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1、酶促反应动力学酶促反应动力学(Enzyme Kinetics)1酶动力学1财富值n反应进行的方向反应进行的方向n反应进行的可能性反应进行的可能性n反应进行的限度反应进行的限度n反应进行的速率反应进行的速率n反应机制反应机制化学热力学化学热力学化学动力学化学动力学研究酶促反应的速率以及影响反应速研究酶促反应的速率以及影响反应速率的各种因素的科学率的各种因素的科学.2酶动力学1财富值 影响反应速率因素包括影响反应速率因素包括:酶浓度、底物浓度、酶浓度、底物浓度、pH、温度、温度、 抑制剂、激活剂等。抑制剂、激活剂等。研究一种因素的影响时，其余各因素均恒定。研究一种因素的影响时，其余各因素均恒定。3
2、酶动力学1财富值（一）（一）. 酶促反应动力学基础酶促反应动力学基础n酶促反应速度一般在规定的反应条件下，酶促反应速度一般在规定的反应条件下，用用单位时间内底物的消耗量和产物的生成量来单位时间内底物的消耗量和产物的生成量来表示表示n反应速度取其初速度，即底物的消耗量很小反应速度取其初速度，即底物的消耗量很小（一般在（一般在5以内）时的反应速度以内）时的反应速度n底物浓度远远大于酶浓度底物浓度远远大于酶浓度4酶动力学1财富值单位时间底物浓单位时间底物浓度减少或产物浓度减少或产物浓度增加量度增加量1. 反应速率及其测定反应速率及其测定5酶动力学1财富值2.反应分子数和反应级数反应分子数和反应级数反
3、应分子数反应分子数(1)单分子反应单分子反应 A B(2)双分子反应双分子反应A+B C+DV=-dc/dt=kcV=-dc/dt=kc1c26酶动力学1财富值 速率与反应物浓度的一次方成正比。速率与反应物浓度的一次方成正比。二级反应二级反应 速率与反应物浓度的速率与反应物浓度的2次方（或两种物质的浓度的乘积）次方（或两种物质的浓度的乘积）成正比成正比。 一级反应一级反应反应级数反应级数零级反应零级反应 反应速率与反应物的浓度无关，为常数反应速率与反应物的浓度无关，为常数速率常数与半衰期成反比，与反应物初浓度无关速率常数与半衰期成反比，与反应物初浓度无关对时间作图，为直线，斜率为对时间作图，为
4、直线，斜率为K半衰期与初浓度成反比半衰期与初浓度成反比7酶动力学1财富值平衡常数平衡常数n平衡：可逆反应的正向反应和逆向反应仍在继平衡：可逆反应的正向反应和逆向反应仍在继续进行，但反应速率相等的动态过程。续进行，但反应速率相等的动态过程。n反应的平衡常数与酶的活性无关，与反应速率反应的平衡常数与酶的活性无关，与反应速率的大小无关，而与反应体系的温度、反应物及的大小无关，而与反应体系的温度、反应物及产物浓度有关。产物浓度有关。8酶动力学1财富值（二）底物浓度对酶反应速度的影响（二）底物浓度对酶反应速度的影响9酶动力学1财富值1 中间络合物学说中间络合物学说Henri和和Wurtz提出提出10酶动
5、力学1财富值中间产物的证据中间产物的证据n中间复合物的直接观察n光谱改变n酶的物理性质改变n分离结晶n酶和底物的共沉降11酶动力学1财富值当底物浓度较低时当底物浓度较低时反应速度与底物浓度成正比；反反应速度与底物浓度成正比；反应为一级反应。应为一级反应。SSV VVmaxVmax12酶动力学1财富值随着底物浓度的增高随着底物浓度的增高反应速度不再成正比例加速；反应反应速度不再成正比例加速；反应为混合级反应。为混合级反应。SSV VVmaxVmax13酶动力学1财富值当底物浓度高达一定程度当底物浓度高达一定程度反应速度不再增加，达最大速度；反应速度不再增加，达最大速度；反应为零级反应反应为零级反
6、应SSV VVmaxVmax14酶动力学1财富值酶反应的速度在不停地变，实验上酶反应的速度在不停地变，实验上只有初速度的测定才有意义。只有初速度的测定才有意义。15酶动力学1财富值2. 单底物酶促反应动力学单底物酶促反应动力学（1）.米氏方程的提出米氏方程的提出1913年年Michaelis和和Menten推导推导了米氏方程了米氏方程S：底物浓度：底物浓度V：不同：不同S时的反应速度时的反应速度Vmax：最大反应速度：最大反应速度(maximumvelocity) m：米氏常数：米氏常数(Michaelisconstant) 16酶动力学1财富值（2）.米氏方程的推导米氏方程的推导根据酶反应的
7、中间复合物学说（快速平衡）根据酶反应的中间复合物学说（快速平衡）( () )S S与与E E形成中间产物，且整个反应速度取决形成中间产物，且整个反应速度取决于于 ES P+E ES P+E( () ) SE SE两点假设两点假设17酶动力学1财富值根据酶反应的中间复合物学说（快速平衡）根据酶反应的中间复合物学说（快速平衡）ES的生成速度的生成速度K1（E - ES）SES的分解速度的分解速度K2ES K1（E - ES）S 酶反应速度酶反应速度V与与ES成正比成正比 Vmax K3ES K3E 18酶动力学1财富值Briggs认为并不总是K3K2, ES E+P这一步也可能速度很快，这时，E，
8、S和ES将不能处于一个平衡状态。布氏提出稳态理论。Briggs和和Haldane提出稳态平衡理论提出稳态平衡理论19酶动力学1财富值酶催化的反应中各成份的变化酶催化的反应中各成份的变化20酶动力学1财富值稳态理论的假设稳态理论的假设21酶动力学1财富值 游离酶浓度游离酶浓度=E-ES ES生成速度生成速度=k1（E-ES） S ES分解速度分解速度=k2ES+ k3ES 当稳态时：当稳态时： ES生成速度生成速度=ES分解速度分解速度 k1（E-ES） S= k2ES+ k3ES稳态米氏方程的推导稳态米氏方程的推导 22酶动力学1财富值（E-ESE-ES） SS k k2 2+ k+ k3 3
9、 ES k ES k1 1 ESES= = = = 因因因因v=kv=k3 3ESES，当所有，当所有，当所有，当所有E E被被被被S S饱和时，即达到最大速饱和时，即达到最大速饱和时，即达到最大速饱和时，即达到最大速度，此时度，此时度，此时度，此时ES=EES=E，Vmax=kVmax=k3 3 E E 代入上式：代入上式：代入上式：代入上式：=KmESKm+Sv=k3ESKm+SVmaxSKm+S=23酶动力学1财富值快速平衡假说与稳态平衡假说的实快速平衡假说与稳态平衡假说的实质区别质区别24酶动力学1财富值k+1k-1k+225酶动力学1财富值a当当SKm时，时，v=(Vmax/Km)
10、S, 即即v 与与S成正比成正比b当当SKm时，时，v Vmax，即即S 而而v不变不变c当当SKm时，时，v=1/2Vmax(3)米氏方程的讨论米氏方程的讨论26酶动力学1财富值n. v- S曲线：近似双曲线曲线：近似双曲线 当当SKm（ S很小时）很小时）即即v 与与S成正比成正比 当当SKm（ S很大时）很大时）v Vmax，酶被底物饱和，酶被底物饱和，v与与S无关无关 当当v=1/2Vmax时，时， SKm（mol/L)27酶动力学1财富值A. Km值是酶的特值是酶的特征性常数。与酶征性常数。与酶的浓度无关，不的浓度无关，不同的酶，其同的酶，其Km值不同值不同 Km 酶促反应速度为酶促
11、反应速度为最大反应速度最大反应速度（Vmax)的一的一 半时的半时的底物浓度底物浓度。单位是单位是mol/l。动力学参数的意义动力学参数的意义28酶动力学1财富值B.物理意义物理意义:酶促反应速度为酶促反应速度为最大反应速度最大反应速度（Vmax)的一的一 半时的半时的底物浓度底物浓度。D. Km可判断酶的可判断酶的专一性专一性和和天然底物天然底物。如酶能催。如酶能催化几种不同的底物，对每种底物都化几种不同的底物，对每种底物都 有一个特定有一个特定的的Km值，其中值，其中Km值最小的称该酶的最适底物值最小的称该酶的最适底物。C. Km除了与底物类别有关，还与除了与底物类别有关，还与pH、温度有
12、关，、温度有关，不同的不同的条件条件下有不同的下有不同的Km值。值。29酶动力学1财富值E. Km值值近似等于近似等于ES的解离常数的解离常数Ks，可，可表示酶表示酶与底物之间的亲和力：与底物之间的亲和力：Km越大，亲和力越小，酶的催化活性低；越大，亲和力越小，酶的催化活性低； Km越小，亲和力越大，酶的催化活性高越小，亲和力越大，酶的催化活性高30酶动力学1财富值31酶动力学1财富值F.根据正逆反应根据正逆反应Km的差别及细胞内正逆两的差别及细胞内正逆两相底物的浓度推测酶促反应的相底物的浓度推测酶促反应的正逆方向正逆方向。G.根据代谢途径中各个酶的根据代谢途径中各个酶的Km及其相应底及其相应
13、底物浓度判断物浓度判断限速步骤。限速步骤。H.根据根据Km值的大小判断值的大小判断分支代谢的流向。分支代谢的流向。32酶动力学1财富值Km可以推断某一代谢物在体内可能的代谢途径可以推断某一代谢物在体内可能的代谢途径:丙酮酸丙酮酸乳酸乳酸乙酰乙酰CoA乙醛乙醛乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶（1.710-5）丙酮酸脱氢酶丙酮酸脱氢酶（1.310-3）丙酮酸脱羧酶丙酮酸脱羧酶（1.010-3）当丙酮酸浓度较低时，代谢走哪条途径决定于当丙酮酸浓度较低时，代谢走哪条途径决定于Km最小的酶最小的酶。33酶动力学1财富值nVmax不是一个常数，它取决于酶的浓度，它不是一个常数，它取决于酶的浓度，它是一个酶反应体系的速
14、度的极限值。是一个酶反应体系的速度的极限值。 Vmax=K3 EnK3代表酶被底物饱和时每秒钟每个酶分子转换代表酶被底物饱和时每秒钟每个酶分子转换底物的分子数，称为底物的分子数，称为转换数或催化常数转换数或催化常数， （ catalytic constant,Kcat）。）。Kcat值越大，值越大，表示酶的催化效率越高表示酶的催化效率越高。 Vmax和k3(kcat)34酶动力学1财富值 Kcat/Km表示酶的实际催化效率表示酶的实际催化效率Kcat/Km是是E和和S反应形成产物的反应形成产物的表观二表观二级速率常数，也称为专一性常数。级速率常数，也称为专一性常数。35酶动力学1财富值只有只有
15、Kcat/Km可以客观地比较不同的可以客观地比较不同的酶或同一种酶催化不同底物的催化效率酶或同一种酶催化不同底物的催化效率36酶动力学1财富值(4) 作图法测定作图法测定Km和和VmaxnLineweaver-Burk 双倒数作图法nHanes-Woolf作图法nWoolf-Augustinson-Hofstee作图法nEisenthalCornish-Bowden作图作图法测定测定测定测定KmKm和和和和V V的方法很多，最常用的是的方法很多，最常用的是的方法很多，最常用的是的方法很多，最常用的是LineweaverLineweaverBurkBurk的作图法的作图法的作图法的作图法 双倒数
16、作图法双倒数作图法双倒数作图法双倒数作图法。37酶动力学1财富值Lineweaver-Burk 双倒数作图法38酶动力学1财富值实实例例 Neurospora crassa 的的D-丝氨酸脱水酶催化反应：丝氨酸脱水酶催化反应：CH2OH CHNH2 COOH CH3CO COOH+NH3在实验中测定酶的饱和曲线得到下列数据：在实验中测定酶的饱和曲线得到下列数据： s v 10 -5（M） 20分钟生成丙酮酸分钟生成丙酮酸（ M） 0.20 0.150 0.40 0.200 0.85 0.275 1.25 0.315 1.70 0.340 2.00 0.350 8.00 0.36039酶动力学1
17、财富值用这些数据求丝氨酸脱水酶的表观米氏常数。用这些数据求丝氨酸脱水酶的表观米氏常数。 vVm0.30.2Vm20.1012345678 10-6S丙丙酮酮酸酸 M/20minVmax=0.361/2Vmax=0.18Km=3.2 10-7解：解：1、v对对S作图法作图法:40酶动力学1财富值 S 1/S v 1/v 0.20 5.0 0.150 6.66 0.40 2.5 0.200 5.00 0.85 1.17 0.275 3.64 1.25 0.80 0.315 3.17 1.70 0.58 0.340 2.94 2.00 0.50 0.350 2.86 8.00 0.125 0.360
18、 2.78解解2、1/v对对1/S作图法：作图法：41酶动力学1财富值7654321-4-3-2-10123451/v1/S-1/Km=-2.85 105Km=3.51 10-61/Vm=2.55;Vm=0.3942酶动力学1财富值(三）三）. pH对酶促反应速度的影响对酶促反应速度的影响最适最适pH：酶具有酶具有最大催化活性时的最大催化活性时的环境环境pH。典型的酶速度典型的酶速度-pH曲线是较窄的曲线是较窄的钟罩型曲线。钟罩型曲线。43酶动力学1财富值最适pH与底物种类、浓度及缓冲液成分有关。44酶动力学1财富值（四）（四）.温度对酶促反应速度的影响温度对酶促反应速度的影响提高温度，提高温
19、度，加快反应速度加快反应速度。温度系数温度系数Q10：温度升高：温度升高10，反应速度与，反应速度与原来的反应速度之比，大多数酶的原来的反应速度之比，大多数酶的Q10一一般为般为2。提高温度，提高温度，酶变性酶变性失活。失活。在一定范围内，反应速度达到最大时对应的在一定范围内，反应速度达到最大时对应的温度称为该酶促反应的最适温度温度称为该酶促反应的最适温度(optimum temperature).45酶动力学1财富值最适温最适温不是酶的特征性常数。不是酶的特征性常数。46酶动力学1财富值（五）五）.酶浓度对酶促反应速度的影响酶浓度对酶促反应速度的影响n当当S E ，反应，反应速度对酶浓度呈正
20、比。速度对酶浓度呈正比。n关系式为：关系式为：V=K3 E n机理：酶浓度增加，机理：酶浓度增加，ES也增加，反应速也增加，反应速度增加。度增加。47酶动力学1财富值（六）（六）.激活剂对酶促反应速度的影响激活剂对酶促反应速度的影响 激活剂（激活剂（activator):凡是能提高酶活性的凡是能提高酶活性的物质物质n无机离子的激活作用无机离子的激活作用金属离子：金属离子：K+ 、Mg2+ 、Zn2+阴离子：阴离子：Cl-、Br n有机小分子化合物的激活作用有机小分子化合物的激活作用n蛋白酶对酶原的激活蛋白酶对酶原的激活48酶动力学1财富值（七）（七）.抑制剂对酶活性的影响抑制剂对酶活性的影响4
21、9酶动力学1财富值50酶动力学1财富值六、六、酶促反应动力学酶促反应动力学(Enzyme Kinetics)51酶动力学1财富值（1）. 抑制程度的表示方法抑制程度的表示方法52酶动力学1财富值 (2）抑制反应类型 巯基酶抑制剂巯基酶抑制剂*专一性抑制专一性抑制丝氨酸酶抑制剂丝氨酸酶抑制剂不可逆抑制不可逆抑制非专一性抑制非专一性抑制抑制作用抑制作用*竞争性抑制作用竞争性抑制作用可逆性抑制可逆性抑制非竞争性抑制作用非竞争性抑制作用反竞争性抑制作用反竞争性抑制作用53酶动力学1财富值1.不可逆抑制作用（不可逆抑制作用（irreversible inhibition) I 以以共价键共价键与与E活性
22、中心上的活性中心上的必需基团必需基团 结合，从而抑制酶结合，从而抑制酶活性。这种活性。这种I不能用透析、超不能用透析、超滤等物理方法除去抑制剂而滤等物理方法除去抑制剂而恢复酶活性恢复酶活性. 常见抑制剂丝氨酸酶抑制剂常见抑制剂丝氨酸酶抑制剂巯基酶抑制剂巯基酶抑制剂n如有机磷毒剂二异丙基氟磷酸酯。如有机磷毒剂二异丙基氟磷酸酯。 54酶动力学1财富值n这类抑制剂这类抑制剂I与酶蛋白以非共价键结合，引起与酶蛋白以非共价键结合，引起酶活力降低或丧失。可用透析，超滤等物理方酶活力降低或丧失。可用透析，超滤等物理方法除去抑制剂法除去抑制剂I而恢复酶活性。而恢复酶活性。类型类型： 竞争性抑制竞争性抑制(co
23、mpetitive inhibition) 非竞争性抑制非竞争性抑制(noncompetitive inhibition) 反竞争性抑制反竞争性抑制( uncompetitive inhibition)2.可逆抑制作用可逆抑制作用(reversible inhibition)55酶动力学1财富值.竞争性抑制竞争性抑制n抑制剂具有与底物类似的结构，竞争酶的活性中心，抑制剂具有与底物类似的结构，竞争酶的活性中心，并与酶形成可逆的并与酶形成可逆的EI复合物，阻止底物与酶结合。复合物，阻止底物与酶结合。56酶动力学1财富值1. i与与S结构相似；结构相似；2. i与与S互相竞争与酶活性中心结合；互相竞
24、争与酶活性中心结合；3. 抑制程度取决于抑制程度取决于i 和和S的相对比例；的相对比例；4. S，可以减少或去除抑制作用。，可以减少或去除抑制作用。（Km， Vmax不变）不变）5. 排斥性抑制排斥性抑制竞争性抑制的特点竞争性抑制的特点57酶动力学1财富值.非竞争性抑制非竞争性抑制n抑制剂与酶活性中的以外的基团结合，但形成中间的抑制剂与酶活性中的以外的基团结合，但形成中间的三元复合物三元复合物ESI不能进一步分解为产物，因此，酶的活不能进一步分解为产物，因此，酶的活性降低性降低。58酶动力学1财富值非竞争性抑制作用特点非竞争性抑制作用特点1.i与与S结构不相似；结构不相似；2.i与与S互不干扰
25、同时与互不干扰同时与酶酶结合；结合；3.抑制程度只取决于抑制程度只取决于ii的浓度；的浓度； 4. S 4. S，不能去除抑制作用。，不能去除抑制作用。 （KmKm不变，不变， Vmax Vmax） 5. 5. 是一种是一种旁若无人式旁若无人式的抑制的抑制59酶动力学1财富值.反竞争性抑制反竞争性抑制酶只有在与底物结合后，酶只有在与底物结合后， 才能与抑制剂结合。才能与抑制剂结合。E+SES+I ESI P常见于多底物的酶促反应中常见于多底物的酶促反应中60酶动力学1财富值61酶动力学1财富值(3)酶抑制作用的动力学酶抑制作用的动力学可逆抑制作用和不可逆抑制作用的鉴别可逆抑制作用和不可逆抑制作
26、用的鉴别透析、超滤、凝胶过滤能否除去抑制剂透析、超滤、凝胶过滤能否除去抑制剂动力学方法：动力学方法：酶浓度酶浓度对对反应速度反应速度作图，不可逆抑制剂作图，不可逆抑制剂使直线使直线右移右移，可逆抑制剂使直线的，可逆抑制剂使直线的斜率下降斜率下降。62酶动力学1财富值Ki为抑制剂常数,即EI的解离平衡常数。为的解离平衡常数：游离酶的浓度：酶的总浓度1.竞争性抑制米氏方程的推导竞争性抑制米氏方程的推导63酶动力学1财富值64酶动力学1财富值与标准方程的比较当当I0时，方程还原成米氏方程。时，方程还原成米氏方程。 I时，时， 65酶动力学1财富值双倒数作图66酶动力学1财富值Eo=E+ES+EI+E
27、IS67酶动力学1财富值当当I0 I 与米氏方程比较 68酶动力学1财富值双倒数作图 抑制程度: 抑制程度决定于I ，与底物S无关69酶动力学1财富值70酶动力学1财富值与米氏方程比较 71酶动力学1财富值双倒数作图72酶动力学1财富值不同类型抑制作用的米氏方程不同类型抑制作用的米氏方程73酶动力学1财富值非竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制反竞争性抑制竞争性抑制竞争性抑制74酶动力学1财富值（4）抑制剂）抑制剂1.不可逆抑制剂不可逆抑制剂有机磷化合物有机磷化合物有机磷化合物有机磷化合物有机汞和有机砷化合物有机汞和有机砷化合物有机汞和有机砷化合物有机汞和有机砷化合物重金属盐重金属盐重金属盐重金
28、属盐烷化试剂烷化试剂烷化试剂烷化试剂氰化物、硫化物和氰化物、硫化物和氰化物、硫化物和氰化物、硫化物和COCO青霉素青霉素青霉素青霉素 非专一性的不可逆抑制剂非专一性的不可逆抑制剂与酶活性中心及活性中心外某一类或几类必需基团反应与酶活性中心及活性中心外某一类或几类必需基团反应75酶动力学1财富值巯基酶抑制剂抑制剂：重金属离子：抑制剂：重金属离子：Ag+、Hg2+、As3+等等巯基酶巯基酶失活的酶分子失活的酶分子76酶动力学1财富值丝氨酸酶抑制剂抑制剂：有机磷化合物抑制剂：有机磷化合物（胆碱酯酶）（胆碱酯酶）丝氨酸酶丝氨酸酶丝氨酸酶丝氨酸酶77酶动力学1财富值2. 可逆抑制剂可逆抑制剂 可逆抑制剂
29、中最重要和最常见的是可逆抑制剂中最重要和最常见的是竞争性抑制竞争性抑制剂剂 一些竞争性抑制剂与天然代谢物在结构上十一些竞争性抑制剂与天然代谢物在结构上十分相似，能选择性的抑制病菌或癌细胞在代谢分相似，能选择性的抑制病菌或癌细胞在代谢过程中的某些酶，而具有抗菌和抗癌作用。过程中的某些酶，而具有抗菌和抗癌作用。 78酶动力学1财富值竞争性抑制剂有：竞争性抑制剂有：丙二酸丙二酸、草酰乙酸草酰乙酸等等琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶79酶动力学1财富值磺胺类药物的竞争性抑制作用磺胺类药物的竞争性抑制作用磺胺药与磺胺药与PABAPABA相互竞争与相互竞争与FHFH2 2合成酶结合合成酶结合( (p-aminobenzoicacid,PABA） sulfadrugs80酶动力学1财富值PABA二氢蝶呤啶二氢蝶呤啶谷氨酸谷氨酸FH2合成酶合成酶磺胺类药物磺胺类药物FH2FH2还原酶还原酶MTXFH4相互竞争相互竞争相互竞争相互竞争磺胺类药物的抑菌机理磺胺类药物的抑菌机理（-）（-）氨甲蝶呤（氨甲蝶呤（methotrexate,MTX）促进核酸促进核酸的合成的合成81酶动力学1财富值n基本要求n1.熟悉化学动力学基础。n2.掌握米氏方程及相关推导和计算。n3.掌握酶抑制作用的有关概念、动力学特点和 酶抑制作用的应用。n4.酶活性的测定与计算82酶动力学1财富值83酶动力学1财富值
