞进行成体神经干细胞分离分离,发现成体神经干细胞主要存在中枢神经系统的发现成体神经干细胞主要存在中枢神经系统的2个神经发个神经发生区域：即脑的海马区生区域：即脑的海马区(hippocampus)和次脑窒区和次脑窒区(subventricular zone, SVZ )以及包括脊髓等其他一些非神经性的区域以及包括
84、脊髓等其他一些非神经性的区域.l神经干细胞或神经前体细胞在个体发育过程中神经干细胞或神经前体细胞在个体发育过程中,经受发育上的时经受发育上的时空变化空变化,成体神经干细胞的可塑性受到限制。通过个体不同发育成体神经干细胞的可塑性受到限制。通过个体不同发育阶段的神经干细胞移植至宿主不同部位阶段的神经干细胞移植至宿主不同部位, 发现神经干细胞移植发现神经干细胞移植物分化为神经细胞的潜能具有发育阶段的依赖性物分化为神经细胞的潜能具有发育阶段的依赖性,成体中的神经成体中的神经干细胞分化潜能随发育遂受到限制干细胞分化潜能随发育遂受到限制。镀研双卡桥八登莽拔衫影失弛轩稠琴伏穗曹绿拐统有口致舷撩箕丸力凰族A-
85、第15章 干细胞A-第15章 干细胞l用成体中枢神经系统的干细胞经体外培养扩增的移植实验表明用成体中枢神经系统的干细胞经体外培养扩增的移植实验表明,其在成体微环境中尚有一定的可塑性其在成体微环境中尚有一定的可塑性。如成体脊髓衍生的干细。如成体脊髓衍生的干细胞通常不产生神经元胞通常不产生神经元,若注人成体脑的海马区若注人成体脑的海马区,则能产生神经元则能产生神经元;成年海马衍生的干细胞移植入成年海马衍生的干细胞移植入SVZ,则能产生嗅球神经元。然则能产生嗅球神经元。然而而,至今却没有直接证据表明成体神经干细胞分化为如在胚胎至今却没有直接证据表明成体神经干细胞分化为如在胚胎中正常产生的有突触的神经
86、元。中正常产生的有突触的神经元。l研究表明研究表明,把体外培养的把体外培养的SVZ干细胞生长成神经球通过注射入干细胞生长成神经球通过注射入鸡胚神经嵴鸡胚神经嵴 (neural crest)途径途径,其分化潜能有所扩大其分化潜能有所扩大,可产生周围可产生周围神经系统。另外神经系统。另外,神经干细胞的子代也有可能恢复发育多潜能神经干细胞的子代也有可能恢复发育多潜能性。如通常唯一产生神经胶质细胞的视神经性。如通常唯一产生神经胶质细胞的视神经O2A中枢前体细胞中枢前体细胞在体外可恢复其多能的、产生中枢神经系统的干细胞。表明环在体外可恢复其多能的、产生中枢神经系统的干细胞。表明环境因子能改变神经干细胞的
87、命运或增加其可塑性。境因子能改变神经干细胞的命运或增加其可塑性。衅罕歪芭安蠢廖分钩租报俄酸簿非蛾汽客勾庸脚酶胡聘乞勋赂湾顾忙赦焚A-第15章 干细胞A-第15章 干细胞l(三三)肝干细胞肝干细胞l由于肝干细胞本身缺乏特异性标志由于肝干细胞本身缺乏特异性标志,给肝干细胞分离和鉴定带来了困难。给肝干细胞分离和鉴定带来了困难。l早在早在58年年, Wilson JW等人认为等人认为“肝组织中存在着干细胞肝组织中存在着干细胞”,依依据是肝组织因营养损伤或部分切除时仍能再生据是肝组织因营养损伤或部分切除时仍能再生,但已存在的肝细但已存在的肝细胞不能分裂和再生胞不能分裂和再生, 新生的肝细胞只能来源于肝干
88、细胞。化学致新生的肝细胞只能来源于肝干细胞。化学致癌实验时癌实验时,位于门管周围的小细胞发生增殖位于门管周围的小细胞发生增殖,这种具有卵圆形细这种具有卵圆形细胞核、少细胞质的细胞称为胞核、少细胞质的细胞称为卵圆形细胞卵圆形细胞(oval cell)。在人肝组织中在人肝组织中,同样发现这种卵圆形细胞。对发育中的肝具有自我更新能力的同样发现这种卵圆形细胞。对发育中的肝具有自我更新能力的细胞进行单克隆培养和分析细胞进行单克隆培养和分析,证明这种卵圆形细胞在体外能大量证明这种卵圆形细胞在体外能大量增殖增殖,细胞移植后在形态和功能上可分别分化为肝细胞和胆管上细胞移植后在形态和功能上可分别分化为肝细胞和胆
89、管上皮细胞皮细胞,表明表明肝卵圆形细胞是肝干细胞肝卵圆形细胞是肝干细胞.l近来发现近来发现,骨髓和血液中的细胞能分化为肝细胞骨髓和血液中的细胞能分化为肝细胞.l肝干细胞来源可能有两条途径：一是肝组织外肝干细胞来源可能有两条途径：一是肝组织外, 骨髓和血液是卵骨髓和血液是卵圆形细胞的来源圆形细胞的来源,人的骨髓细胞也能分化为肝细胞和胆管上皮细人的骨髓细胞也能分化为肝细胞和胆管上皮细胞胞;二是肝组织内处于休眠期的肝干细胞。双潜能的肝干细胞同二是肝组织内处于休眠期的肝干细胞。双潜能的肝干细胞同时表达肝细胞和胆上皮细胞的标志物时表达肝细胞和胆上皮细胞的标志物,细胞角蛋白细胞角蛋白CK7 和和CK19为
90、胆上皮细胞的特异性标志为胆上皮细胞的特异性标志;白蛋白和肝代谢酶细胞色素白蛋白和肝代谢酶细胞色素P450可可作为肝细胞的特异性标志物作为肝细胞的特异性标志物;而细胞角蛋白而细胞角蛋白CK8和和CK18在肝实在肝实质细胞和胆上皮细胞都有表达。质细胞和胆上皮细胞都有表达。笨翁充迹间寇撒佩错屠铅伎惯闺填奢夫郭珐娥烹乡血蠢澡枕竹包笆股靡枷A-第15章 干细胞A-第15章 干细胞l肝干细胞一般除了其特有的形态学外肝干细胞一般除了其特有的形态学外,常结合上述特有标志通常结合上述特有标志通过免疫组织化学、流式细胞检测和原位杂交等方法予以鉴定。过免疫组织化学、流式细胞检测和原位杂交等方法予以鉴定。l双潜能卵圆
91、形细胞不仅能分化为肝细胞和胆管上皮细胞双潜能卵圆形细胞不仅能分化为肝细胞和胆管上皮细胞,当分当分别移植到胰腺和十二指肠时别移植到胰腺和十二指肠时,还能跨越组织各自分化为胰腺细还能跨越组织各自分化为胰腺细胞和肠上皮细胞。表明胞和肠上皮细胞。表明肝干细胞在适当的微环境能被诱导分化肝干细胞在适当的微环境能被诱导分化为内胚层其他组织的细胞为内胚层其他组织的细胞.l卵圆形细胞异常分化或分化突然停止有可能发生肝细胞癌。卵圆形细胞异常分化或分化突然停止有可能发生肝细胞癌。l在培养液添加适当的分化诱导剂在培养液添加适当的分化诱导剂,如丁酸钠或二甲基亚矾如丁酸钠或二甲基亚矾,可诱可诱导和促进肝干细胞分化为肝细胞
92、。在培养液中添加转化生长因导和促进肝干细胞分化为肝细胞。在培养液中添加转化生长因子子(TGF)或肝细胞生长因子或肝细胞生长因子(HGF) ,可诱导肝干细胞分化为胆可诱导肝干细胞分化为胆管上皮细胞。管上皮细胞。崇铃粟牛术详赫铆碰愈宇死压枣忆荆媒施逝始个郸撤烫知又擅雀勃尤遂儿A-第15章 干细胞A-第15章 干细胞l(四四)骨骼肌干细胞骨骼肌干细胞l肌肉的生长、更新和修复是与肌纤维周围的肌肉的生长、更新和修复是与肌纤维周围的卫星细胞卫星细胞(satellite cells)有关有关, 一般认为这就是骨骼肌干细胞。一般认为这就是骨骼肌干细胞。l从肌肉分离的干细胞不仅能分化出肌肉从肌肉分离的干细胞不仅
93、能分化出肌肉,还能产生血液细胞成还能产生血液细胞成分分. Jiang等人从等人从3天龄的新生小鼠前后肢近端分离和体外培养天龄的新生小鼠前后肢近端分离和体外培养骨骼肌细胞骨骼肌细胞,得到一类得到一类多能成年前体细胞多能成年前体细胞(multipotent adult progenitor cells, MAPC)的细胞。这种细胞具有类似于小鼠骨髓的细胞。这种细胞具有类似于小鼠骨髓MAPC的表型的表型和特征和特征,能在体外增殖。肌肉来源的能在体外增殖。肌肉来源的MAPC在体外特定的细胞在体外特定的细胞因子条件下可被诱导分化成内皮、肝细胞样细胞和包括进一步因子条件下可被诱导分化成内皮、肝细胞样细胞和
94、包括进一步分化为神经元及神经胶质样细胞的神经外胚层细胞。表明骨骼分化为神经元及神经胶质样细胞的神经外胚层细胞。表明骨骼肌组织中确实存在着干细胞肌组织中确实存在着干细胞,并具有分化的可塑性。并具有分化的可塑性。 盆见优庐嘿忘塑黑潘乡鸯楷巳闭亩侨痛趴甄亲社迹邵粕押臃扒村静禾诀桑A-第15章 干细胞A-第15章 干细胞l二、成体干细胞研究中的问题二、成体干细胞研究中的问题l(一一)异质性异质性l成体干细胞在组织中的含量极少成体干细胞在组织中的含量极少,又缺乏特异性检测标志又缺乏特异性检测标志,很难很难从组织中将其分离纯化出来。从组织中将其分离纯化出来。l在一些成体干细胞在一些成体干细胞“可塑性可塑性
95、”的实验中的实验中,人们质疑所谓人们质疑所谓“可塑可塑性性”可能是组织中混杂着几种或一群不同类型的干细胞而分化可能是组织中混杂着几种或一群不同类型的干细胞而分化的结果的结果,这在骨髓组织的干细胞实验中更为明显。在肝细胞谱这在骨髓组织的干细胞实验中更为明显。在肝细胞谱系分化的各类祖细胞中系分化的各类祖细胞中,就发现存在着就发现存在着异质性异质性(heterogeneity)和和可塑性可塑性。l干细胞的异质性在遗传学中是指由于不同遗传机制而产生相同干细胞的异质性在遗传学中是指由于不同遗传机制而产生相同或类似的表型或类似的表型。异质性在某种程度上是干细胞固有的特性。造。异质性在某种程度上是干细胞固有
96、的特性。造血干细胞异质性早已被证明。从骨骼肌干细胞的研究中发现血干细胞异质性早已被证明。从骨骼肌干细胞的研究中发现,这类所谓的肌干细胞在特定环境下分别分化出肌肉和血细胞这类所谓的肌干细胞在特定环境下分别分化出肌肉和血细胞,其实这是由含有两类分化方向完全不同的干细胞所致。其实这是由含有两类分化方向完全不同的干细胞所致。熬雇殆穗页川妹莽邑谭铰坷踌昼矛搞椿本开仅签款唬哈瞬乳盖溯怎窘左绘A-第15章 干细胞A-第15章 干细胞l(二二)干细胞所处的环境干细胞所处的环境l小鼠造血干细胞和胰腺干细胞都能分化出肝细胞并能修复小鼠小鼠造血干细胞和胰腺干细胞都能分化出肝细胞并能修复小鼠受损的肝组织。但是受损的肝
97、组织。但是,移植造血干细胞和胰腺干细胞对修复小移植造血干细胞和胰腺干细胞对修复小鼠受损肝组织的效果远远不如移植成熟肝细胞本身。看来鼠受损肝组织的效果远远不如移植成熟肝细胞本身。看来干细干细胞所处环境的信号对于细胞分化有重要影响胞所处环境的信号对于细胞分化有重要影响。l特殊稳定的微环境可以控制造血干细胞生长和分化特殊稳定的微环境可以控制造血干细胞生长和分化,这种微环这种微环境在早期被称为壁龛境在早期被称为壁龛(niche)。现在现在微环境微环境定义为定义为能容纳一个或能容纳一个或多个干细胞并能控制其自我更新和分化的组织细胞和胞外基质多个干细胞并能控制其自我更新和分化的组织细胞和胞外基质的组合的组
98、合。l将视网膜祖细胞分离出来在体外培养一些时间后将视网膜祖细胞分离出来在体外培养一些时间后,分化为视网分化为视网膜感受器细胞。如果从小鼠眼中分离的干细胞移植入正常小鼠膜感受器细胞。如果从小鼠眼中分离的干细胞移植入正常小鼠视网膜视网膜,它们将不能分化和被整合入正常视网膜它们将不能分化和被整合入正常视网膜;而当移植入损而当移植入损伤的视网膜中伤的视网膜中,则分化为感受器细胞则分化为感受器细胞,并整合入该受损组织并整合入该受损组织,表表明组织环境确实对干明组织环境确实对干/祖细胞的命运有决定性的作用祖细胞的命运有决定性的作用.l脊髓产生的运动神经元具有对来自各组织的信号具有反应的能脊髓产生的运动神经
99、元具有对来自各组织的信号具有反应的能力力;从鼠脑中获取的神经干细胞在体外因中断了来自大脑的信从鼠脑中获取的神经干细胞在体外因中断了来自大脑的信号刺激号刺激,在体外培养条件下在体外培养条件下,只能一过性地分化为多巴胶能神经只能一过性地分化为多巴胶能神经元元,不能维持长久的多巴胶能神经元的功能。不能维持长久的多巴胶能神经元的功能。干细胞与所处细干细胞与所处细胞环境之间的协调作用可能是干细胞胞环境之间的协调作用可能是干细胞可塑性可塑性的重要原因的重要原因. 着壮奖髓红晒自抱汽步乃拟饶肯踏者宪洋保恃酿那稳柿医廷誉赣曰鳃喜倍A-第15章 干细胞A-第15章 干细胞l(三三)成体干细胞可塑性的调控成体干细
100、胞可塑性的调控l成体干细胞成体干细胞“可塑性可塑性”的解说有的解说有4种：种：l机体中存在着多种来源和不同分化方向的成体干细胞群体机体中存在着多种来源和不同分化方向的成体干细胞群体,分别能定向地向各自的组织来源的细胞分化。分别能定向地向各自的组织来源的细胞分化。l机体中存在着一种多潜能的成体干细胞机体中存在着一种多潜能的成体干细胞,在不同的微环境信在不同的微环境信号的刺激下号的刺激下,可向不同组织的细胞方向分化可向不同组织的细胞方向分化.l某特定组织来源的成体干细胞某特定组织来源的成体干细胞,除了向该组织的细胞成分分除了向该组织的细胞成分分化外化外,在特殊信号的剌激下在特殊信号的剌激下,可重新
101、编程可重新编程(reprogramming),继续分化继续分化为其他类型的细胞。为其他类型的细胞。l某种成体干细胞与特定组织来源的干细胞发生融合某种成体干细胞与特定组织来源的干细胞发生融合,成为具成为具有来自有来自2种细胞的遗传物质种细胞的遗传物质,染色体数量也是正常染色体数量也是正常2倍的倍的“杂交杂交细胞细胞”.l成熟的干细胞也许无法变成不同类型的细胞成熟的干细胞也许无法变成不同类型的细胞,但它们可自动与但它们可自动与现有的干细胞融合现有的干细胞融合,形成其他组织类型的细胞。如神经干细胞形成其他组织类型的细胞。如神经干细胞与造血干细胞融合与造血干细胞融合,从而从而变性变性为血液干细胞为血液
102、干细胞,分化为各类血细分化为各类血细胞。胞。育铝捅霸挥线诈詹胎扇荐响澜珠楞涂谢砰湛柔槐汤氛阮饺规炮喳膏帐父地A-第15章 干细胞A-第15章 干细胞l干细胞的干细胞的可塑性可塑性一方面与其所处微环境密切相关一方面与其所处微环境密切相关,即受到外即受到外源性因素调控源性因素调控;另一方面也受到成体干细胞本身对这类外来信另一方面也受到成体干细胞本身对这类外来信号做出反应的固有特性即内源性因子调控。号做出反应的固有特性即内源性因子调控。l在内源性调控机制中在内源性调控机制中,一般认为转录因子在其中起着重要的作一般认为转录因子在其中起着重要的作用。细胞分化中用。细胞分化中,一个已明确定向分化程序的谱系
103、特异性转录一个已明确定向分化程序的谱系特异性转录因子过表达会致使该谱系特异性转录因子功能发生颉顽作用因子过表达会致使该谱系特异性转录因子功能发生颉顽作用,并使原有的基因程序活性保持沉默。这样并使原有的基因程序活性保持沉默。这样,这类细胞对微环境这类细胞对微环境中特定细胞因子的反应是分化成另一类新细胞。如在成肌细胞中特定细胞因子的反应是分化成另一类新细胞。如在成肌细胞分化中分化中,转录因子转录因子MyoD和和Myf5起着调控成肌细胞调控因子起着调控成肌细胞调控因子(myogenic regulatory factor, MRF)网络中的颉顽作用。在成纤维细胞网络中的颉顽作用。在成纤维细胞中中,
104、MyoD的过表达可致使这类细胞转变为成肌细胞的过表达可致使这类细胞转变为成肌细胞,同时同时, Myf 5又抑制成肌细胞的分化活性。但在某些情况下又抑制成肌细胞的分化活性。但在某些情况下,这一过程这一过程却是可逆的。在转基因却是可逆的。在转基因C2C12细胞的肌管形成中细胞的肌管形成中,同源异形框同源异形框基因的异位表达降低了成肌细胞调控因子基因的异位表达降低了成肌细胞调控因子MRF和和MyoD表达水表达水平平,致使多核的肌管去分化而转变成单核的细胞致使多核的肌管去分化而转变成单核的细胞, 进一步再分进一步再分化为软骨细胞、脂肪细胞等中胚层类型的细胞。化为软骨细胞、脂肪细胞等中胚层类型的细胞。
105、型肄瓢鼓龙淡肥锐水窿慢铣局坪堪拢爆配塌罕夫回玛舞波艇挟殿宿箕屈坠A-第15章 干细胞A-第15章 干细胞l(四四)分化细胞的功能分化细胞的功能l目前在技术学上还无法证明成体干细胞在所移植的组织或器官目前在技术学上还无法证明成体干细胞在所移植的组织或器官中产生出来的细胞具有功能性中产生出来的细胞具有功能性.l如在研究帕金森氏病的动物实验中如在研究帕金森氏病的动物实验中,体外培养的多巴胶能神经体外培养的多巴胶能神经元移植入脑内元移植入脑内,可观察到被整合入动物脑组织可观察到被整合入动物脑组织,但不能证明这些但不能证明这些新的神经元是否具有完整的功能。因此新的神经元是否具有完整的功能。因此,欲欲要确
106、定供体干细胞要确定供体干细胞的终末分化状态应该包括细胞表面标志鉴别和细胞功能确定这的终末分化状态应该包括细胞表面标志鉴别和细胞功能确定这2方面因素方面因素。如神经干细胞移植后，。如神经干细胞移植后，可塑可塑为血细胞为血细胞,既要鉴定既要鉴定出分化细胞具有血细胞的表面标志出分化细胞具有血细胞的表面标志,又要肯定使已接受致死辐又要肯定使已接受致死辐射剂量照射过的受体小鼠存活并使造血功能恢复。射剂量照射过的受体小鼠存活并使造血功能恢复。矛厂贼剁庸胸瞬拓享缚榔铬走挨使谴英绰蒜驯轧氛皆敌这搁芜药源炒椰驰A-第15章 干细胞A-第15章 干细胞l(五五)体外增殖体外增殖l成体干细胞从某一组织分离、纯化后成
107、体干细胞从某一组织分离、纯化后,目前目前,尚未有现成的能较尚未有现成的能较长期在体外维持其未分化状态并大量长期在体外维持其未分化状态并大量 增殖的方法。增殖的方法。l大多数成体干细胞研究是用于再生医学作细胞治疗的目的大多数成体干细胞研究是用于再生医学作细胞治疗的目的,常常设计使用两种手段设计使用两种手段:一是将分离的成体干细胞直接移植入动物一是将分离的成体干细胞直接移植入动物或患者的损害组织器官或患者的损害组织器官,以期在受损组织原位分化出该组织中以期在受损组织原位分化出该组织中成熟的功能性的细胞成熟的功能性的细胞;二是在体外将干细胞诱导分化为所需要二是在体外将干细胞诱导分化为所需要的成熟细胞
108、的成熟细胞,而后将细胞移植入损害组织或器官。而后将细胞移植入损害组织或器官。l由于成体干细胞很难分离、纯化和体外培养由于成体干细胞很难分离、纯化和体外培养, 目前这两种手段目前这两种手段都不能奏效。如将烫伤患者的、含有皮肤干细胞的健康皮肤切都不能奏效。如将烫伤患者的、含有皮肤干细胞的健康皮肤切取下来取下来,进行短暂体外培养进行短暂体外培养,再重新植回患者的皮肤损害部位再重新植回患者的皮肤损害部位,发现尽管皮肤可愈合发现尽管皮肤可愈合,但不能产生汗腺和毛孔但不能产生汗腺和毛孔,无法行使正常功无法行使正常功能能.粟踢衬冤祝廊皋剖蒲待岔恋盯廖溶茧灾愉烟涝汐乡菏庸奢闪蔼乞段魔杖铝A-第15章 干细胞A
109、-第15章 干细胞l第四节第四节 干细胞在再生医学中的应用干细胞在再生医学中的应用l成体干细胞的成体干细胞的“可塑性可塑性”或或“跨越分化跨越分化”潜能的发现具有重要潜能的发现具有重要的理论意义和应用价值。不仅向传统的细胞分化和细胞周期理的理论意义和应用价值。不仅向传统的细胞分化和细胞周期理论提出了挑战论提出了挑战,而且成体干细胞在细胞生物学行为上与癌细胞而且成体干细胞在细胞生物学行为上与癌细胞很相似很相似,成了研究癌症发生机制新的生长点。成了研究癌症发生机制新的生长点。l在再生医学中可望利用成体干细胞修复创伤、疾病的细胞治疗在再生医学中可望利用成体干细胞修复创伤、疾病的细胞治疗并介入整形外科
110、学和组织工程学等方面并介入整形外科学和组织工程学等方面,其中除了神经干细胞其中除了神经干细胞作为脑损害的细胞治疗研究有较多的报道外作为脑损害的细胞治疗研究有较多的报道外,大部分工作集中大部分工作集中在组织工程学领域在组织工程学领域,干细胞在生物和再生医学中的应用主要有干细胞在生物和再生医学中的应用主要有下列下列4方面。方面。 腾能勿谦凑幅扳咒挡腰作项注琶致饶墒陛辗秒惨顾咱淹碾甄菩惧朽设欢剁A-第15章 干细胞A-第15章 干细胞l一、哺乳类发育的体外模型一、哺乳类发育的体外模型l干细胞干细胞(ES细胞细胞)因其富具独特的发育全能或多能性质因其富具独特的发育全能或多能性质,在嵌合体在嵌合体动物中
111、动物中,ES细胞又能参与个体发育细胞又能参与个体发育,并产生包括生殖系在内的各并产生包括生殖系在内的各种类型细胞种类型细胞,表明表明ES细胞类似胚胎的细胞类似胚胎的ICM细胞细胞,不仅具有完整的不仅具有完整的发育潜能性发育潜能性,而且也持有对调节正常发育所有信号的应答能力。而且也持有对调节正常发育所有信号的应答能力。l在特定的体外培养条件和诱导剂共同作用下在特定的体外培养条件和诱导剂共同作用下,ES细胞在体外可被细胞在体外可被诱导分化属于诱导分化属于3个胚层谱系的各种高度分化的体细胞个胚层谱系的各种高度分化的体细胞,如神经细如神经细胞、肌肉、血细胞、上皮细胞和成纤维细胞等。同时胞、肌肉、血细胞
112、、上皮细胞和成纤维细胞等。同时,在这些细在这些细胞分化过程中胞分化过程中,必然先经过一定的前体细胞阶段。必然先经过一定的前体细胞阶段。l因此因此,ES细胞不仅是研究特定类型细胞分化的模型细胞不仅是研究特定类型细胞分化的模型,而且也是研而且也是研究某些前体细胞起源和细胞谱系演变较理想的实验体系究某些前体细胞起源和细胞谱系演变较理想的实验体系.枕贾士硝甩蕴屠悦锭爷莉协辰泄儒妙鞠莫蓟胁挨残囚滋魏嵌俊涧鞍昧难稽A-第15章 干细胞A-第15章 干细胞l可能可能ES细胞体外分化途径和机制与在体胚胎的不完全相同细胞体外分化途径和机制与在体胚胎的不完全相同,但但在分子水平包括发育的遗传程序仍有共同或相似之处
113、。小鼠的在分子水平包括发育的遗传程序仍有共同或相似之处。小鼠的卵受精后的卵裂期较长卵受精后的卵裂期较长,约约 3天才到达天才到达16细胞期细胞期,进一步分裂进一步分裂,约在约在4.5 dpc时形成囊胚。这时胚胎出现第一次分化时形成囊胚。这时胚胎出现第一次分化,产生以后产生以后参与胚外结构的滋养外胚层和原始内胚层。胚泡内约由参与胚外结构的滋养外胚层和原始内胚层。胚泡内约由20个左个左右细胞组成内细胞团右细胞组成内细胞团(ICM)。胚胎进一步增殖和空腔化。胚胎进一步增殖和空腔化(cavitation),约在约在5.0 dpc时逐形成原始外胚层或上胚层时逐形成原始外胚层或上胚层(epiblast),
114、后者在原肠期除了主要发育成胎儿本体的后者在原肠期除了主要发育成胎儿本体的3个胚层组织外个胚层组织外,还有还有部分细胞将来参与胚外中胚层的发育。部分细胞将来参与胚外中胚层的发育。l悬浮生长的体外细胞拟胚体在结构排列上与在体胚体的有些不悬浮生长的体外细胞拟胚体在结构排列上与在体胚体的有些不同同,但一些类型的细胞分化秩序和方式却非常类似于在体的胚但一些类型的细胞分化秩序和方式却非常类似于在体的胚体。因此小鼠体。因此小鼠ES 细胞是研究哺乳类发育的理想模型。细胞是研究哺乳类发育的理想模型。l人人ES细胞建系后细胞建系后, 法律和道德伦理禁止用于人体胚胎研究法律和道德伦理禁止用于人体胚胎研究.但但近来认
115、识到近来认识到,ES细胞本身缺乏胚外组织细胞本身缺乏胚外组织,不可能产生完整的胚胎。不可能产生完整的胚胎。因此因此,许多国家在法律上禁止以克隆或复制人为目的的前提下许多国家在法律上禁止以克隆或复制人为目的的前提下,已允许将人已允许将人ES细胞类似于小鼠细胞类似于小鼠ES细胞的体外实验那样细胞的体外实验那样,用于研用于研究人类胚胎在体内所不能分析的发育、分化和调节信号等事件究人类胚胎在体内所不能分析的发育、分化和调节信号等事件.摆坞状力胰浴趴篇预罚贬灰荫瘟曲阔庞噬铡柑氦惠利硅蝶假饿锌椒宅联迈A-第15章 干细胞A-第15章 干细胞l二、介导改造动物的基因二、介导改造动物的基因lES细胞介导的转基
116、因优点明显超过常规如逆转录病毒载体整合细胞介导的转基因优点明显超过常规如逆转录病毒载体整合至早期胚胎或显微注射至早期胚胎或显微注射DNA至受精卵原核等一般转基因方法至受精卵原核等一般转基因方法, 因为在后一途径中因为在后一途径中,导人的多拷贝导人的多拷贝DNA存在着随意整合的问题存在着随意整合的问题,产生的转基因动物效果一般不太理想。产生的转基因动物效果一般不太理想。l利用利用ES细胞技术学的优点是在于产生一种新的经生殖系传递的细胞技术学的优点是在于产生一种新的经生殖系传递的转基因动物以前转基因动物以前,可通过在体外可通过在体外ES细胞系统中细胞系统中,研究和筛选外源研究和筛选外源DNA表达质
117、粒的构建、整合和表达。从而可提高产生转基因动表达质粒的构建、整合和表达。从而可提高产生转基因动物的效率物的效率;同时同时,ES细胞在体外增殖迅速细胞在体外增殖迅速,可作为重组可作为重组ES细胞取细胞取之不尽的来源之不尽的来源;ES细胞的基因改造技术细胞的基因改造技术,如剔除如剔除(knock out)、敲入敲入(knock in)能够精确地改造细胞内存在的基因能够精确地改造细胞内存在的基因,克服位置效应、插克服位置效应、插入失活和特殊内源性基因失活等弊病。重组入失活和特殊内源性基因失活等弊病。重组ES细胞的基因组经细胞的基因组经生殖系传递途径生殖系传递途径,可不断地提供和产生同样基因型的、丰富
118、的可不断地提供和产生同样基因型的、丰富的转基因动物的种子细胞来源。转基因动物的种子细胞来源。篇撤秧濒哼蹬薪瞥祭睦倒撩妒朝贤市通瘴翔竖搞奏银广然北胞丫舒材条抽A-第15章 干细胞A-第15章 干细胞l利用体外培养的体细胞经外源基因转染后利用体外培养的体细胞经外源基因转染后,取其细胞核显微注取其细胞核显微注射至去核卵细胞射至去核卵细胞,从而获得转基因动物从而获得转基因动物,这一技术路线比直接这一技术路线比直接显微注射显微注射DNA至去核卵细胞效果更好。至去核卵细胞效果更好。 l三、人体的基因和细胞治疗三、人体的基因和细胞治疗l干细胞生物学技术和理论的发展干细胞生物学技术和理论的发展,促使医学产生了
119、一门新的学促使医学产生了一门新的学科分支科分支,即即再生医学再生医学(regenerative medicine)。它是一门探索人体组它是一门探索人体组织和器官自身所具有的构建、更新和修复的能力织和器官自身所具有的构建、更新和修复的能力,并使用多种并使用多种修复术手段使人体的组织器官功能得以改善或恢复新兴学科。修复术手段使人体的组织器官功能得以改善或恢复新兴学科。干细胞的基因和细胞治疗则是再生医学的重要组成部分之一干细胞的基因和细胞治疗则是再生医学的重要组成部分之一.l基因治疗基因治疗是指用遗传改造过的人体细胞直接移植或输入患者是指用遗传改造过的人体细胞直接移植或输入患者体内体内,达到控制和治
120、愈疾病为目的的治疗手段达到控制和治愈疾病为目的的治疗手段,又称又称细胞治疗细胞治疗。人人ES细胞经遗传操作后一般能稳定地在体外增殖传代细胞经遗传操作后一般能稳定地在体外增殖传代,克服了克服了目前基因治疗中需大量靶细胞来源的主要问题。目前基因治疗中需大量靶细胞来源的主要问题。 踪舒晶涝收慈诲枚放判料藐观笑撕箍却谭谎接游乃讶傍癸房咀叫凋面毫移A-第15章 干细胞A-第15章 干细胞l四、组织工程的种子细胞来源四、组织工程的种子细胞来源l组织工程的核心是由种子细胞和生物活性材料构成的三维空间组织工程的核心是由种子细胞和生物活性材料构成的三维空间复合体复合体. l构建像心、肝、肾、肺等大型精细复杂的器
121、官还需要技术上的构建像心、肝、肾、肺等大型精细复杂的器官还需要技术上的突破突破,但作为构建组织、器官的基本单元但作为构建组织、器官的基本单元,具备足够数量并保持具备足够数量并保持特定生物学活性的特定生物学活性的种子细胞种子细胞则是组织工程最基本的要素。则是组织工程最基本的要素。l目前缺损组织或器官的修复主要有目前缺损组织或器官的修复主要有3种方法种方法,即即自体移植自体移植、异体异体移植移植和和组织代用品组织代用品。这。这3种方法都受到客观条件的限制种方法都受到客观条件的限制,自体移自体移植必须牺牲自身的正常器官植必须牺牲自身的正常器官,更何况自体的心、肝、膜等器官更何况自体的心、肝、膜等器官
122、独一无二独一无二,岂能移植岂能移植?异体移植不仅器官来源极有限异体移植不仅器官来源极有限,而且即使而且即使被移植后常易发生组织排斥反应被移植物不易成活。采用组织被移植后常易发生组织排斥反应被移植物不易成活。采用组织代用品如硅橡胶、不锈钢和镰铁合金等则与人体组织兼容性差代用品如硅橡胶、不锈钢和镰铁合金等则与人体组织兼容性差,效果不太理想。效果不太理想。l自体或异体移植的种子细胞尽管存在来源有限、易老化、不易自体或异体移植的种子细胞尽管存在来源有限、易老化、不易大量扩增以及取材对机体造成创伤等弊病大量扩增以及取材对机体造成创伤等弊病,在胚胎干细胞定向在胚胎干细胞定向诱导分化和免疫排斥反应等问题未解决之前诱导分化和免疫排斥反应等问题未解决之前,自体或异体的同自体或异体的同源干细胞仍是组织工程种子细胞较理想的来源之一。源干细胞仍是组织工程种子细胞较理想的来源之一。诫熄肮轴薄生抓疹若叙初证业辞摆挥色郸腮渣酉宦帜末者德拧既需鸽队适A-第15章 干细胞A-第15章 干细胞
