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1、肝细胞死亡的基础与临床研究肝细胞死亡的基础与临床研究同济医院感染性疾病研究所同济医院感染性疾病研究所同济医院感染科同济医院感染科宁琴宁琴 教授教授 内容内容肝细胞死亡的模式肝细胞死亡的模式肝细胞死亡与肝脏疾病肝细胞死亡与肝脏疾病 肝细胞死亡的调控肝细胞死亡的调控 结论1234 凋亡凋亡启动原因启动原因 死亡受体死亡受体/配体配体 DNA损伤损伤 生长因子缺乏生长因子缺乏主动过程主动过程程序性细胞死亡程序性细胞死亡 坏死坏死继发于继发于 重型病毒性肝炎重型病毒性肝炎 缺血缺血/再灌注损伤再灌注损伤 急性药物性肝炎急性药物性肝炎被动过程被动过程 显著的炎症反应显著的炎症反应 肝细胞死亡的模式肝细胞
2、死亡的模式 肝细胞死亡肝细胞死亡 细胞坏死与凋亡的形态区别细胞坏死与凋亡的形态区别 旧观点旧观点n凋亡与坏死被认为是两种截然不同的现象凋亡与坏死被认为是两种截然不同的现象 新观点新观点n凋亡与坏死是源于相同启动因素和信号转导途径凋亡与坏死是源于相同启动因素和信号转导途径的不同的细胞死亡方式，而的不同的细胞死亡方式，而线粒体功能损伤线粒体功能损伤在在这一过程中起到关键的连接作用。这一过程中起到关键的连接作用。 线粒体是细胞生命活动的控制中心线粒体是细胞生命活动的控制中心 氧化磷酸化中心 细胞凋亡调控中心 细胞呼吸链中心线粒体线粒体凋亡存在两条不同的信号传导途径凋亡存在两条不同的信号传导途径一类细
3、胞中含有足够的一类细胞中含有足够的Caspase8可被经典的死亡受体可被经典的死亡受体活化，直接激活效应活化，直接激活效应Caspase；另一类细胞其死亡受体介导的另一类细胞其死亡受体介导的Caspase8活化不能达到活化不能达到很高的水平，凋亡信号需要借助线粒体途径来放大，很高的水平，凋亡信号需要借助线粒体途径来放大，而而细胞色素细胞色素C的释放的释放是这一途径的关键步骤。是这一途径的关键步骤。 线粒体在凋亡中的作用线粒体在凋亡中的作用 缺血再灌注，肝细胞毒素（缺血再灌注，肝细胞毒素（N-乙乙酰苯醌亚胺酰苯醌亚胺 NAPQI ，胆酸，死亡受，胆酸，死亡受体活化等）体活化等） 集中作用于线粒体
4、，导集中作用于线粒体，导致其膜透化。致其膜透化。 Bcl2家族成员包括家族成员包括caspase 8 活活化形成的化形成的tBid,导致外膜透化。其透导致外膜透化。其透化可能包括外膜通道的形成或是线化可能包括外膜通道的形成或是线粒体肿胀破裂后诱导粒体肿胀破裂后诱导MPT。 其他应激因素可直接导致其他应激因素可直接导致MPT.膜膜透化后，细胞色素透化后，细胞色素C释放相继激活释放相继激活caspase 9 和和caspase 3，从而诱导从而诱导细胞凋亡细胞凋亡 。而由于线粒体功能的严。而由于线粒体功能的严重异常，重异常，ATP减少，减少，caspase 活化活化被阻断则会发生坏死被阻断则会发生
5、坏死。坏死和凋亡是线粒体透化的不同结果坏死和凋亡是线粒体透化的不同结果肝细胞死亡与肝脏疾病肝细胞死亡与肝脏疾病死亡受体死亡受体/配体诱导的肝细胞损伤配体诱导的肝细胞损伤1穿孔素穿孔素/颗粒酶诱导的肝细胞损伤颗粒酶诱导的肝细胞损伤2缺血缺血/缺氧诱导的肝细胞损伤缺氧诱导的肝细胞损伤3胆酸诱导的肝细胞损伤胆酸诱导的肝细胞损伤4药物诱导的肝细胞损伤药物诱导的肝细胞损伤51.死亡受体死亡受体/配体诱导的肝细胞损伤配体诱导的肝细胞损伤目前认为在肝脏中发挥重要作用的死亡受体主要包括目前认为在肝脏中发挥重要作用的死亡受体主要包括Fas、TNFR1及及TRAIL-R1/R2，后者与它们相应的配体，后者与它们相
6、应的配体FasL、TNF和和TRAIL结合后可诱导受体发生寡聚化并活结合后可诱导受体发生寡聚化并活化其胞内的死亡结构域，与相应的连接蛋白相互作用进化其胞内的死亡结构域，与相应的连接蛋白相互作用进而触发凋亡的级联反应。而触发凋亡的级联反应。1.死亡受体死亡受体/配体诱导的肝细胞损伤配体诱导的肝细胞损伤1.1.Fas/FasL诱导的肝细胞损诱导的肝细胞损伤伤2.2.TRAILR/TRAIL诱导的肝诱导的肝细胞损伤细胞损伤3.3.TNFR1/TNF诱导的肝细诱导的肝细胞损伤胞损伤1）Fas/FasL诱导的肝细胞损伤诱导的肝细胞损伤Fas在肝实质细胞、血窦内皮细胞、星状细胞及枯否氏在肝实质细胞、血窦内
7、皮细胞、星状细胞及枯否氏细胞上具有广泛的表达。细胞上具有广泛的表达。 自然杀伤细（自然杀伤细（NK）和细胞毒性）和细胞毒性T淋巴细胞（淋巴细胞（CTL）可通）可通过分泌过分泌FasL启动凋亡程序来清除病毒感染启动凋亡程序来清除病毒感染 的肝细胞或的肝细胞或肿瘤细胞。肿瘤细胞。NK细胞杀伤自身肝细胞的机制细胞杀伤自身肝细胞的机制Hepatology. 2004J Exp Med. 2007Hepatology. 2007CTL细胞对肝细胞的杀伤作用细胞对肝细胞的杀伤作用1）Fas/FasL诱导的肝细胞损伤诱导的肝细胞损伤 研究发现研究发现 乙型、丙型病毒性肝炎患者乙型、丙型病毒性肝炎患者体内可溶
8、性体内可溶性Fas的表达有所增加，且表达水的表达有所增加，且表达水平与疾病活动度及治疗应答反应相关。平与疾病活动度及治疗应答反应相关。 当当HCV特异性的特异性的FasL表达的表达的CTL被动移植至稳定表达被动移植至稳定表达HCV结构蛋白的结构蛋白的小鼠体内后，小鼠肝细胞出现损伤，血清谷丙转氨酶（小鼠体内后，小鼠肝细胞出现损伤，血清谷丙转氨酶（ALT）水平升高。）水平升高。在在HBV转基因小鼠转基因小鼠中，中，HBV特异性特异性CTL也能导致急性肝损伤甚至肝衰竭也能导致急性肝损伤甚至肝衰竭 酒精性肝炎患者酒精性肝炎患者的血清中可以发现其可溶性的血清中可以发现其可溶性Fas的表达也是上调的的表达
9、也是上调的 酒精和酒精和HCV病毒可在病毒可在Fas信号转导途径诱导的肝脏损伤中发挥协同作用信号转导途径诱导的肝脏损伤中发挥协同作用 非酒精性脂肪肝患者非酒精性脂肪肝患者中，其中，其Fas的表达和肝细胞凋亡的发生也是增加的。的表达和肝细胞凋亡的发生也是增加的。 Fas诱导的凋亡在诱导的凋亡在暴发性肝衰竭暴发性肝衰竭的发生发展中也占有一席之地的发生发展中也占有一席之地 2）TRAILR/TRAIL诱导的肝细胞损伤诱导的肝细胞损伤 研究发现研究发现病毒性肝炎患者病毒性肝炎患者中其血清中其血清TRAIL的表达水平显著增高；的表达水平显著增高；小鼠肝细胞在病毒感染小鼠肝细胞在病毒感染后也能诱导上调后也
10、能诱导上调TRAIL的表达，的表达，通过通过TRAILR/TRAIL途径诱导感染肝细胞的凋亡。途径诱导感染肝细胞的凋亡。Fas 和和 TRAIL 受体信号受体信号Fas 和和TRAIL 的死亡诱导信号复的死亡诱导信号复合物合物 (DISC) 类似类似. TRAILR1/TRAIL-R2或或Fas 与其与其配体配体 TRAIL或或FasL结合后，通结合后，通过与死亡结构域过与死亡结构域(DD)的同型反应的同型反应招募调节蛋白招募调节蛋白FADD。FADD 包含死亡效应结构域包含死亡效应结构域(DED)，可招募并分裂，可招募并分裂procaspase 8 和和10, 使其活化。使其活化。Caspa
11、se 8 将将Bid分裂为分裂为tBid，致使线粒体透化，功能失常和凋致使线粒体透化，功能失常和凋亡。亡。3）TNFR1/TNF诱导的肝细胞损伤诱导的肝细胞损伤正常肝细胞中正常肝细胞中TNFR1的表达水平很低，但的表达水平很低，但各种急慢性肝各种急慢性肝脏疾病中脏疾病中，TNFR1会在肝实质细胞、血窦内皮细胞和炎会在肝实质细胞、血窦内皮细胞和炎性浸润细胞中性浸润细胞中大量表达大量表达。除了诱导凋亡途径，除了诱导凋亡途径，TNF还能通过还能通过NFB依赖的基因表依赖的基因表达途径达途径促进肝细胞的增殖促进肝细胞的增殖，在部分肝切除后肝细胞的再，在部分肝切除后肝细胞的再生中起重要作用。生中起重要作
12、用。 TNFR表达过量时会导致肝细胞损伤加剧而肝脏再生失败。表达过量时会导致肝细胞损伤加剧而肝脏再生失败。 3）TNFR1/TNF诱导的肝细胞损伤诱导的肝细胞损伤在在肝脏移植肝脏移植中，供体与受体的中，供体与受体的TNFR1发挥相反的效应，发挥相反的效应，表现为供体表现为供体TNFR1的缺陷可加剧移植物的损伤，而受的缺陷可加剧移植物的损伤，而受体体TNFR1缺陷时肝损伤有所缓和且炎性细胞浸润减少。缺陷时肝损伤有所缓和且炎性细胞浸润减少。在在酒精性肝炎患者酒精性肝炎患者中，其血清中，其血清TNF和和TNFR1的水平的水平均上升并与死亡率相关。均上升并与死亡率相关。病毒性肝炎患者病毒性肝炎患者中，
13、其中，其TNF的水平与治疗应答反应呈的水平与治疗应答反应呈负相关。负相关。 TNFa a受体介导的信号受体介导的信号TNF与与TNFR结合后，与结合后，与TRADD, RIP, TRAF-2共同形成共同形成Complex I，激活，激活 NFkB 和和JNK. NFkB 激活某些激活某些survival gene(包括抗凋亡蛋白包括抗凋亡蛋白c-FLIP, IAPs, Bcl-XL和和 A1)的转录。的转录。 Complex I 经过修饰和内化形成经过修饰和内化形成Complex II (DISC) ,后通过与后通过与DD的相互作用及激活的相互作用及激活procaspase 8来招募来招募FA
14、DD（Fas相关死亡结构域）。活化的相关死亡结构域）。活化的 caspase 8 将将Bid （促凋亡蛋白）分裂为（促凋亡蛋白）分裂为 tBid, 转移至线粒体后导致其透化，功转移至线粒体后导致其透化，功能障碍及凋亡。能障碍及凋亡。2.穿孔素穿孔素/颗粒酶诱导的肝细胞损伤颗粒酶诱导的肝细胞损伤 穿孔素穿孔素(perforin)主要存在于主要存在于CTL和和NK细胞的细胞的胞浆中胞浆中,是是CTL和和NK细胞发挥细胞毒效应的另一细胞发挥细胞毒效应的另一重重要途径。要途径。 2.穿孔素穿孔素/颗粒酶诱导的肝细胞损伤颗粒酶诱导的肝细胞损伤穿孔素可在靶细胞膜上形穿孔素可在靶细胞膜上形成跨膜孔道成跨膜孔
15、道 1）引起细胞渗透性改）引起细胞渗透性改 变、钙离子内流和能变、钙离子内流和能 量的耗竭，导致靶细量的耗竭，导致靶细 胞融解和细胞死亡。胞融解和细胞死亡。 2）穿孔素形成的跨膜通）穿孔素形成的跨膜通 道可以使颗粒酶道可以使颗粒酶 （granzyme）进入靶）进入靶 细胞，颗粒酶进一步细胞，颗粒酶进一步 通过蛋白水解激活通过蛋白水解激活 Caspase家族的某些家族的某些 成员触发成员触发Caspase级级 联反应，导致靶细胞联反应，导致靶细胞 凋亡。凋亡。 2.穿孔素穿孔素/颗粒酶诱导的肝细胞损伤颗粒酶诱导的肝细胞损伤 研究发现，穿孔素在慢性乙肝肝细胞损伤中发研究发现，穿孔素在慢性乙肝肝细胞
16、损伤中发挥了重要的作用，也是慢性丙肝患者肝细胞损伤挥了重要的作用，也是慢性丙肝患者肝细胞损伤的主要效应分子。的主要效应分子。 3.缺血缺血/缺氧诱导的肝细胞损伤缺氧诱导的肝细胞损伤 1.1.缺血缺血- -再灌注损伤再灌注损伤 2.2.免疫凝血途径诱导的肝细胞坏死免疫凝血途径诱导的肝细胞坏死1）缺血）缺血-再灌注损伤再灌注损伤发生于肝脏的缺血发生于肝脏的缺血-再灌注损伤可分为两个阶段再灌注损伤可分为两个阶段:第一阶段第一阶段 反映了直接的肝细胞损伤。反映了直接的肝细胞损伤。第二阶段第二阶段 涉及到天然免疫系统的激活，特别是缺血后肝涉及到天然免疫系统的激活，特别是缺血后肝 脏枯否氏细胞的活化，以及
17、中性粒细胞、淋巴脏枯否氏细胞的活化，以及中性粒细胞、淋巴 细胞的炎性浸润。细胞的炎性浸润。缺血缺血-再灌注损伤再灌注损伤在肝细胞的体外热缺血在肝细胞的体外热缺血-再灌注损伤模型中再灌注损伤模型中 ，肝细胞急剧肿胀坏死。肝细胞急剧肿胀坏死。 体内肝脏发生缺血体内肝脏发生缺血-再灌注损伤后，其急性阶再灌注损伤后，其急性阶段也主要表现为肝细胞的坏死段也主要表现为肝细胞的坏死。 缺血缺血-再灌注损伤再灌注损伤其他观点其他观点 缺血缺血-再灌注损伤后，肝细胞的凋亡和坏死是再灌注损伤后，肝细胞的凋亡和坏死是并存的，损伤的强度和持续时间决定了细胞的并存的，损伤的强度和持续时间决定了细胞的死亡方式，即严重的损
18、伤会导致早期发生的肝死亡方式，即严重的损伤会导致早期发生的肝细胞坏死，而轻度的损伤则发生延迟的凋亡反细胞坏死，而轻度的损伤则发生延迟的凋亡反应应。 Serine 89fgl2凝血酶原酶凝血酶原酶 属于纤维蛋白原超属于纤维蛋白原超家族，由活化巨噬家族，由活化巨噬细胞或内皮细胞产细胞或内皮细胞产生，可直接催化凝生，可直接催化凝血酶原转变为有活血酶原转变为有活性的凝血酶，从而性的凝血酶，从而快速启动凝血过程，快速启动凝血过程，促使纤维蛋白原转促使纤维蛋白原转化为纤维蛋白，促化为纤维蛋白，促进血栓形成。进血栓形成。Domain1 N-terminal Linear ProcoagulantDomain
19、 2 C-terminal Globular FRED免疫凝血途径诱导的肝细胞坏死免疫凝血途径诱导的肝细胞坏死 免疫凝血途径诱导的肝细胞坏死免疫凝血途径诱导的肝细胞坏死 系列研究发现，活化巨噬细胞（内皮细胞）系列研究发现，活化巨噬细胞（内皮细胞）/fgl2凝血酶原酶介导的免疫凝血途径可通过凝血酶原酶介导的免疫凝血途径可通过促进肝脏纤维素沉积和微血栓形成引发肝脏的促进肝脏纤维素沉积和微血栓形成引发肝脏的微循环障碍，最终肝细胞微循环障碍，最终肝细胞 缺血缺氧，缺血缺氧，ATP合成合成障碍而触发肝细胞坏死的发生。障碍而触发肝细胞坏死的发生。 J Virol, 1997, J Immunol 1998
20、, J Clin Invest 2003, 中华医学杂志 W J G 2006, Human Gene Therapy 2006，中化肝脏病杂志，J Biol Chem. 1999, and J Biol Chem 2003 Kupffer Cells/MacrophagesFulminant viral hepatitisapoptosisnecrosisCoagulatoin activationFgl2 prothrombinaseIFN HCFasLCaspase cascadeInflammation cytokinesFas CTLVirusVAgTCR肝内枯否氏细胞、内皮细胞肝内
21、枯否氏细胞、内皮细胞fgl2高表达，高表达，是暴发性肝炎肝细胞坏死的重要机制是暴发性肝炎肝细胞坏死的重要机制胆酸诱导的肝细胞损伤胆酸诱导的肝细胞损伤体外细胞培养体系中，毒性胆盐可以通过体外细胞培养体系中，毒性胆盐可以通过Fas或或TRAIL依赖的途径引起依赖的途径引起肝细胞凋亡肝细胞凋亡。 在急性胆汁淤积的发生中，在急性胆汁淤积的发生中，Fas及其他信号途及其他信号途径也能导致严重的线粒体功能障碍及径也能导致严重的线粒体功能障碍及ATP的耗的耗竭，促进竭，促进细胞坏死细胞坏死的发生。的发生。 药物诱导的肝细胞损伤药物诱导的肝细胞损伤在美国对乙酰氨基酚的过量使用是造成急性药物性肝在美国对乙酰氨基
22、酚的过量使用是造成急性药物性肝损伤的主要原因损伤的主要原因 肝细胞凋亡与坏死共存于对乙酰氨基酚诱导的肝损伤：肝细胞凋亡与坏死共存于对乙酰氨基酚诱导的肝损伤： 1）当药物造成了）当药物造成了ATP的完全耗竭，肝细胞坏死发的完全耗竭，肝细胞坏死发生；生； 2）当）当D-果糖与甘氨酸的运用减缓了果糖与甘氨酸的运用减缓了ATP的耗竭，的耗竭，则则Caspase诱导的凋亡途径占优势。诱导的凋亡途径占优势。 肝细胞死亡的调控肝细胞死亡的调控1. 正常肝细胞死亡的干预正常肝细胞死亡的干预2. 异常肝细胞死亡的诱导异常肝细胞死亡的诱导正常肝细胞死亡的干预正常肝细胞死亡的干预Caspase抑制剂抑制剂抗氧化剂抗
23、氧化剂凋亡坏死关键基因的凋亡坏死关键基因的RNA干扰干扰细胞因子细胞因子中草药中草药 血浆置换血浆置换 异常肝细胞死亡的诱导异常肝细胞死亡的诱导选择性的增加肿瘤细胞对于选择性的增加肿瘤细胞对于TRAIL介导的凋亡介导的凋亡途径的敏感性，有助于清除肝脏肿瘤细胞，保途径的敏感性，有助于清除肝脏肿瘤细胞，保护正常的肝细胞。护正常的肝细胞。 通过药物和基因干预手段靶向诱导某些非肝实通过药物和基因干预手段靶向诱导某些非肝实质细胞（星状细胞）进行凋亡，可能会抑制或质细胞（星状细胞）进行凋亡，可能会抑制或扭转肝纤维化的发生发展。扭转肝纤维化的发生发展。结论结论 肝脏疾病中的多种因素均能导致肝细胞通过凋亡或坏死肝脏疾病中的多种因素均能导致肝细胞通过凋亡或坏死途径发生死亡。途径发生死亡。 肝细胞的凋亡与坏死并非完全独立的两条通路，而是代表了肝细胞的凋亡与坏死并非完全独立的两条通路，而是代表了细胞死亡同一胞内途径尤其是线粒体途径的两种不同结果。细胞死亡同一胞内途径尤其是线粒体途径的两种不同结果。 关于肝细胞坏死与凋亡的基础和临床研究将加深我们对于关于肝细胞坏死与凋亡的基础和临床研究将加深我们对于各种肝脏疾病发病机制的了解，对于肝脏疾病的预防和各种肝脏疾病发病机制的了解，对于肝脏疾病的预防和治疗将起到重要作用。治疗将起到重要作用。
