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1、食品化学与分析第第十一讲十一讲食品蛋白质及氨基酸的测定食品蛋白质及氨基酸的测定食品化学与分析1.蛋白质概况蛋白质概况蛋蛋白白质质是是含含氮氮的的有有机机化化合合物物，分分子子量量很很大大。主主要要由由C、H、O、N、S五五种种元元素素组组成成。某某些些蛋蛋白白质中还含有微量的质中还含有微量的P、Cu、Fe、I等。等。在在食食品品和和生生物物材材料料中中常常包包括括蛋蛋白白质质，可可能能还还包包括括有有非非蛋蛋白白质质含含氮氮的的化化合合物物，（如如核核酸酸、含含氮氮碳碳水水化化合合物物、生生物物碱碱等等；含含氮氮类类脂脂、卟卟啉啉和和含含氮氮的的色素）。色素）。第一节 概述食品化学与分析食品中
2、蛋白质的含量食品中蛋白质的含量食物名称蛋白质含量食物名称蛋白质含量猪 肉（肥瘦）9.5稻米8.3牛 肉（肥瘦）20.1小麦粉（标准)9.9羊 肉（肥瘦）11.1小米9.7马肉19.6玉米8.5驴肉18.6大豆36.3兔肉21.2大白菜1.1牛乳3.3油菜（秋）1.2乳粉（全）26.2油菜（春）2.6鸡21.5菠菜2.4鸭16.5黄瓜0.8鸡蛋14.7苹果0.4大黄鱼17.6桃0.8小黄鱼16.7柑桔0.9带鱼18.1鸭梨0.1鲐鱼21.4鲤鱼17.3第一节 概述食品化学与分析q测定蛋白质最基本的方法是通过先测定样品中测定蛋白质最基本的方法是通过先测定样品中的总氮量，再由总氮量计算出样品中的蛋白
3、质的总氮量，再由总氮量计算出样品中的蛋白质含量。含量。q食品和其原料中蛋白质含量的测定，主要（也食品和其原料中蛋白质含量的测定，主要（也是最常用的）用凯氏定氮法测定总氮量和杜马是最常用的）用凯氏定氮法测定总氮量和杜马法。法。q这里也包括非蛋白的氮，所以只能称为粗蛋白这里也包括非蛋白的氮，所以只能称为粗蛋白的含量（但马铃薯等非蛋白氮多的要单测）。的含量（但马铃薯等非蛋白氮多的要单测）。第一节 概述食品化学与分析蛋白质氮(克)蛋白质氮（克）肌动蛋白（兔肌肉）16.7谷蛋白（小麦）17.6清蛋白（牛血）16.07血红蛋白（马）16.8清蛋白（鸡蛋白）15.9胰岛素A（牛肉）15.88-淀粉酶16.2
4、3 乳球蛋白(牛乳)15.64抗生物素蛋白(鸡蛋白)14.80溶菌酶（鸡蛋白）18.80全酪蛋白（牛乳）15.63肌球蛋白（兔肌肉）16.70胶原（蛋白）（牛皮）18.70木瓜蛋白酶（木瓜）17.15伴清蛋白（鸡蛋白）16.6核糖核酸酶A（牛胰）17.51白明胶（小牛皮）18.1鲑精蛋白（鲑精液）31.5麦醇溶蛋白（小麦）17.66胰蛋白酶（牛胰）16.95球蛋白（南瓜籽）18.55色氨酸合成酶17.5胰岛血糖素（猪）17.29玉米醇溶蛋白(玉米)16.2一些蛋白质的含氮量一些蛋白质的含氮量第一节 概述食品化学与分析一些蛋白质的含氮量 一般为 15% 17.6%，有的上下浮动可以测出总氮 N=
5、N6.25=蛋白质含量蛋白质含量第一节 概述食品化学与分析2.蛋白质定量法利用蛋白质共性的方法利用蛋白质共性的方法定氮定氮法法双缩脲法双缩脲法物理法物理法利用特定氨基酸残基法利用特定氨基酸残基法染料结合法染料结合法福林福林酚试剂法酚试剂法凯氏定氮法凯氏定氮法最常用的，国内外应用普遍。最常用的，国内外应用普遍。第一节 概述食品化学与分析一、凯氏定氮法一、凯氏定氮法由Kieldhl于1833年提出，现发展为常量、微量、自动定氮仪法，半微量法及改良凯氏法。书中只介绍前三种。1.原理样品与浓硫酸浓硫酸和催化剂催化剂一同加热消化消化( (digest)digest)，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧
6、化碳和水逸出。而样品中的有机氮有机氮( (organic nitrogen)organic nitrogen)转化为氨与硫酸结合成硫酸铵硫酸铵。然后加碱碱蒸馏，使氨氨蒸出，用硼酸硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。第二节 蛋白质的测定食品化学与分析整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定（1）消化总反应式：2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4（NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O一定要用浓硫酸（一定要用浓硫酸（98%）加硫酸钾加硫酸钾作为增温剂，提高溶液沸点，纯硫酸沸点作为增温剂，提高溶液沸点，纯硫酸沸点340，加入硫酸钾之后可以提高
7、至加入硫酸钾之后可以提高至400以上。也可加入硫酸钠，以上。也可加入硫酸钠，氯化钾等提高沸点，但效果不如硫酸钾。氯化钾等提高沸点，但效果不如硫酸钾。第二节 蛋白质的测定食品化学与分析 加硫酸铜加硫酸铜 作为催化剂。还可以作消化终点作为催化剂。还可以作消化终点指示剂（做蒸馏时碱性指示剂）。还可以加氧指示剂（做蒸馏时碱性指示剂）。还可以加氧化汞、汞（均有毒，价格贵）、硒粉、二氧化化汞、汞（均有毒，价格贵）、硒粉、二氧化钛。钛。 加氧化剂加氧化剂 如双氧水、次氯酸钾等加速有机如双氧水、次氯酸钾等加速有机 物氧化速度。物氧化速度。第二节 蛋白质的测定食品化学与分析消化装置消化装置“自动回流消化仪自动回
8、流消化仪”第二节 蛋白质的测定食品化学与分析（2）蒸馏消消化化完完全全的的样样品品溶溶液液，浓浓氢氢氧氧化化钠钠使使呈呈碱碱性性，加加热热蒸蒸馏馏，即即可可释释放放出出氨气氨气(NH4)2SO4+2NaOHNH3+Na2SO4+2H2O第二节 蛋白质的测定食品化学与分析(3）吸收与滴定(titration) 吸收：加热蒸馏所放出的氨，硼酸硼酸溶液 滴定：盐酸标准溶液， 硼酸呈微弱酸性（Ka1=5.810-10），用酸滴定不影响指示剂的变色反应，它有吸收氨的作用 也可采用硫酸或盐酸标准溶液吸收，然后再用氢氧化钠标准溶液反反滴滴定定吸收液中过剩的硫酸或盐酸，从而计算总氮量第二节 蛋白质的测定食品化
9、学与分析2、适用范围（application) 此法可应用于各类食品中蛋白质含量测定。此法可应用于各类食品中蛋白质含量测定。3、试剂浓硫酸：脱水、氧化浓硫酸：脱水、氧化硫酸铜：催化剂及消化指示剂硫酸铜：催化剂及消化指示剂硫酸钾：提高溶液的沸点硫酸钾：提高溶液的沸点氢氧化钠氢氧化钠混合指示剂混合指示剂硼酸硼酸盐酸盐酸第二节 蛋白质的测定食品化学与分析 4、操作方法（1）消化：固体样品0.2-2g，半固体样品2-5g，液体样品10-20ml，加入催化剂及浓硫酸进行消化至溶液绿色透明。（同时做空白实验）（2）蒸馏：按装置进行连接，奈氏试剂检查，无红棕色物质生成(检查氨是否全部蒸完检查氨是否全部蒸完)
10、 )，蒸馏过程中用硼酸吸收。（3）滴定用0.1000mol/L盐酸滴定至由兰色变为微红色。（甲基红为指示剂）第二节 蛋白质的测定食品化学与分析5.蛋白质计算蛋白质计算 (V1V0) C0.014F100蛋白质蛋白质=mnV1V0滴定时所耗盐酸标准溶液的毫升数；滴定时所耗盐酸标准溶液的毫升数；C标准盐酸溶液的当量浓度；标准盐酸溶液的当量浓度；0.141毫升当量氮的克数；毫升当量氮的克数；F氮的蛋白质换算系数；氮的蛋白质换算系数；m样品克数。样品克数。n 稀释倍数稀释倍数第二节 蛋白质的测定食品化学与分析6.注意事项当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30过氧化氢 23 m1 后再继
11、续加热消化。消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免粘贴在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在的情况下消化不完全而造成氮损失。样品含脂肪或糖较多时，消化时间要长些。同时注意消化过程中产生泡沫溢出瓶外。在蒸馏过程中注意接头处有无松漏现象。蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸1分钟后关掉热源否则可能造成吸收液倒吸。第二节 蛋白质的测定食品化学与分析二、二、 微量凯氏定氮法微量凯氏定氮法1、原理及适用范围同前、原理及适用范围同前2、与常量法不同点：、与常量法不同点：加入硼酸量加入硼酸量有有50ml10ml,滴定用盐酸浓度由滴定用盐酸浓度由0.1mol/L0.01mol/L,可用微量滴定管
12、。可用微量滴定管。3、蒸馏装置、蒸馏装置第二节 蛋白质的测定食品化学与分析第二节 蛋白质的测定食品化学与分析三、三、 自动凯氏定氮法自动凯氏定氮法1、原理及适用范围同前2、特点：（1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红外线加热的消化炉。（2）快速：一次可同时消化8个样品，30分钟可消化完毕。（3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，12分钟完成1个样。第二节 蛋白质的测定食品化学与分析第二节 蛋白质的测定食品化学与分析四、双缩脲法四、双缩脲法传传统统的的凯凯氏氏定定氮氮法法应应用用范范围围广广，灵灵敏敏度度高高、准准确确，不要大仪器，但费时间，有
13、环境污染。不要大仪器，但费时间，有环境污染。新开发的：双缩脲法、新开发的：双缩脲法、 紫外分光光度法、紫外分光光度法、 染料结合法、染料结合法、 水杨酸比色法等。水杨酸比色法等。都是快速测定蛋白质的方法第二节 蛋白质的测定食品化学与分析 1、原理 当脲（尿素NH2CONH2）加热至150160时，可由两个分子间脱去一个氨分子而生成二缩脲（也叫双缩脲），反应式如下： 第二节 蛋白质的测定食品化学与分析双缩脲与碱及少量硫酸铜溶液作用生成紫红色的配合物，此反应称为双缩脲反应第二节 蛋白质的测定食品化学与分析蛋白质分子含有肽键, 与双缩脲结构相似，故也能呈现此反应而生成紫红色配合物 在一定条件下其颜色
14、深浅与蛋白质含量成正比，据此可用吸收光度法来测定蛋白质含量，该配合物的最大吸收波长为560nm。第二节 蛋白质的测定食品化学与分析2.方法特点及应用范围本法灵敏度较低，但操作简单快速，故在生物化学领域中测定蛋白质含量时常用此法。本法亦适用于豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品测定3.主 要 仪 器 ： 分 光 光 度 计 ， 离 心 机 （ 4000 r/min）4. 试剂： (1) 碱性硫酸铜溶液 (2) 四氯化碳第二节 蛋白质的测定食品化学与分析5操作方法：操作方法：标准曲线的绘制标准曲线的绘制采用凯氏法测出的蛋白质样品为标准样绘标准曲线采用凯氏法测出的蛋白质样品为标准样绘标准曲线。显色
15、（加入试剂静置显色（加入试剂静置1小时）小时）比色（取上清离心）比色（取上清离心）样品的测定样品的测定显色显色比色比色查标准曲线查标准曲线第二节 蛋白质的测定食品化学与分析6、结果计算蛋白质（蛋白质（mg/100g）=式中：式中：c由标准曲线上查得的蛋白质由标准曲线上查得的蛋白质mg数；数；m样品质量，样品质量，g第二节 蛋白质的测定食品化学与分析7、说明及注意事项蛋白质的种类不同，对发色程度的影响蛋白质的种类不同，对发色程度的影响 不大，有大量脂肪存在时，会出现混浊可以先脱脂不大，有大量脂肪存在时，会出现混浊可以先脱脂标准曲线作完整后，无需每次再作标准标准曲线作完整后，无需每次再作标准 曲线
16、曲线样品含有脯氨酸且有大量糖类存在时，显色不好还样品含有脯氨酸且有大量糖类存在时，显色不好还会出现结果偏低。会出现结果偏低。第二节 蛋白质的测定食品化学与分析五、紫外吸收法1原理：利用蛋白质的特有基团，对紫外光有吸收作用在280 nm下，吸光度与蛋白质浓度成直线关系，求含量。R R（ NHCH NHCHCOCO）第二节 蛋白质的测定食品化学与分析2 2适用范围：常用于生物化学工作，因为干扰适用范围：常用于生物化学工作，因为干扰因素多，故在食品分析领域应用不广泛。因素多，故在食品分析领域应用不广泛。3 3主要仪器：主要仪器： 紫外分光光度计紫外分光光度计 离心机（离心机（3000 5000 30
17、00 5000 r/minr/min）4 4操作：用凯氏法测定作标样做标准曲线操作：用凯氏法测定作标样做标准曲线第二节 蛋白质的测定食品化学与分析第三节 挥发性盐基氮的测定挥发性盐基氮是指动物性食品由于酶和细菌的作用，在腐败过程中，使蛋白质分解而产生氨以及胺类等碱性含氮物质。此类物质具有挥发性，在碱性溶液中蒸出后，用标准酸滴定计算含量。1.1.原理原理 挥发性盐基氮遇到弱碱氧化镁游离蒸馏出来，蒸馏出来的氨，被硼酸吸收后生成硼酸铵，使吸收液变为碱性，混合指示剂由紫色变为绿色。再由标准盐酸滴定至紫色。食品化学与分析2 2 、试剂、试剂 2.1 氧化镁混悬液（ 10g/L ）：称取 1.0g 氧化镁
18、，加 100mL 水，振摇成混悬液。 2.2 硼酸吸收液（ 20g/L ）。 2.3 盐酸 c(HCL)=0.01mol/L 或硫酸 c(1/2H 2 SO 4 )=0.01mol/L 的标准滴定溶液。 2.4 甲基红乙醇指示剂（ 2g/L ）。2.5 次甲基蓝指示剂（ 1g/L ）。食品化学与分析3.分析步骤分析步骤样品处理：精确取 10g 试样（粉碎好的样品）于 200mL 磨口三角瓶中，加 100.0mL(V 总 ) 蒸馏水于振荡器上振荡 30 分钟， 4000 转离心。 蒸馏滴定：将盛有 2 0.0 mL 吸收液及 5-6 滴混合指示液的锥形瓶置于冷凝管下端，并使其下端插入吸收液的液面
19、下，准确吸取 10.0mL （ V 分取 ）上述样品上清液于蒸馏器反应室内，加 10 mL 氧化镁混悬液（ 10g/L ），迅速盖塞，并加水以防漏气，通入蒸汽，进行蒸馏，蒸馏 5min 即停止，吸收滴定：吸收液用盐酸标准滴定溶液 0.01mol/L ）或硫酸标准滴定溶液滴定，终点至蓝紫色。同时做试剂空白试验。 食品化学与分析4.计算式及结果表述：计算式及结果表述：(V1-V0)c14X=100 m（5/100）食品化学与分析第四节第四节 氨基酸定量测定氨基酸定量测定一、甲醛滴定法一、甲醛滴定法1 1、原理、原理 氨氨基基酸酸具具有有酸酸性性的的- -COOHCOOH基基和和碱碱性性的的- -N
20、HNH2 2基基。它它们们相相互互作作用用而而使使氨氨基基酸酸成成为为中中性性的的内内盐盐。当当加加入入甲甲醛醛溶溶液液时时，- - NHNH2 2基基与与甲甲醛醛结结合合，从从而而使使其其碱碱性性消消失失。这这样样就就可可以以用用强强碱碱标标准准溶溶液液来来滴滴定定- -COOHCOOH基基，并并用用间间接接的的方方法法测测定氨基酸总量。定氨基酸总量。食品化学与分析2、方法特点及应用此法简单易行、快速方便。 在发酵工业中常用此法测定发酵液中氨基氮含量的变化，以了解可被微生物利用的氮源的量及利用情况，并以此作为控制发酵生产的指标之一。食品化学与分析3、试剂40%中性甲醛溶液中性甲醛溶液：以百里
21、酚酞作指示剂，：以百里酚酞作指示剂，用氢氧化钠将用氢氧化钠将40%甲醛中和至淡蓝色。甲醛中和至淡蓝色。0.1%百里酚酞乙醇溶液百里酚酞乙醇溶液0.1mol/L氢氧化钠标准溶液氢氧化钠标准溶液食品化学与分析4、操作方法样品溶液（氨基酸约20-30mg），+50ml蒸馏水加入3滴百里酚酞指示剂+中性甲醛20ml，摇匀，静置1分钟，0.1mol/L氢氧化钠标准溶液滴定（淡兰色，终点） 记录所消耗的碱液ml数。食品化学与分析5、结果计算X（V2VI）C0.014100V式中：X为样品中氨基氮含量（g100 g）；V2-百里酚酞作指示剂时消耗氢氧化钠标准液的体积（ml）；V1-空白液消耗氢氧化钠标准液的
22、体积（ml）；C-氢氧化钠标准液的浓度（molL）；V-为样品液取用量（ml）0.014-为氮的毫摩尔质量（g/mmol）食品化学与分析6 6、说明及注意事项、说明及注意事项此法适用于测定食品中的此法适用于测定食品中的游离氨基酸。游离氨基酸。固固体体样样品品应应先先进进行行粉粉碎碎，准准确确称称样样后后用用水水萃萃取取，然然后后测测定定萃萃取液；取液；液液体体试试样样如如酱酱油油、饮饮料料等等可可直直接接吸吸取取试试样样进进行行测测定定。萃萃取取可可在在50500 0C C水浴中进行水浴中进行0.50.5小时即可。小时即可。若若样样品品颜颜色色较较深深，可可加加适适量量活活性性炭炭脱脱色色后后
23、再再测测定定，或或用用电电位位滴定法进行测定。滴定法进行测定。与与本本法法类类似似的的还还有有单单指指示示剂剂（百百里里酚酚酞酞）甲甲醛醛滴滴定定法法，此此法法用用标标准准碱碱完完全全中中和和- -COOHCOOH基基时时的的pHpH为为8.5-9.58.5-9.5，但但分分析析结结果稍偏低，双指示剂法的结果更准确果稍偏低，双指示剂法的结果更准确。食品化学与分析误差脯氨酸与甲醛作用时产生不稳定的化合物，使结果偏低；酪氨酸含有酚羧基，滴定时也会消耗一些碱而致使结果偏高；溶液中若有铵存在也可与甲醛反应，往往使结果偏高。食品化学与分析二、电位滴定法1、原理原理根据氨基酸的两性作用，加入甲醛根据氨基酸
24、的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性，以固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性，将酸度计的玻璃电极及甘汞电极同时插将酸度计的玻璃电极及甘汞电极同时插入被测液中构成电池，用氢氧化钠标准入被测液中构成电池，用氢氧化钠标准溶液滴定，依据酸度计指示的溶液滴定，依据酸度计指示的pH值判断值判断和控制滴定终点。和控制滴定终点。食品化学与分析2、 仪器仪器酸度计、磁力搅拌器、微量滴定管酸度计、磁力搅拌器、微量滴定管3、 试剂试剂20%中性甲醛溶液：参考甲醛滴定法试剂中性甲醛溶液：参考甲醛滴定法试剂0.05mol/L氢氧化钠标准溶液氢氧化钠标准溶液4、操作方法、操作方法pH8.2-计算总酸含量；计
25、算总酸含量；pH9.2-试剂空白试验。试剂空白试验。食品化学与分析5、 结果计算X=X=（V V1 1V V2 2）C0.014100C0.014100V V式中：式中：X X为样品中氨基酸的含量（为样品中氨基酸的含量（g/l00mlg/l00ml）；）；V V1 1- -测定用样品加人甲醛稀释后消耗氢氧化钠标测定用样品加人甲醛稀释后消耗氢氧化钠标准液的体积（准液的体积（mlml）；）；V V2 2- -试剂空白试验加人甲醛后消耗氢氧化钠标准试剂空白试验加人甲醛后消耗氢氧化钠标准溶液的体积（溶液的体积（mlml）；）；V-V-样品稀释液取用量（样品稀释液取用量（mlml）；）；C-C-氢氧化钠
26、标准液的浓度（氢氧化钠标准液的浓度（mol/Lmol/L）0.014-0.014-氮的毫摩尔质量（氮的毫摩尔质量（g/g/mmolmmol）。）。食品化学与分析6、说明说明本本法法准准确确快快速速，可可用用于于各各类类样样品品游游离离氨氨基酸含量测定基酸含量测定对对于于浑浑浊浊和和色色深深样样液液可可不不经经处处理理而而直直接接测定。测定。食品化学与分析三、其他方法1.茚三酮比色法(ninhydrin method)原理原理 氨氨基基酸酸在在碱碱性性溶溶液液中中能能与与茚茚三三酮酮作作用用，生生成成蓝蓝紫紫色色( (RuhemannRuhemann purple purple color)co
27、lor)化化合合物物（除除脯脯氨氨酸酸外外均均有有此此反反应应）。该该蓝蓝紫紫色色化化合合物物的的颜颜色色深深浅浅与与氨氨基基酸酸含含量量成成正正比比，其其最最大大吸吸收收波波长长为为570570nmnm，故故据据此此可可以以测测定定样样品品中中氨基酸含量。氨基酸含量。食品化学与分析2.薄层色谱法（薄层层析法-TLC 法）原理： 取一定量经水解的样品溶液，滴在制好的薄层板上，在溶剂系统中进行双向上行法展开，样品各组分在薄层板上经过多次的被吸附、解吸、交换等作用，同一物质具有相同的Rf值，不同成分则有不同的Rf值，因而各种混合物可达到彼此被分离的目的。然后用茚三酮显色，与标准氨基酸进行对比，鉴别各种氨基酸种类，从显色斑点颜色的深浅可以大致确定其含量。食品化学与分析3.氨基酸自动分析仪法氨基酸自动分析仪法4.气相色谱法气相色谱法5.高效液相色谱法高效液相色谱法食品化学与分析小结凯氏定氮法原理、分步、测定方法。双缩脲法测定原理。氨基酸总量的测定方法（甲醛滴定法）。
