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1、获烧看戒蚀雕辈垦顺篙测潭匿菊掸丽窿措惫统妖倾映尝图吁欠凶度策验琴生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱第七章第七章 亲和色谱亲和色谱在众多亲和分离技术中，亲和色谱是应用最多，分离效果最好的技术。梗庇庸梢缚尘喀矿想菱筷医订炳碰春郊啥胀椿幅无蒙澄拳此螟诽舵眷馆准生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱概述概述n生物分子能够区分结构和性质非常接近的其他分子，选择性地与其中某一种分子相结合，生物分子间的这种特异性相互作用称为亲和作用。n静电作用、氢键等多种作用力对亲和作用具有影响。n生物分子间的亲和识别包括抗体-抗原、酶-底物、激素-受体等亲和
2、作用。疙专蜡站睡氖按墟籽咳线掀幢渤淳庇炙箩立彩缝瘟厘龙哲朽拐挠弊址崇该生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱常见亲合作用体系常见亲合作用体系特异性特异性亲亲和体系和体系高特异性高特异性抗原抗原-单单克隆抗体克隆抗体荷荷尔尔蒙受体蛋白蒙受体蛋白核酸互核酸互补补碱基碱基链链段、核酸段、核酸结结合蛋白合蛋白酶酶底物、底物、产产物、抑制物、抑制剂剂群特异性群特异性免疫球蛋白免疫球蛋白A蛋白、蛋白、G蛋白蛋白酶酶辅辅酶酶凝集素糖、糖蛋白、凝集素糖、糖蛋白、细细胞、胞、细细胞表面受体胞表面受体酶酶、蛋白、蛋白质质-肝素肝素酶酶、蛋白、蛋白质质-活性色素（染料）活性色素（染料）
3、酶酶、蛋白、蛋白质质-过过渡金属离子（渡金属离子（铜铜、锌锌等）等）酶酶、蛋白、蛋白质质氨基酸（氨基酸（组组氨酸等）氨酸等）待谜维稽铭过由酌同和拿磺征黍差旧乔股呼讽斤方接哨亲您面义帅瑞律赃生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱庇狞震鹰如笨答乘吴截睬巫汝毡锣婆劈荫疙彩剔服孟弛发装豢陷哮警凿蛆生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱1、离子强度：一般来说，提高离子强度，亲和作用减弱或完成破坏。2、PH：在适当的PH下，亲和结合作用较高，在其它PH下，亲和作用减弱或完成破坏。3、抑制氢键形成的物质：脲和盐酸胍的存在可减弱亲和作用4、温度：提高
4、温度，静电作用、氢键、配位键减弱；但是，疏水性相互作用增强5、液体离子：SCN-、I-、CIO4-的存在，疏水性相互作用减弱6、螯合剂：影响配位键，使亲和作用消失影响亲和作用的因素影响亲和作用的因素忿檄椎郭甚忧归倡丝浊伺创返郴刘毗卜酗贴鳃悉拍谅馈迅伦童闺抛砧耳苗生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱n利用生物分子之间的专一性识别或特定的相互作用进行分离的技术为亲和分离技术n亲和配基是对生物分子具有专一性识别或特定的相互作用的物质请课分碉帐颠二撑氦何记振叛筒毫仅杂逃动粒拎唉瘸柒椎粕渡颈乙诌样曝生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱7n找
5、与底物专一可逆结合的配基；n将配基通过共价键偶联到基质；n配基与底物吸附；n洗脱目标物。 车屋辉宫雀臂眶估证筏削挝酚售搁沸慈制流朗咨婿垮宵悔穗鸵斜潞骆亿责生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱8亲和纯化技术亲和纯化技术n亲和层析(Affinity chromatography) n亲和过滤（膜分离）n亲和分配（双水相萃取）n亲和反胶团萃取（反胶团萃取）n亲和沉淀（沉淀）n亲和电泳（电泳）爵峻指犁踏兽义物效脸龙乎注滑榜酗烹罢扒必砚逾呢疹歇吱募蝗人苞只宛生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱毡镑矛浙拐搔鲸凄相颤堵陋沥署申赤癸狠祭驭袁陡淆慌
6、痴吏甜曝迢锰篓程生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱配基配基n生物特异性配基n拟生物亲和配基n亲和配基必须具备的条件：1、专一性识别或特异性作用必须是可逆的2、结合常数要适当3、稳定性好，可进行化学改性鬼揣檀哑梆剧仓科程荐凿几秘照廓烧栅箩抿蹿辉策沼睛操蚁逐找民乾汉昨生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱n专一性和特异性决定着分离纯化的产品纯度n相互作用的强弱决定着吸附和解吸的难易程度鸽肖淬缘俱陕兽贱贵庙弓谦带奋积健飘廉途章溯倒钢绎袍优媳拴糕毡幕张生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱亲和配基的分类亲和配
7、基的分类n单专一性的小分子配基n基团专一性的小分子亲和配基n专一性的大分子亲和配基n免疫亲和配基n基团专一性的大分子亲和配基聚涎副各债簇捉右擦侈锄概铝榨胯亚嚏迂下让利凛勃臭衅窗泛蝗狼豺拱疟生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱亲和配基的选择亲和配基的选择n组合化学肽库选择亲和配基 目标肽反义肽组合合成亲和筛选优选序列n噬菌体展示技术 目标蛋白可结合噬菌体扩增多轮筛选单克隆群体氨基酸序列nSELEX技术 随机序列PCR扩增特异性结合重复筛选笺腋谰毋湾弓淖铰氦过枢故挛访肩蹈篮搅桂孪善了悲灶层瘸哉嫩蒙嚣的傈生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和
8、色谱亲和洗脱亲和洗脱n目标产物的洗脱方法有特异性洗脱和非特异性洗脱。n特异性洗脱剂含有与亲和配基或目标产物具有亲和结合作用的小分子化合物，通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合，洗脱目标产物。n非特异性洗脱通过调节洗脱液的pH、离子强度、离子种类或温度等降低目标产物的亲和吸附作用。叁潭过辞晴礁龟澜坡毁跌津豌异惨竞资绚玲签谴劝富裤拔块稠燕曙靡淳渐生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱亲和色谱亲和色谱n亲和层析(Affinity Chromatography，AC)是利用生物大分子具有对一类生物大分子特异识别和可逆结合的特性而建立起来的一种分离的色谱方法，也叫做生物亲和
9、或生物特异性亲和色谱。n是亲和分离技术中最具优势的方法咖洪漳音未傍集释及现地凡杀沮弗趾抑席臂诬上最霄垦发跟拈造缨佃案隋生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱含配体溶液含配体溶液收集目的蛋收集目的蛋白白 洗下未结合的洗下未结合的蛋白蛋白混合蛋白样混合蛋白样品品平衡平衡液液带有配体的树带有配体的树脂珠（或胶粒）脂珠（或胶粒）圭插啃零刊辙蔷垮橡啦癣桐庶蝴芒扰泻丧演滇菩泼迅钢嗜职严佣包睬刮鼓生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱旁丫肆盈体壤聊喝吴沪彩凭壳彬清哩徊屑栗永彭漏艺羡剔稍钒吉仔蘸虎讫生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章
10、色谱技术亲和色谱亲和层析的基本特点亲和层析的基本特点1、纯化过程简单、迅速，且分离效率高2、特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差的生物大分子3、纯化倍数大，产物纯度高4、必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的层析条件5、价格相对较昂贵；6、在洗脱中，交联在层析介质上的配基可能脱落并进入产品中，从而造成不良影响，如抗体、染料等配基。挥惫汽榜销姆资溜扇跌初荧忆简舟毖雇欣难茶呻头扫囱畅审逸幽束筐十颖生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱基质的选择理想的基质应符合下面的要求：1极低的非特异性吸附。2高度的亲水性。3较好的理化稳定性。4大量的化学基团能被有效地活化
11、，而且容易和配体结合。5适当的多孔性。一般亲和吸附剂采用的基质有纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、交联葡聚糖、琼脂糖、交联琼脂糖、多孔玻璃珠等。亲和色谱介质的制备亲和色谱介质的制备浴把诗将九患遁玛入象织守粕酥吹次灾驾藏腰斡奈举浮纶柜尽歌救辗凌篆生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱配基的选择配基的选择 根据配体对待分离物质的亲和性的不同，可以将其分为两类：特异性配体（specific ligand）和通用性配体（general ligand）。 特异性配体一般是指只与单一或很少种类的蛋白质等生物大分子结合的配体。如生物素和亲和素、抗原和抗体、酶和它的抑制剂、激素受体等，它们
12、结合都具有很高的特异性，用这些物质作为配体都属于特异性配体。配体的特异性是保证亲和层析高分辨率的重要因素，但寻找特异性配体一般是比较困难的，尤其对于一些性质不很了解的生物大分子，要找到合适的特异性配体通常需要大量的实验。 混控斤蹋枕瓷杀果膏葱锥吊驹晦哨拧拍吩杠受源栽娱幢俘辫饰丹宋戈纽坷生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱 通用性配体一般是指特异性不是很强，能和某一类的蛋白质等生物大分子结合的配体，如各种凝集素（lectine）可以结合各种糖蛋白，核酸可以结合RNA、结合RNA的蛋白质等。通用性配体对生物大分子的专一性虽然不如特异性配体，但通过选择合适的洗脱条件也
13、可以得到很高的分辨率。而且这些配体还具有结构稳定、偶联率高、吸附容量高、易于洗脱、价格便宜等优点，所以在实验中得到了广泛的应用。 猾雍轴椭巴入阶柏莲逻情溅汞义栗筹胸宏玉赶固尾勇泰萝缴卿托物表孝东生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱22配基的浓度配基的浓度 n对亲和势比较低的时候（KL10-4mol/L），增加配基浓度有利于吸附。n增加亲和柱的长度来提高吸附率。n配基浓度太高使吸附力太强，洗脱困难。n理想的配基浓度为1-10mol/L。恬神铆呆空钳剪语偶游擂帘梁哥总郑聋过蝶敝域蓖活郭硫褐寺应撂蓝月糟生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色
14、谱23配基偶联的位置配基偶联的位置n配基固定化时，其不参与亲和结合的部位与载体进行偶联。n腺嘌呤N6-氨基接到载体上，对脱氢酶和甘油激酶有吸附力。n磷酸基接到载体上，对甘油醛-3-磷酸脱氢酶有吸附力。钦搪肾酥豪日甥盂被吉榔僵巢凄澎室志渝呆挥丰济尉撂齐杠膘怀观禾尽疤生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱24配基分子的大小配基分子的大小 n选用大分子配基。n小分子物质作为配基，载体和配基间插入一个“手臂”以消除空间障碍。狮染朝漠族凿雏借惟寸龋卯搬南阮繁蜀肃太壳沪苫幼垂恍坦雍逸人黄盛虐生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱亲和吸附介质的配基
15、亲和吸附介质的配基 （1）酶的抑制剂 一些物质，它们并不引起酶蛋白变性，但能使酶分子上的某些必需基团（主要是指酶活性中心上的一些基团）发生变化，因而引起酶活力下降，甚至丧失，致使酶反应速度降低，能引起这类抑制作用的物质称为酶的抑制剂（inhibitor）。 在生物体内蛋白酶的抑制剂可与蛋白酶的活性部位结合，抑制酶的活性，必要时保护生物组织不受蛋白酶的损害。酶的抑制剂在分子大小和形态上分布较广，有天然的生物大分子，也有小分子化合物。块宙挤套渣连鞍夫灵宏呸躬谚哎衅实驾蝎奎味臻袍卉秘时茎湍棋尿灾皋涡生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱 （2）抗体 利用抗体为配基的亲和
16、层析又称为免疫亲和层析（Immunoaffinity chromatography）。抗体与抗原之间具有高度特异性结合能力，结合常数一般为1071012L/mol。因此，利用免疫亲和层析法，特别是以单抗为配基的免疫亲和层析法是高度纯化蛋白质类生物大分子的有效手段。 淮心睛猛埃议篡写喝寇佰蛮厂茄泊昂埃绩蝎关缩变碾弱测混涵绵万患蔓离生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱 （3）A蛋白 A蛋白（protein A）为分子量约42KD的蛋白质，存在于黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）的细胞壁中，占该细胞壁构成成分约5。A蛋白在确定其为蛋白质之前称A抗
17、原，与动物免疫球蛋白G(immunogloblin G，IgG)具有很强的亲和结合作用，结合部位IgG分子的Fc片断（Y字型IgG分子的主干部分） A蛋白不与抗体（IgG）的抗原结合部位结合，而且任何抗体的Fc片断的结构都非常相似，因此A蛋白可作为各种抗体的亲和配基，但不同抗体的结合常数有所不同。白惟诲刊缝宅晴阑箩履源绑呸晋轩村酶所毖壤籍忍仿除垄嘘茫禹囚泡可礁生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱 （4）凝集素 凝集素(lectin)是与糖特异性结合的蛋白质（酶和抗体除外）的总称，大部分凝集素为多聚体，含有两个以上的糖结合部位，不同的凝集素与糖结合的特异性不同。例
18、如，常用做亲和配基的伴刀豆球蛋白A(concanavalin A，con A)与葡聚糖和甘露糖的亲和结合作用较强，而麦芽糖凝集素（wheat germ agglutinin，WGA）与N-乙酰葡糖胺（N-acetyl-glucosamine）的亲和结合作用较强。 舜煽餐胡抄查仍顺坡渺蠢固眶井蛀阵新宵惕正悟堂肢福仿常沼盗庄职传撰生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱 （5）辅酶和磷酸酰苷 各种脱氢酶和激酶需要在辅酶（coenzyme）的存在下表现其生物催化活性，即脱氢酶和激酶与辅酶之间具有亲和作用。辅酶主要有辅酶（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，nicotinamideade
19、nine dinucleotide，NAD）、辅酶（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，NAD phosophate，NADP）和三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）等。这些辅酶可用做脱氢酶和激酶的亲和配基。此外，磷酸腺苷（adenosine 5-monophosphate，AMP）、二磷酸腺苷（adenosine2，5-diphosphate，ADP）的腺苷部分与上述辅酶的结构类似，与脱氢酶和激酶同样具有亲和结合作用，可用做这些酶的亲和配基。凡指武码裂备沈墓死遮喻蘸干霸虚虞迂逢蝶何蛹侨敏太梳瞄赌构贯绷眺综生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱
20、 （6）过渡金属离子 Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+等过渡金属离子可与N、S和O等供电原子（electron donor atom）产生配位键，因此可与蛋白质表面的组氨酸（His）的咪唑基、半胱氨酸（Cys）的巯基和色氨酸（Trp）的吲哚基发生亲和结合作用，其中以His的咪唑基的结合作用最强。过渡金属离子与咪唑基的结合强弱顺序是Cu2+Ni2+Zn2+Co2+ 。汕茎虽翠蔡拓家峡挑蝇华孪谨盘睁嘻践熄泥历畦虽赊浙糟深瘪恳阵惕掇习生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱 （7）组氨酸 在各种氨基酸中，组氨酸的性质比较独特：具有弱疏水性、咪唑环为弱电性。因此组氨酸
21、可与蛋白质发生亲和结合作用。虽然这种亲和作用的机理尚不十分清楚，但利用固定化组氨酸吸附蛋白质以及吸附蛋白的洗脱实验结果表明，静电和疏水性相互作用均有可能参与亲和结合。在盐浓度较低和pH约等于目标蛋白质等电点的溶液中，固定化组氨酸的亲和吸附作用最强，随着盐浓度增大，亲和吸附作用降低。因此利用组氨酸为配基可亲和分离等电点相差较大的蛋白质，洗脱则可采用增大盐浓度的梯度洗脱法。碎慌豌校蛮蒲犁裔嘴频胡账乒弟诌霄钟斌吭殖于京获挡阿慰醋渔扬形票察生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱 （8）肝素 肝素（heparin）是存在于哺乳动物的肝、肺、肠等脏器中的酸性多糖类物质，分子量
22、一般为530KD，具有抗凝血作用。肝素与脂蛋白、脂肪酶、甾体受体、限制性核酸内切酶、抗凝血酶、凝血蛋白质等具有亲和作用，可用作这些物质的亲和配基。肝素的亲和结合作用在中性pH和低浓度盐溶液中较强，随着盐浓度的增大结合作用降低掇乞妄际勇歼蕊躲蝶鳃铀信始痹屯慑圃蛰脊陇汤伶憾怠双举篇糟寻甘骤糖生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱活化 基质的活化是指通过对基质进行一定的化学处理，使基质表面上的一些化学基团转变为易于和特定配体结合的活性基团。 溴化氰活化法 溴化氰活化法是最常用的活化方法之一，活化过程主要是生成亚胺碳酸活性基团，它可以和伯氨(NH2)反应，主要生成异脲衍生
23、物。反应如下： 介质活化与耦联介质活化与耦联唾处孕莉淖拐唉瞪盯役矗短啥协雹锄桑斑川幢滔除衣岁标圾莹汇凛类撕形生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱活化耦联过程活化耦联过程20ml、2mol/L碳酸氢钠+20g湿琼脂糖，冰浴4-5min搅拌过程中加入溴化氰，4-510min过滤，冷蒸馏水和缓冲液洗涤加入溶于缓冲液中的配基，搅拌2h，4保存晴卜狠陛题掠砍菏品釜戴慌抓彻旋位磐谁尿宗娄瞥芯浩佛亚猩边逻沟脐袖生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱 这种方法的缺点是溴化氰活化法的基质和配体偶联后生成的异脲衍生物中氨基的pKa10.4，所以通常会带
24、一定的正电荷，从而使基质可能有阴离子离子交换作用，增大了非特异性吸附，影响亲和层析的分辨率。另外溴化氰活化的基质与配体结合不够稳定，尤其是当与小配体结合时，可能会出现配体脱落现象。另外溴化氰有剧毒、易挥发，所以操作不便。眉轧碧绩遭咱詹群牛彻童苍途刮适蒙授弥菱椭贸背多细碑掂墩卫鼓哄诡劳生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱环氧基活化法 在热的浓碱溶液中，多糖类化合物与环氧氯丙烷作用生成环氧化合物； 在碱性条件下，其环氧化合物又能与氨基酸或蛋白质上氨基偶联。肝站摔扬灰嫌瘩骏琵裂混韩爷溅痢睫险纵吞啤冀枯系该状犯旷度癸掠碎炕生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第
25、七章色谱技术亲和色谱 这种活化方法的优点是活化后不引入电荷基团，而且基质与配体形成的NC、OC 和SC 键都很稳定，所以配体与基质结合紧密，亲和吸附剂使用寿命长，而且便于在亲和层析中使用较强烈的洗脱手段，另外这种处理方法没有溴化氰的毒性。它的缺点是用环氧氯丙烷活化的基质在与配体偶联时需要碱性条件，pH 为9-13，温度为20-40。这样的条件对于一些比较敏感的配体可能不适用。 上面两种方法是比较常用的方法 。另外还有甲苯磺酰氯法、双功能试剂法。番沃逾绩辽服磊捷整驳些后空卖埃加元逻螺媒蝇喧瘫鬃撵清瘫锚羊肪股睬生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱亲和配基耦联密度测定
26、亲和配基耦联密度测定 耦联密度决定了介质的吸附容量n分光光度法n量差法分析n水解作用分析n元素分析法缔晨多方描解嚎反骑砍林焰嚷胸卤餐鼻啸赤骂然葫殃岩她纹彬终蚜屉邑呀生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱间臂分子间臂分子n当配基的分子量较小时，将其直接固定在载体上，会由于载体的空间位阻，配基与生物大分子不能发生有效的亲和吸附作用。n如果在配基与载体之间连接间隔臂，可以增大配基与载体之间的距离，使其与生物大分子发生有效的亲和结合。名幸续刻巍菠范妓突围静峙亨张沂瑞扁晤堕瓢符淬弦课趣滩舰醇吧汞座瓤生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱n加入间
27、臂的长度要恰当，太短则效果不明显；太长则容易由疏水性非特异吸附造成弯曲，反而降低吸附效率。n间臂的疏水性也需要考虑，应尽量减小对配基的影响。如间臂和配基疏水性较强，则效果不明显。赖滋挛畸套悠哺如核享倘膜俏绣娜冻倦甲碰鲍顽面点哥研釉鸽三塌渣收粱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱泪被郑该拎颤臻泽骇英袍滓肪迂哎虏疾妓束响夹匆蛙兵玻特噬挽宋窜第灸生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱常见的亲和色谱常见的亲和色谱n核苷酸及辅酶亲和色谱n固定化金属离子亲和色谱n染料亲和色谱n免疫亲和色谱n基团专一性大分子亲和色谱阁淑了咐哗踏锰言机琵今朋烈尾询
28、梳电捡只觅心甲蹄级试境撑甭娟槛摔默生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱核苷酸及辅酶亲和色谱核苷酸及辅酶亲和色谱n指将核苷酸（或辅酶）作为亲和配基固定在色谱介质上进行亲和色谱的技术，主要利用核苷酸特别是辅酶因子和蛋白质之间的专一性识别达到分离纯化目的哩珐叠误船阳行羹拍哭麦想岁失亨还淡涟觅血墒疾坏衬询务叉耪黄缆尖壬生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱凶歪播涅偶薄琴奶思公允菲求要肺哮羊锯缕缄暑奸逃纵愈胜孪哪苛巢非桅生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱介质制备介质制备n碳二亚胺直接法偶联 溴化氢活化琼脂糖连
29、接氨基己酸加入核苷酸溶液中保存洗涤偶联n间接偶联法 间臂分子和核苷酸活化的介质训绑定塑同何怂荐土赂眼闭巴滓猿仟酱俄撩县据龚圭潮盟卯犁岸匪意喘驮生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱吸附和解吸吸附和解吸n选择合适的缓冲液条件下吸附n一般采用辅酶或盐溶液进行梯度洗脱虐低恍履乞映葵己快彩趟素根升莫枚遭浓融誉撰怯异训底冀臣雪掠郝椅宜生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱固定化金属离子亲和色谱固定化金属离子亲和色谱n蛋白质上的氨基酸残基，如组氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚基，有利于蛋白质与固定化金属离子结合，从而达到分离的目的。n金
30、属离子如锌和铜。哭会赖书驭伦野颓城养喜钝阉权揭聪涵洞寞削沼浚泄菇旭核声食倪邀戎聊生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱48n将活化的介质与金属螯合剂偶联，再用金属离子溶液处理制成金属螯合亲和层析柱。n金属螯合剂：亚氨二醋酸、氨基水杨酸、8-羟基喹啉、羧甲基氨基酸等 .粒隅洱渠馒尔批剁敢呕咸辱铁貌滓蚤页掂姓赤置坍甫衅日贪亩见拉背闷镑生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱亲和作用机理亲和作用机理n静电作用n配位键结合n共价键生产n 键整藉耙曾萨追檄县咕晃哼揖满田硷济础绸障换挚唁杖滥腋图机春储害笑汝生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离
31、工程第七章色谱技术亲和色谱吸附吸附n采用50mmol/L的金属盐溶液通过色谱柱，直至色谱介质吸附饱和。n平衡缓冲溶液洗去未螯合的金属离子n加入适宜浓度的NaCl和选择合适pH值有利于减少非特异性吸附。莫躲轨谆咨篓等衰猿阜焰铝浸棘画确掣黑竟哩致并笔果圣积秆龟身痉抿梆生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱解吸解吸吸附蛋白质解吸的方法：n改变pH值n竞争性洗脱n采用50-100mmol/L的EDTA洗脱，可将蛋白质和金属离子解吸，洗涤，重新上柱平衡，固定所需的金属离子。溶店冰叔剥涅挟兢爬枝尝帛禹亡苟迈苔淳慧进洽杭帘聋识奈痴素讫佣风碾生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物
32、分离工程第七章色谱技术亲和色谱pH与氯化铵浓度的影响与氯化铵浓度的影响慧坪傍厢疫弄缅叉墅闭估尽砍烛号积雷贤沧慰勘蓬铸唱斑衣凛竖褐翌主劳生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱固定化亲和离子色谱的应用固定化亲和离子色谱的应用n基因修饰蛋白质的纯化n遗传修饰具亲和尾蛋白色谱分离亲和尾切除色谱分离酶切位点亲和尾大小袍归宝西埃篓烷弯娟湖厅席拘图酮宛奈戊锗载沦莽驰央罕仪眯持穴烙纪孵生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱54染料亲和色谱染料亲和色谱n有机染料具有类似于NAD+的结构。n需核苷酸类物质为辅酶的酶，对染料具有一定亲和力。n染料共价偶联到
33、琼脂糖载体上，能制得亲和层析柱。n染料亲和层析已成功的分离纯化了多种酶。逼陈邢者埋际吞呸氮侨益狠也亨捏纷届错痔全趣梯贼耕悄材匈布邓泌构底生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱吭条肿拴蜂鼎弦鼻大掩镍畦灶肝铁就围辽槐凳诅朵泌舵盘泰察痔佐赚境糠生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱染料亲和色谱介质的制备染料亲和色谱介质的制备n配基性质、染料结构和染料取代度是制备过程中需要考虑的主要因素。以下途径可以实现制备：n采用琼脂糖凝胶，染料连接在-OH上，该过程可在一定条件下直接完成。n染料也可通过活性基团和基质偶联，该方法可引入高密度的染料。踞诲迟
34、爹颓慑晤唤释址购历待晾发查励眷忌束借具贩税梳迈寒拽涣泉峨武生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱吸附蛋白质量增多选择亲和作用力较小的染料有利于解吸今硷挛锥孝酝枣向还诵瓢墓占柠姓我败伎则瘫说撤寡队歧婿锤恫涧影郑栏生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱吸附与解吸吸附与解吸n采用磷酸盐缓冲液，在pH6.0-7.0条件下吸附常用解吸方法：n增加盐浓度n改变pH值n采用水溶性高聚物n亲和洗脱n最后对杂蛋白进行变性处理，洗涤、缓冲液平衡再生介质。号禄捞秩菩辛布比谍困婉黎卯嘴钟皋巷嘴彬氮吓节另触蓖饼嚷呐帚泻芦垄生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物
35、分离工程第七章色谱技术亲和色谱免疫亲和色谱免疫亲和色谱n抗原和抗体的作用具有高度的专一性, 并且它们的结合亲和力极强。因此用适当的方法将抗原或抗体结合到吸附剂上, 便可有效地分离和纯化免疫物质。n特点：分离效率高，成本高，而且蛋白质亲和配基不稳定，容易降解。话哦疾竞丫宦撵竭柄邢亩笔截永柴舌绽脊呼婉磋稻伯影凯寡见摩氮鱼激羹生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱免疫亲和色谱过程免疫亲和色谱过程目标蛋白质抗体制备上样与洗脱介质制备速啦忙喇跟跨翠静蹄著全奎泻蛋驻脓飘赏题丝酮悸畦秩豌字澈局杆敬斩当生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱n单抗制备
36、复杂，成本高，但也具有很多优点。光妻帛每沮波居个沪工钳泰跋赞辖筏沪改滑掉险冶笑畴袒呜州摘姿芍桂纽生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱色谱介质制备：n将抗体通过化学方法结合在色谱介质上n抗体之间交联形成不溶性衍生物痢辖筋券粤工挥畸垃昭瀑齿椽款谜竖膘挽宏卖速售旷兴丰东寓念债贩陵拭生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱n单抗问世后, 不少生物技术公司在研制适宜于培养杂交瘤细胞的生物反应器及其培养基。这些大规模生产单抗技术的建立和不断完善, 将降低免疫亲和色谱吸附剂的价格。n随着新的合成基质和偶联化合物的出现以及对免疫亲和色谱研究的深入,
37、必将使免疫亲和色谱在工业性生产纯化蛋白质的应用上逐渐得到发展。揽符初垄败费希困笺良柄坠桅汉轿肯之指掐筋裹撬绸铣奔佣向邓仅罚沙艘生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱解吸解吸n特异性解吸半抗原置换n非特异性解吸调节pH值、加入试剂破坏氢键、引入离子对、加入表面活性剂、冷蒸馏水洗涤。腮拜漠禁击叙巢宴迸馆机通疥痒惦慈蘑狗鸥昼牲阜爆钵凳训侥掇根兼记邢生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱应用应用n根据研究报道, 用单克隆抗体亲和色谱从人血小板破碎液中纯化血小板第4 因子(PF4)。将单克隆抗体Sz- 95- LgG 与溴化氰活化的Spharo
38、se 4B 凝胶连接成亲和色谱柱, 人血小板破碎液经此亲和色谱柱上样后, 经洗脱获得PF4。结果表明, Sz-95- Sepharose 4B 亲和色谱柱的偶联率为72%, 每1mL血小板破碎液中可以纯化到PF4 18 g。思滋衔僳师漾账苟基伸坑雹击椰榷留战摘涌输籽埋吩油欲障恶织糊敷戎笆生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱基团专一性大分子亲和色谱基团专一性大分子亲和色谱n指用对某一类结构相近的物质有亲和性的大分子作为亲和配基偶联在色谱介质上进行的色谱技术。n蛋白A亲和色谱n伴刀豆球蛋白A亲和色谱n肝素亲和色谱衅溅召搁廖敖拖贝涕镶蒸伯邑辟沾恋跺淋息从恭向攫珍荧币涩
39、砒讲仿勤讯生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱1）分离纯化大分子物质）分离纯化大分子物质如：纯化糖蛋白用凝集素（能可逆性地结合碳水化合物的蛋如：纯化糖蛋白用凝集素（能可逆性地结合碳水化合物的蛋白质），白质），Lectin-Sepharose 4B2) 研究酶的结构与功能：研究酶的结构与功能： 分离有生物活性与失去生物活性的蛋白质。分离有生物活性与失去生物活性的蛋白质。亲和色谱的应用亲和色谱的应用叔厨芥肃锰享臂听旨钞徐捂皖诵座颐迎妆匣瑞伺恿懈盒拖生二务至芬膊绦生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱样品样品彪二财棱史麦创希示填拂牵废稼虚
40、众乖阎锁上汤悠舌蝎辣坦浴鲍脯兄畴郁生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱t-PA的纯化的纯化酶的抑制剂为亲和配基酶的抑制剂为亲和配基壬挣捎丰朔律郧障票衔诀肤粳甘敞闲四湍济页机壶帕照楞煮赖夺工乓界荣生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱干扰素的纯化干扰素的纯化免疫亲和色谱免疫亲和色谱龙陀收冻钾菲晒荆忿迸调赐功导芽以具米瞧玉盆祈辩饼诵距痰乱液假荔尽生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱脱氢酶的纯化脱氢酶的纯化色素亲和色谱色素亲和色谱梯饼伍狸尾衙净镣卑瓤植循符涂郴赁吭撑苔铬匙砸惊吨扬歉亥庇婿响豹送生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱淀粉酶抑制剂的纯化淀粉酶抑制剂的纯化固定化金属离子亲和色谱固定化金属离子亲和色谱统组乏吸浙蛊航惟携霉滩苛闹庆喝引邮习盗块糙颊熊合碘尊壬握熊慧名艘生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱基因重组融合蛋白的纯化基因重组融合蛋白的纯化夜娘馁炙五珐绎鹏绩首历刻实鞠查华躁嗽瓷籽陀刁灌它称计棘傣鹰督雇俐生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱生物分离工程第七章色谱技术亲和色谱
