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1、ING 4和FP 248基因检测在白血病和消化道肿瘤中的临床意义学生 李继刚导师 许文荣江苏大学基础医学与医学技术学院 2008年06月06日 一 研究背景1. ING 4基因 (1) ING 4基因的生物学特性及功能 p13.31ING 4，8个外显子诱导P21表达上调l（2） ING 4的变异与肿瘤发生的关系神经母细胞瘤细胞株肺 癌 细 胞 株乳 腺 癌 细 胞 株结直肠癌细胞株ING 4 变异白血病？健康人心、脑、肝、肺、肾组织ING4-V1:30%35%ING4-V2:42%50%成人及胎儿心、脑、肝、肺、肾肿瘤组织白血病？消化道肿瘤？本研究检测白血病患者骨髓中主要剪接方式l(3) I
2、NG 4 在多种肿瘤组织中表达下调ING 4神经胶质瘤头颈部鳞状细胞癌肺癌消化道肿瘤白血病l2.原癌基因FP 2488q24.3，FP248，3个外显子8与肝癌有关 FP 248蛋白质，208aa其他肿瘤 ？ 二 研究内容和研究意义1.研究目的 建立检测ING 4和FP 248基因的real time RT-PCR和nested RT-PCR方法，并分析ING 4和FP 248基因对白血病和消化道肿瘤的诊断意义。 3. 研究内容建立采用RT-PCR和real-time RT-PCR检 测ING 4和FP 248 mRNA表达的方法研究ING 4 和FP 248在多种肿 瘤细胞株中的表达水平IN
3、G 4和FP 248基因在 白血病中的临床意义ING 4 和FP 248基因在消化道 肿瘤中的临床意义3.研究意义 为白血病和消化道肿瘤的诊断和预后提供新的更为便捷的方 法和指标，也为这些疾病的基因治疗提供了两个靶基因。注:A：ING 4 标准品扩增曲线；B：ING 4标准品扩增产物融解曲线，C：ING 4标准曲线 .图1. ING 4 标准品 三 方法建立1.成功建立了采用real-time RT-PCR检测ING 4和FP 248基因表达的方法注：A：FP 248标准品扩增曲线； B：FP 248标准品扩增产物融解曲线 C：FP 248标准曲线.图2. FP 248 标准品 注： A： G
4、APDH 标准品扩增产物融解曲线； B：GAPDH标准品扩增曲线； C：GAPDH标准曲线。图3. GAPDH标准品 2.成功建立了采用Western 印迹技术检测ING 4蛋白质表达的方法； 3.成功建立了采用免疫组织化学技术检测组织中ING 4蛋白质表达的方法。表1.real-time RT-PCR关键参数l1.实验设计四、肿瘤细胞株中ING4 和FP 248基因 表达检测肿瘤细胞抽提总RNA检测ING 4 mRNA检测FP248 mRNA注： A.细胞株中ING 4基因及部分标准品扩增曲线 标准品浓度：102copies/l和103copies/l及 108copies/l. 2.研究结
5、果AB. real-time RT-PCR测定结果 1：SW480；2：SGC；3：U937；4：hBM-MSC. BC. RT-PCR测定结果 1：SW480；2：SGC；3：U937；4：hBM-MSC. C图4. FP248 在肿瘤细胞中的表达 注： A.real-time RT-PCR 扩增曲线。B. real-time RT-PCR 检测FP248 mRNA 实验重复3次。 1：U937；2：SGC； 3：hBM-MSC；4：PLA801-95D；5：A549。C. RT-PCR检测 FP 248 mRNA b：blank；1： U937；2：SGC；3：hBM-MSC；4：PLA8
6、01-95D；5：A549；6：PC3；7：SW480；M：DNA marker (100bps DNA Ladder)。 图5. FP248 在肿瘤细胞中的表达ABC 五、 ING 4和FP 248基因检测在白血 病中的表达及临床意义表.骨髓标本和标本资料注：以上标本由江苏大学附属医院提供骨髓和外周血分离单个核细胞抽提总RNA逆转录并检测 ING 4 基因表达检测FP 248 mRNA分析临床意义分析临床意义抽提DNA测序测序1.研究方案注：I.部分骨髓及外周血标本中ING4基因扩增曲线 II：白血病患者骨髓中ING 4表达水平 1：健康对照； 2：缺铁性贫血患者骨髓；3：免疫性血小板减少患
7、者骨髓；4：ALL患者骨髓；5：CLL患者骨髓； 6：CML患者骨髓；7：CML急性变患者骨髓；8：M2骨髓；9： MDS骨髓。III：白血患者外 周血ING 4 1：健康对照；2：M2； 3：AML；4：CML；5：ALL。IV： Western 印迹检测结果 A1：缺铁性贫血； A2：AML；B1：缺铁性贫血；B2：CML；C1：缺铁性贫血；C2：ALL。图6. ING 4基因在白血病患者骨髓及外周血中的表达水平IIIIII 2.研究结果IV注：A,B 和C. ING4基因cDNA测序部分图谱 框内部 分 为第四和第五外显子接头处易缺失序列。 A：AML, n=4; B：CML，n=5；C
8、：ALL，n5。ABCD图7. ALL患者骨髓中ING4基因组DNA测序部分图谱D. ALL患者骨髓中ING4基因组DNA测序部分图谱 框内 部分为第四和第五外显子接头处易缺失序列，左为基因组DNA第四外显子部分序列，右为第五外显子部分序列，n=5。注：I.部分白血病标本及对照组标本中FP 248定量扩增曲线. II. real-time RT- PCR测定结果 1：缺铁性贫血和健 康人骨髓； 2：CML患者骨髓；3.两例女性CML患者急性变后骨髓；4：两例女性CML患者急性变骨髓，HA 和DAT化 疗2周后； 5：ALL患者骨髓； 6： M2患者骨髓；7：M3患者骨髓；8：5例M2外周血；9
9、：健康体检者外周血。 III.RT-PCR测定结果 A.白血病患者骨髓和外周血中FP 248 mRNA 表达 1：健康体检者外周血；2：M2外周血； 3：CML患者骨髓；4：CML急性变患者骨髓；5：ALL患者骨髓；6：M2患者骨髓；7：M3患者骨髓；8-12： 缺铁性贫血患者骨髓；13：blank；M：DNA marker（DL2000）。 B. ALL患者外周血中FP 248 mRNA表达 1：健康体检 者外周血；24：ALL患者外周血；M：DNA marker（DL2000）。C. ALL患者骨髓中FP 248 mRNA表达 1:blank； 2：ALL骨髓；3：缺铁性贫血患者骨髓；M：
10、DNA marker（DL2000）。图8. 白血病骨髓或外周血中FP 248 mRNA的表达III表2.白血病标本中FP 248 mRNA阳性率IIIP0.05 六、ING 4和FP 248基因表达检测在 消化道肿瘤中的临床意义表3.消化道肿瘤病例资料注：示采集手术前外周血和手术1周后外周血，健康体检者外周血资料同第五部分 1.研究方案l 胃癌结肠癌直肠癌组织检测ING4蛋白质检测ING4 mRNA外周血检测FP248 mRNA分析临床意义检测FP248 mRNA检测ING4 mRNA食道癌组织ABCDab注：A .ING 4基因扩增曲线 B.ING 4基因相对定量结果 1.结肠癌；2和3为
11、直肠癌；416为胃癌。 C. Western 印迹检测ING 4蛋白表达水平 p：阳性对照；a：胃癌；b.结肠癌；c：直肠癌；d：食道癌； e：食道癌； 1表示癌旁组织，2表示癌组织。 D.免疫组化技术检测 ING 4在胃癌组织中的表 达 （100） a.胃癌旁组织；b.胃癌组织图9. ING 4消化道肿瘤组织中表达 2. 研究结果注：A.胃癌结肠癌直肠癌中各分期中ING 4 基因表达 未见显著性差异(P0.05)。 B和C. ING4表达水 平与组织分化程度的关系 组织分化水平越低，ING 4表达越低（ P0.05) . D. ING 4表达水平与 患者预后的关系 2年内复发或转移的患者表达
12、水平显著低于未 复发的患者（ P0.05) 。图10. 消化道肿瘤组织中ING 4基因表达水平与消化道肿瘤分期、组织分化程度以及患者预后的关系n 表4.消化道肿瘤分期及组织分化程度分期方法：Robson 分期法高分化中分化中低分化低分化未复发复发注. I.部分消化道组织中FP248基因扩增曲线 II.real-time定量PCR结果 a. 胃癌 ，b. 结肠癌，c. 直肠 癌 。1：癌旁组织； 2：癌组织；3：癌旁淋巴结；III.RTPCR结果 1：结肠癌；2：直肠癌； 38：胃癌；9：食道癌；N：癌旁组织；C：癌组织；L：淋巴结转移灶；B：blank；S：标准 品； M：DNA marker
13、 (100bps DNA Ladder)。图11. real-time定量PCR检测FP 248 在 消化道肿瘤中的表达IIIIII表5. 癌组织和淋巴结组织中FP 248 mRNA阳性率注：A.胃癌、结肠癌和直肠癌中FP 248表达与病理分期之间的关系 未见显著性差异(P0.05). B和C：FP 248 mRNA表达水平与组织分化程度的关系 分化程度越低，FP 248 mRNA表达水平越高(P0.05)。D. FP 248 基因表达水平与患者预后的关系 2年内复发的患者FP 248基因表达水平显著于未复发者(P0.05)。图12.消化道肿瘤组织中FP 248 基因表达水平与消化道肿瘤分期、
14、组织分化程度以及患者预后的关系n 表4.消化道肿瘤分期及组织分化程度分期方法：Robson 分期法高分化中分化中低分化低分化未复发复发注：A. RT-PCR。B. nested RT-PCR。blank：空白对照。a、b和c：胃癌; d和e：结肠癌；f和g：直肠癌；h：marker，DL2000；i：健康体检。1为手术前，2为手术后。图13. ING4基因在消化道肿瘤患者外周血单个盒细胞中的表达注：a、b、c为癌组织阳性的胃癌患者，d、e、f为 癌组织阳性的结肠癌患者，g、h为癌组织阳性的直肠 癌患者，M为 DNA marker (DL2000)。图14. nested RT-PCR检测消化道
15、肿瘤患者外周血单个核细胞中FP 248的表达表6.手术前后外周血单个核细胞中FP 248 mRNA阳性率表7. 外周血单个核细胞中FP 248 mRNA阳性率与预后的关系与健康对照组相比，P0.05，2检验与手术一周后为阴性的患者相比，P0.05，2检验 七.结论lING4基因表达下调和FP248基因与胃癌等消化道肿瘤和白血病的发生发展可能存在相关性，检测这两个基因的表达有助于消化道肿瘤的诊断和预后。l采用nested RT-PCR检测外周血单个核细胞中FP248基因是筛选消化道肿瘤的好方法。 致谢致谢l特别感谢许文荣教授的悉心指导！特别感谢许文荣教授的悉心指导！l衷心感谢钱晖老师和朱伟老师的
16、关心和帮助！衷心感谢钱晖老师和朱伟老师的关心和帮助！l感谢各位专家的百忙之中指导本人答辩！感谢各位专家的百忙之中指导本人答辩！l感谢我的同学和师弟师妹们的帮助和支持！感谢我的同学和师弟师妹们的帮助和支持！ 发表文章l1. 李继刚， 许文荣， 钱 晖，朱 伟 ，王 胜，步雪峰，张 蕾 蕾，徐 静， 司煜安，陈 忠，周忠海，周洪兴，施晓凤. fp 248 mRNA在白血病和肿瘤中的诊断意义. 临床检验杂志， 2008 年第3期.l2.Jigang Li, Wenrong Xu, Hui Qian, Wei Zhu. Ing 4 as a novel diagnol sis marker of tumor: the relationship between ing4 and leukaemia l and solid tumor.（待发表）.l3. 徐 静，许文荣，钱 晖，朱 伟，李继刚，周洪兴, 周忠海，阴 l 晴，司煜安，张蕾蕾. 白血病细胞、多种肿瘤细胞及胃癌组织中 l Pokemon基因的定量检测.临床检验杂志，2008, 26(1): 42-45.
