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1、蛋白质相对分子质量的测定蛋白质相对分子质量的测定蛋白质相对分子质量的测定蛋白质相对分子质量的测定SDSSDS- - - -聚丙烯酰胺凝胶电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳法【实验目的】理解电泳法测定蛋白质分子量的原理。理解电泳法测定蛋白质分子量的原理。掌掌握握SDS-SDS-聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳法法的的基基本本操操作作学会绘制标准曲线学会绘制标准曲线。 【实验原理】 聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺（AcrAcr）和和和和N N，N-N-甲叉双甲叉双甲叉双甲叉双丙烯酰胺丙烯酰胺丙烯酰胺
2、丙烯酰胺（BisBis）聚合）聚合）聚合）聚合而成，是一种具有交叉网状结构的而成，是一种具有交叉网状结构的而成，是一种具有交叉网状结构的而成，是一种具有交叉网状结构的凝胶，可以产生分子筛效应，其孔径大小可以通过配置凝胶，可以产生分子筛效应，其孔径大小可以通过配置凝胶，可以产生分子筛效应，其孔径大小可以通过配置凝胶，可以产生分子筛效应，其孔径大小可以通过配置药品的浓度来控制，常用作电泳的载体。药品的浓度来控制，常用作电泳的载体。药品的浓度来控制，常用作电泳的载体。药品的浓度来控制，常用作电泳的载体。 本实验利用了聚丙烯酰胺凝胶的电泳和分子筛本实验利用了聚丙烯酰胺凝胶的电泳和分子筛本实验利用了聚丙
3、烯酰胺凝胶的电泳和分子筛本实验利用了聚丙烯酰胺凝胶的电泳和分子筛 双重作用。双重作用。双重作用。双重作用。 十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（SDSSDSSDSSDS）是一种阴离子表面活性）是一种阴离子表面活性）是一种阴离子表面活性）是一种阴离子表面活性剂，它的疏水端可以与蛋白质分子结合。绝大多剂，它的疏水端可以与蛋白质分子结合。绝大多剂，它的疏水端可以与蛋白质分子结合。绝大多剂，它的疏水端可以与蛋白质分子结合。绝大多数蛋白质与数蛋白质与数蛋白质与数蛋白质与SDSSDSSDSSDS结合的质量比为结合的质量比为结合的质量比为结合的质量比为1.4:11.4:11.4:
4、11.4:1，使蛋白质，使蛋白质，使蛋白质，使蛋白质带上密度相同的负电荷，其电荷强度远远强于蛋带上密度相同的负电荷，其电荷强度远远强于蛋带上密度相同的负电荷，其电荷强度远远强于蛋带上密度相同的负电荷，其电荷强度远远强于蛋白质原有的电荷，这就掩盖因为蛋白质种类不同白质原有的电荷，这就掩盖因为蛋白质种类不同白质原有的电荷，这就掩盖因为蛋白质种类不同白质原有的电荷，这就掩盖因为蛋白质种类不同而造成的电荷差异，使电泳的迁移率仅与蛋白质而造成的电荷差异，使电泳的迁移率仅与蛋白质而造成的电荷差异，使电泳的迁移率仅与蛋白质而造成的电荷差异，使电泳的迁移率仅与蛋白质的分子量有关。的分子量有关。的分子量有关。的
5、分子量有关。 因此，我们可以测定标准蛋白质的迁移率，通过标因此，我们可以测定标准蛋白质的迁移率，通过标准蛋白质相对迁移率的对数对相对分子量作图，得到标准蛋白质相对迁移率的对数对相对分子量作图，得到标准曲线，根据标准曲线计算出未知蛋白质的相对分子质准曲线，根据标准曲线计算出未知蛋白质的相对分子质量。量。 本实验就是依据这个原理进行测定的。本实验就是依据这个原理进行测定的。【实验器材】DYCZ-24D型垂直板电泳仪型垂直板电泳仪移液管若干移液管若干100mL烧杯烧杯微量进样器微量进样器细长头吸管细长头吸管【试剂配制】1. 1.分离胶和浓缩胶分离胶和浓缩胶分离胶和浓缩胶分离胶和浓缩胶 试剂试剂名称名
6、称Acr/gAcr/gBis/gBis/g1mol/L1mol/L盐盐酸酸/ /mLmL三甲基氨基三甲基氨基甲烷甲烷（TrisTris）/g/g定容体积定容体积/ /mLmL分离胶分离胶贮存液贮存液30300.80.8100100（棕色（棕色瓶，冰箱瓶，冰箱中保存）中保存）分离胶分离胶缓冲液缓冲液484836.336.3100100浓缩胶浓缩胶贮存液贮存液10100.50.5100100（棕色（棕色瓶，冰箱瓶，冰箱中保存）中保存）浓缩胶浓缩胶缓冲液缓冲液48485.985.98100100【试剂配制】2. 2.电泳缓冲液（电泳缓冲液（电泳缓冲液（电泳缓冲液（Tris-Tris-甘氨酸缓冲液，甘
7、氨酸缓冲液，甘氨酸缓冲液，甘氨酸缓冲液，pH=8.3pH=8.3）：取）：取）：取）：取Tris6.0gTris6.0g，甘氨酸，甘氨酸，甘氨酸，甘氨酸28.8g28.8g，SDS1.0gSDS1.0g，用去离子水，用去离子水，用去离子水，用去离子水溶解后定容至溶解后定容至溶解后定容至溶解后定容至1L1L。3. 3.样品溶解液（用于溶解标准蛋白质及样品蛋白质）样品溶解液（用于溶解标准蛋白质及样品蛋白质）样品溶解液（用于溶解标准蛋白质及样品蛋白质）样品溶解液（用于溶解标准蛋白质及样品蛋白质）：取：取：取：取SDS0.1gSDS0.1g，巯基乙醇，巯基乙醇，巯基乙醇，巯基乙醇0.1mL0.1mL，
8、甘油，甘油，甘油，甘油1.0mL1.0mL，溴酚蓝溴酚蓝溴酚蓝溴酚蓝28.8g28.8g，0.2mol/L0.2mol/L磷酸缓冲液磷酸缓冲液磷酸缓冲液磷酸缓冲液0.5mL0.5mL，加，加，加，加重蒸馏水至重蒸馏水至重蒸馏水至重蒸馏水至10mL10mL。4. 4.染染染染 色色色色 液液液液 ： 0.25g0.25g考考考考 马马马马 斯斯斯斯 亮亮亮亮 蓝蓝蓝蓝 R-250R-250， 加加加加 入入入入454mL50%454mL50%甲醇溶液和甲醇溶液和甲醇溶液和甲醇溶液和46mL46mL冰乙酸冰乙酸冰乙酸冰乙酸。5. 5.脱色液脱色液脱色液脱色液：75mL75mL冰乙酸冰乙酸冰乙酸冰乙
9、酸，875mL875mL水与水与水与水与50mL50mL甲醇甲醇甲醇甲醇6.10%6.10%过过过过 硫硫硫硫 酸酸酸酸 钠钠钠钠 、 10%SDS10%SDS、 1%1%四四四四 甲甲甲甲 基基基基 乙乙乙乙 二二二二 胺胺胺胺（TEMEDTEMED）【试剂配制】【实验材料及预处理】 选选用用5种种相相对对分分子子质质量量已已知知的的蛋蛋白白质质作作为标准蛋白质：为标准蛋白质：溶菌酶溶菌酶（Mr=14300）胰凝乳蛋白酶原胰凝乳蛋白酶原（Mr=25000）胃蛋白酶胃蛋白酶（Mr=35000）卵清蛋白卵清蛋白（Mr=43000）血清白蛋白血清白蛋白（Mr=67000） 可可可可以以以以配配配配
10、成成成成单单单单一一一一标标标标准准准准蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质溶溶溶溶液液液液，也也也也可可可可配配配配制制制制成成成成混混混混合合合合蛋蛋蛋蛋白质标准溶液。白质标准溶液。白质标准溶液。白质标准溶液。 将将将将标标标标准准准准蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质和和和和待待待待测测测测蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质用用用用样样样样品品品品溶溶溶溶解解解解液液液液溶溶溶溶解解解解，使使使使浓度为浓度为浓度为浓度为0.5mg/mL0.5mg/mL，沸水浴加热，沸水浴加热，沸水浴加热，沸水浴加热3min3min，冷却至室温备用。，冷却至室温备用。，冷却至室温备用。，冷却至室温备用。 对对对对以以以以上上上上标标标标
11、准准准准蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质相相相相对对对对迁迁迁迁移移移移率率率率的的的的测测测测定定定定，以以以以相相相相对对对对迁迁迁迁移移移移率率率率的的的的对对对对数数数数对对对对标标标标准准准准蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质的的的的相相相相对对对对分分分分子子子子质质质质量量量量作作作作图图图图，可可可可得得得得标标标标准准准准曲线，由标准曲线求出待测蛋白质的相对分子质量。曲线，由标准曲线求出待测蛋白质的相对分子质量。曲线，由标准曲线求出待测蛋白质的相对分子质量。曲线，由标准曲线求出待测蛋白质的相对分子质量。 【实验步骤及操作方法】 1.1.安装垂直板电泳槽安装垂直板电泳槽 将将密密封封胶胶条条放放
12、在在平平直直玻玻璃璃板板上上，将将凹凹形形玻璃板与玻璃板与 平直玻璃板重叠。平直玻璃板重叠。 用手将两块玻璃板夹住，放入电泳槽内。用手将两块玻璃板夹住，放入电泳槽内。 用蒸馏水检漏用蒸馏水检漏 【实验步骤及操作方法】 2.2.凝胶制备凝胶制备（1）分离胶分离胶分离胶按下表加入试剂分离胶按下表加入试剂试剂试剂体积体积操作操作分离胶贮存液分离胶贮存液5.05.0分离胶缓冲液分离胶缓冲液2.52.510%SDS10%SDS0.20.2去离子水去离子水10.210.21%TEMED1%TEMED2.02.0混匀混匀10%10%过硫酸铵过硫酸铵0.10.1置于磁力搅拌器置于磁力搅拌器中搅拌中搅拌2min
13、2min 混混合合后后的的分分离离胶胶溶溶液液，用用细细长长头头吸吸管管加加入入玻玻璃璃板板缝缝隙隙内内，加加胶胶高高度度距距离离样样品品模模板板梳梳齿齿下下端端约约1cm，用用吸吸管管在在凝凝胶胶表表面面轻轻轻轻加加一一层层蒸蒸馏馏水水（约约3-4cm），使使凝凝胶胶隔隔绝绝空空气气，并并保保持持胶胶面面平平整整。等等待待分分离离胶胶凝凝固固后，将水倒出并用滤纸吸干剩余的水。后，将水倒出并用滤纸吸干剩余的水。（2）.浓缩胶浓缩胶浓缩胶按下表加入试剂浓缩胶按下表加入试剂 试剂试剂体积体积操作操作浓缩胶贮存液浓缩胶贮存液3.003.00浓缩胶缓冲液浓缩胶缓冲液1.251.251%TEMED1%T
14、EMED2.002.00去离子水去离子水4.604.6010%10%过硫酸铵过硫酸铵0.050.05置于磁力搅拌器置于磁力搅拌器中搅拌中搅拌2min2min 用用用用细细细细长长长长头头头头习习习习惯惯惯惯将将将将分分分分离离离离胶胶胶胶溶溶溶溶液液液液加加加加入入入入分分分分离离离离胶胶胶胶上上上上方方方方，距距距距离离离离段段段段玻玻玻玻璃璃璃璃板板板板上上上上沿沿沿沿0.5cm0.5cm处处处处，然然然然后后后后轻轻轻轻轻轻轻轻加加加加上上上上模模模模板板板板梳梳梳梳，等等等等待待待待浓浓浓浓缩缩缩缩胶胶胶胶凝凝凝凝固固固固后后后后，小小小小心心心心取取取取出出出出模模模模板板板板梳梳梳
15、梳，用用用用手手手手夹夹夹夹住住住住两两两两块块块块玻玻玻玻璃璃璃璃板板板板，取取取取出出出出胶胶胶胶室室室室，去去去去掉掉掉掉密密密密封封封封胶胶胶胶框框框框，用用用用1%1%电电电电泳泳泳泳缓缓缓缓冲冲冲冲液液液液琼琼琼琼脂脂脂脂胶胶胶胶密密密密封封封封底底底底部部部部，再再再再将将将将胶胶胶胶室室室室放放放放入入入入电电电电泳泳泳泳槽槽槽槽，然然然然后后后后加加加加入入入入电电电电泳泳泳泳缓缓缓缓冲冲冲冲液液液液，内内内内槽槽槽槽加加加加到到到到凹凹凹凹口以上，外槽加到具平直玻璃板上沿口以上，外槽加到具平直玻璃板上沿口以上，外槽加到具平直玻璃板上沿口以上，外槽加到具平直玻璃板上沿3mm3
16、mm处。处。处。处。3.3.3.3.电泳电泳电泳电泳 用用用用微微微微量量量量进进进进样样样样器器器器取取取取10-15L10-15L10-15L10-15L样样样样品品品品，小小小小心心心心加加加加入入入入到到到到凝凝凝凝胶胶胶胶凹凹凹凹槽槽槽槽内内内内，待待待待所所所所有有有有样样样样品品品品全全全全部部部部加加加加完完完完之之之之后后后后，打打打打开开开开电电电电源开始电泳。源开始电泳。源开始电泳。源开始电泳。 电电电电泳泳泳泳开开开开始始始始时时时时，将将将将电电电电流流流流调调调调至至至至10mA10mA10mA10mA，待待待待样样样样品品品品到到到到达达达达分分分分离离离离胶胶胶
17、胶与与与与浓浓浓浓缩缩缩缩胶胶胶胶交交交交界界界界时时时时，将将将将电电电电流流流流调调调调整整整整至至至至20-30mA20-30mA20-30mA20-30mA，当当当当溴溴溴溴酚酚酚酚蓝蓝蓝蓝迁迁迁迁移移移移到到到到分分分分离离离离胶胶胶胶底底底底部部部部时时时时，可可可可以以以以关关关关闭闭闭闭电电电电源源源源停止电泳。停止电泳。停止电泳。停止电泳。4.4.染色与脱色染色与脱色 取取出出玻玻璃璃胶胶室室，轻轻轻轻撬撬开开玻玻璃璃板板，取取出出凝凝胶。胶。 将将凝凝胶胶转转移移到到装装有有染染色色液液的的培培养养皿皿中中，染染色色1h1h左左右右，然然后后取取出出，用用蒸蒸馏馏水水漂漂洗
18、洗凝凝胶胶，转转入入脱脱色色液液中中脱脱色色，同同时时放放在在摇摇床床上上震震荡荡，期期间间更更换换3-4次次脱脱色色液液，直直到到可可以以清清晰晰的的分分辨辨蛋白质条带。蛋白质条带。 5. 5.结果处理结果处理结果处理结果处理 以以标标准准蛋蛋白白质质的的相相对对迁迁移移率率的的对对数数对对相相对对分分子子质质量量作作图图，得得到到标标准准曲曲线线，根根据据标标准准曲曲线线求出待测蛋白质的相对分子质量求出待测蛋白质的相对分子质量 【注意事项】 每次实验必须绘制标准曲线，不得使用上一次的标准曲线每次实验必须绘制标准曲线，不得使用上一次的标准曲线每次实验必须绘制标准曲线，不得使用上一次的标准曲线
19、每次实验必须绘制标准曲线，不得使用上一次的标准曲线 处处处处理理理理好好好好的的的的蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质样样样样品品品品液液液液如如如如果果果果长长长长期期期期存存存存放放放放，使使使使用用用用前前前前应应应应先先先先在在在在沸沸沸沸水水水水浴中加热浴中加热浴中加热浴中加热1min1min以除去亚稳态聚合。以除去亚稳态聚合。以除去亚稳态聚合。以除去亚稳态聚合。 若若若若样样样样品品品品为为为为溶溶溶溶液液液液，则则则则需需需需要要要要降降降降样样样样品品品品溶溶溶溶解解解解液液液液浓浓浓浓度度度度提提提提高高高高一一一一倍倍倍倍，再再再再与与与与样品等体积混合。样品等体积混合。样品等体积混
20、合。样品等体积混合。 在在在在向向向向玻玻玻玻璃璃璃璃缝缝缝缝隙隙隙隙中中中中注注注注胶胶胶胶时时时时，应应应应保保保保持持持持在在在在一一一一点点点点加加加加入入入入，而而而而加加加加水水水水时时时时，要不断移动吸管。要不断移动吸管。要不断移动吸管。要不断移动吸管。 进进进进样样样样时时时时，要要要要注注注注意意意意不不不不要要要要太太太太快快快快或或或或将将将将凹凹凹凹槽槽槽槽加加加加的的的的太太太太满满满满，防防防防止止止止样样样样品品品品溢溢溢溢出，对其他凹槽造成交叉污染。出，对其他凹槽造成交叉污染。出，对其他凹槽造成交叉污染。出，对其他凹槽造成交叉污染。 AcrAcr和和和和BisB
21、is均均均均为为为为神神神神经经经经毒毒毒毒剂剂剂剂，甲甲甲甲醇醇醇醇也也也也是是是是剧剧剧剧毒毒毒毒物物物物质质质质，使使使使用用用用应应应应注注注注意意意意安全安全安全安全【对实验的思考】在在配配制制样样品品溶溶解解液液时时，加加入入巯巯基基乙乙醇醇是是为为了了将将蛋蛋白白质质中中的的二二硫硫键键破破坏坏，使使蛋蛋白白质质更更容易与容易与SDS结合。结合。此此实实验验时时间间较较长长，主主要要是是由由于于染染色色脱脱色色事事件件较较长长。由由于于SDS可可以以吸吸附附考考马马斯斯亮亮蓝蓝，染染色色前前可可用用脱脱色色液液浸浸泡泡凝凝胶胶，洗洗去去SDS，可可缩缩短染色及脱色时间。短染色及脱色时间。
