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1、实验七实验七质粒质粒DNA的提取的提取(碱法碱法)1. 实验目的2. 实验原理 3. 实验仪器、资料与试剂 4. 实验步骤 5. 实验结果及讨论 实验目的l了解碱法提取质粒的原理；了解碱法提取质粒的原理；l掌握碱法提取质粒的方法。掌握碱法提取质粒的方法。实验原理实验原理l质粒是一种细菌染色体外的、具有自主质粒是一种细菌染色体外的、具有自主复制才干的、共价闭合环状超螺旋构造复制才干的、共价闭合环状超螺旋构造的小型的小型DNA分子。碱裂解法提取质粒是分子。碱裂解法提取质粒是实验室常用的方法。实验室常用的方法。l这种方法是根据共价闭合环状质粒这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体与线性染色
2、体DNA在拓扑学上的差别来在拓扑学上的差别来分别它们。分别它们。构造的三大要素：构造的三大要素： 多克隆位点多克隆位点 选择标志耐志耐药性，性，LacZLacZ 独立的复制独立的复制单位位种种类： 质粒粒 噬菌体噬菌体 酵母人工染色体酵母人工染色体YACYAC 反反转录病毒病毒载体体 表达表达载体等体等在碱性条件在碱性条件pH 12.5下，线性染色体下，线性染色体DNA的双螺旋构造解开而变性，质粒的双螺旋构造解开而变性，质粒DNA的氢键虽的氢键虽然断裂但两条互补链彼此缠绕，严密结合在一然断裂但两条互补链彼此缠绕，严密结合在一同。当参与乙酸钾恢复至中性时，染色体同。当参与乙酸钾恢复至中性时，染色
3、体DNA之间交联构成不溶性构造，而质粒之间交联构成不溶性构造，而质粒DNA分子很分子很快复性，离心时染色体快复性，离心时染色体DNA与细胞碎片一同被与细胞碎片一同被沉淀出来，而质粒沉淀出来，而质粒DNA那么留在上清液中。那么留在上清液中。用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤，可得到较纯的质用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤，可得到较纯的质粒粒DNA。实验仪器、资料与试剂 一一 仪器仪器 1. 恒温摇床恒温摇床 2. 超净任务台超净任务台 3. 高压灭菌锅高压灭菌锅 4. 高速台式离心机高速台式离心机 5. 微量取液器微量取液器 二 资料 l含重组质粒的大肠杆菌 。三 试剂 l1. LB液体培育基1L l 胰蛋白胨
4、10g l 酵母提取物 5 g l NaCl 10 g l 加去离子水至800ml 搅拌，使溶质完全溶解，用NaOH调理pH值至7.0，参与去 离子水至总体积为1升，高压蒸汽灭菌20 分钟。 lLB固体培育基1L l 在上述LB液体培育基1L中参与琼脂粉15g。 l2. Solution l 50 mmol/L 葡萄糖 l 25 mmol/L Tris.Cl (pH 8.0) l 10 mmol/L EDTA (pH 8.0) l 高压灭菌后，4保管备用。 l3. Solution(现用现配制) l 0.2 mol/L NaOH l 1% SDS 4. Solution 100 ml 5mol
5、/L KAc 60 ml 冰醋酸 11.5 ml 水 28.5 ml 配制成的溶液含3 mol/L钾盐、5 mol/L醋酸 pH 4.8。 5. 氨苄青霉素Amp 用无菌水配制成100 mg/ml 溶液，置-20冰箱保管备用。 6. 胰胰RNA酶 将胰将胰RNA酶RNA 酶 A溶于溶于10 mmol/L Tris.Cl (pH 7.5)、15 mmol/L NaCl中，中， 配配成成10 mg/ml的的浓度，于度，于100加加热15分分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保管于慢冷却至室温，分装成小份保管于-20。 7. 氯仿，乙醇仿，乙醇 ，70%乙醇。乙醇。8.TE缓冲液冲液 10mM Tris
6、.HCl (pH7.4) 1mM EDTA (pH8.0)实验步骤实验步骤l1. 用灭菌的牙签挑取单菌落放入50ml LB液体培育基含Amp 0.1 mg/ml 中，37振荡培育过夜。 l2. 将菌液倒入1.5 ml Eppendorf管中，12,000 rpm离心2min，去掉上清液。将EP管口朝下，用滤纸吸干水分。l3.沉淀悬于100L SolutionI 中, 涡旋使充分悬浮，盖子翻开，室温放5分钟。 l4. 参与200L SolutionII，混匀留意动作轻，冰浴5分钟。 l5. 参与1L RNase和150L SolutionIII，上下颠倒5-10次，冰浴10分钟。 l6. 12,
7、000rpm，离心5min，将上清移至1个新EP管中，留意所取体积。 l7. 参与2倍体积无水冰乙醇混匀留意动作轻，-20沉淀 10min。 l8. 12,000 rpm离心3 min，弃上清，参与1ml 70%乙醇振荡漂洗一次，再10000 rpm离心2min，去上清。l9.沉淀于-20保管备用。lBiospin质粒粒DNA小量提取小量提取试剂盒盒实践用践用ll操作操作过程程l1.将将11.5ml过夜培育的夜培育的细菌菌液参与菌菌液参与1.5ml离心管中。离心管中。l2.于于10，000rpm离心离心30秒，并弃去上清液。秒，并弃去上清液。l如有需求，可多次反复步如有需求，可多次反复步骤1、
8、2，以搜集更多，以搜集更多细菌菌体。但勿菌菌体。但勿过量，以免影响提取量，以免影响提取质粒的粒的质量。量。l3.加加250lResuspensionBuffer，重，重悬细菌体菌体沉淀。沉淀。l重重悬后后应该没有没有细菌菌团块。l4. 加250l 细胞Lysis Buffer，轻柔颠倒46 次。l不要猛烈振动，以防止基因组DNA 被剪切。留意不要让反响继续超越5 分钟。l5. 加350l Neutralization Buffer，立刻轻柔颠倒离心管46 次。l溶液应该出现絮状物，但不会出现部分沉淀。l6. 于13,000rpm离心10 分钟。l如离心机转速不够可延伸离心时间，直至构成严密的白
9、色沉淀。l7. 将步骤6 离心后得到的上清液转移到Spin column 内。于6,000rpm离心1 分钟，并弃去接液管内液体。l8. 向Spin column 内加650l Wash Buffer，于12，000g 离心3060 秒，并弃去接液管内液体。l9. 反复第8 步一次。l10. 再次于12，000rpm 离心1 分钟，然后将Spin column 转移到无菌的1.5ml 离心管中。如不进展该步离心，那么无法保证离心柱内残液被彻底去除。l11. 向Spin column 内加20l Elution Buffer、去离子水或TE 溶液，并于室温静置1 分钟。l可根据实验的实践需求决议洗脱液用量。l12. 于12，000rpm离心1 分钟，1.5ml 离心管内溶液中含有质粒DNA。l13. 提取的质粒DNA 可直接用于各类下游分子生物学实验，假设不立刻便用，请保管于-20。实验结果及讨论 l碱法提取质粒是实验室最常用的质粒提取方碱法提取质粒是实验室最常用的质粒提取方法之一，提取量较大，便于操作。法之一，提取量较大，便于操作。l如有蛋白质残留，枯燥后不透明，而呈白色。如有蛋白质残留，枯燥后不透明，而呈白色。
