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1、实验实验2 2分离分离以以尿素尿素为氮源的微生物为氮源的微生物此实验课题意义何在？此实验课题意义何在？1 1、尿素、尿素 尿素尿素是一种重要的是一种重要的农业氮肥。农业氮肥。尿素尿素不能直接不能直接被农作物被农作物吸收。吸收。土壤中的细菌将尿素土壤中的细菌将尿素分解成氨分解成氨之之后才能被植物利用。后才能被植物利用。2 2、脲酶、脲酶土壤中的某些细菌能够合成土壤中的某些细菌能够合成脲酶，脲酶，并且并且向胞外分泌。向胞外分泌。CO(NHCO(NH2 2) )脲酶脲酶+ CO+ CO2 2NHNH3 3+ H+ H2 2O O分离分离以以尿素尿素为氮源的微生物为氮源的微生物怎么怎么分离分离出能分解
2、尿素的微生物呢？出能分解尿素的微生物呢？菌种可能在什么环境中较多？菌种可能在什么环境中较多？实验室中微生物的筛选原理：实验室中微生物的筛选原理： 人为提供人为提供促进促进目的菌株生长目的菌株生长的条件的条件( (包括包括营养、温度、营养、温度、pHpH等等) )，同时，同时抑制或阻止抑制或阻止其他微其他微生物生物生长。生长。选择性培养基选择性培养基15.0g15.0g琼脂琼脂1.0g1.0g尿素尿素10.0g10.0g葡萄糖葡萄糖0.2g0.2gMgSOMgSO447H7H2 2O O2.1g2.1gNaHNaH2 2POPO4 41.4g1.4gKHKH2 2POPO4 4分离能够分解尿素的
3、分离能够分解尿素的选择性培养基选择性培养基成分：成分：从物理性质看此培养基属于哪类？从物理性质看此培养基属于哪类？固体培养基固体培养基在此培养基中哪些作为碳源、氮源？在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源：碳源：葡萄糖、尿素葡萄糖、尿素 氮源：氮源：尿素尿素 培养基的培养基的氮源为尿素氮源为尿素，只有能合成，只有能合成脲酶脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。为氮源。缺乏缺乏脲酶的微生物由于不能分脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分
4、解尿素的微生物。择出分解尿素的微生物。培养基选择分解尿素的微生物的原理培养基选择分解尿素的微生物的原理? ?15.0g15.0g琼脂琼脂1.0g1.0g尿素尿素10.0g10.0g葡萄糖葡萄糖0.2g0.2gMgSOMgSO447H7H2 2O O2.1g2.1gNaHNaH2 2POPO4 41.4g1.4gKHKH2 2POPO4 4分离能够分解尿素的选择性培养基成分：分离能够分解尿素的选择性培养基成分：氮源真的唯一吗？氮源真的唯一吗？ 1、琼脂作为微生物固体培养基不可缺少的组成琼脂作为微生物固体培养基不可缺少的组成 成分，成分，其其优点是：优点是：其主要成分不能被微生物利用；其主要成分不
5、能被微生物利用；可使培养基可使培养基固化固化；不影响不影响培养基中其他营养物质被培养基中其他营养物质被微生物微生物吸收。吸收。2、琼脂的成分、琼脂的成分 琼脂是一种未被纯化的混合物，主要成分为琼脂是一种未被纯化的混合物，主要成分为琼琼脂糖脂糖和和琼脂果胶，琼脂果胶，还含有少量的还含有少量的含氮化合物含氮化合物，及其，及其它有机杂质和不溶性杂质。它有机杂质和不溶性杂质。用用琼脂糖琼脂糖代替琼脂作为微生物培养基的固化剂代替琼脂作为微生物培养基的固化剂. . 尽可能使培养基中只含尽可能使培养基中只含尿素尿素一种含氮化合一种含氮化合物，以防止琼脂中的物，以防止琼脂中的含氮化合物含氮化合物被以尿素为氮被
6、以尿素为氮源的细菌利用，有利于对这类细菌的筛选。源的细菌利用，有利于对这类细菌的筛选。15.0g15.0g琼脂琼脂糖糖1.0g1.0g尿素尿素10.0g10.0g葡萄糖葡萄糖0.2g0.2gMgSOMgSO447H7H2 2O O2.1g2.1gNaHNaH2 2POPO4 41.4g1.4gKHKH2 2POPO4 4分离能够分解尿素的选择性培养基成分：分离能够分解尿素的选择性培养基成分：对培养基的灭菌方法？对培养基的灭菌方法？G6玻璃砂漏斗过滤玻璃砂漏斗过滤怎样证明此培养基具有选择性呢？怎样证明此培养基具有选择性呢？以尿素为以尿素为唯一氮源唯一氮源的培养基的培养基牛肉膏牛肉膏蛋白胨蛋白胨培
7、养基培养基是是分离分离尿素尿素细菌细菌判断该判断该培养基培养基有无选有无选择性择性实验组实验组对照组对照组培养基类型培养基类型是否是否接种接种目的目的结果结果只生长尿只生长尿素细菌素细菌生长多种生长多种微生物微生物是是选择培养基选择培养基分离分离土壤中分解尿素的微生物并土壤中分解尿素的微生物并计数计数. .筛选菌株筛选菌株. .分离出分离出单个菌落单个菌落并统计菌落数目并统计菌落数目. .设置对照设置对照平板划线法平板划线法稀释涂布法稀释涂布法稀释涂布平板法稀释涂布平板法原理：原理： 将样品进行将样品进行稀释稀释，在稀释度足够高时，在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上能形成微生物在固体培养基
8、上能形成单个菌落单个菌落。所形成的所形成的一个菌落一个菌落是由是由一个单细胞一个单细胞繁殖而成繁殖而成的，即的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。一个菌落代表原先的一个单细胞。实验的具体操作实验的具体操作 . .土壤取样土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm3cm左右，再取样，将样品装入事先左右，再取样，将样品装入事先灭菌灭菌好的信好的信封中。封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。前都要灭菌。. .制备培养基：制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的制备以尿素为唯一氮源的选择性培养基选择性培养
9、基。制备基础培养基。制备基础培养基。应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤10g10g。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行火焰旁进行 三三 样品的稀释样品的稀释移液枪（微量可调移液管）移液枪（微量可调移液管）注意事项注意事项为使结果接近真实值将同一稀释度加到为使结果接近真实值将同一稀释度加到为使结果接近真实值将同一稀释度加到为使结果接近真实值将同一稀释度加到三个或三个三个或三个三个或三个三个或三个以上以上以上以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落的平皿中，经涂布，培养计算出菌落的平皿中，经涂布，培养计算出菌落的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数平均
10、数平均数平均数。为了保证结果准确，一般选择菌落数在为了保证结果准确，一般选择菌落数在为了保证结果准确，一般选择菌落数在为了保证结果准确，一般选择菌落数在30303030300300300300的平的平的平的平板上进行计数。板上进行计数。板上进行计数。板上进行计数。如果得到了如果得到了如果得到了如果得到了2 2个或个或个或个或2 2个以上个以上个以上个以上菌落数目在菌落数目在菌落数目在菌落数目在3030030300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果行菌落
11、的计数，如果行菌落的计数，如果行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落同一稀释倍数的三个重复的菌落同一稀释倍数的三个重复的菌落同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确数相差较大，表明试验不精确数相差较大，表明试验不精确数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。，需要重新实验。，需要重新实验。，需要重新实验。统计的菌落往往比活菌的统计的菌落往往比活菌的统计的菌落往往比活菌的统计的菌落往往比活菌的实际数目低实际数目低实际数目低实际数目低。分离不同的微生物采用不同的稀释度分离不同的微生物采用不同的稀释度稀释倍数稀释倍数目的目的细菌细菌10104 4、10105 5、10106 6
12、保证获得菌落保证获得菌落数在数在3030300300之间、适于计之间、适于计数的平板数的平板放线菌放线菌10103 3、10104 4、10105 5真菌真菌10102 2、10103 3、10104 4原因：不同微生物在土壤中含量不同原因：不同微生物在土壤中含量不同实验中提供的选择培养基的配方中，实验中提供的选择培养基的配方中，尿素是培养基中的尿素是培养基中的惟一氮源惟一氮源，因此，原则，因此，原则上只有能够利用尿素的微生物才能够生长。上只有能够利用尿素的微生物才能够生长。但实际上，微生物的培养是一个非常复杂但实际上，微生物的培养是一个非常复杂的问题，有些微生物可以利用其他微生物的问题，有些
13、微生物可以利用其他微生物的代谢产物生长繁殖，因此能够在选择培的代谢产物生长繁殖，因此能够在选择培养基上生长的微生物不一定是所需要的微养基上生长的微生物不一定是所需要的微生物，还需要进一步的验证。生物，还需要进一步的验证。 在在实验中，实验中，酚红酚红作为酸碱指示剂被添加到作为酸碱指示剂被添加到了培养基中，其变色范围是了培养基中，其变色范围是pH6.4pH6.48.28.2，在酸，在酸性情况下呈性情况下呈黄黄色，碱性情况下呈色，碱性情况下呈红红色，色，这种添这种添加了酸碱指示剂的培养既可以加了酸碱指示剂的培养既可以鉴鉴别和分离别和分离出能出能够产生脲酶分解尿素的微生物，称为够产生脲酶分解尿素的微
14、生物，称为鉴别培养鉴别培养基基。 尿素在被脲酶催化分解前是尿素在被脲酶催化分解前是中性中性的，由于尿素在的，由于尿素在脲酶的催化下分解产生了脲酶的催化下分解产生了NH3，溶液会呈，溶液会呈碱碱性。性。15.0g15.0g琼脂琼脂糖糖1.0g1.0g尿素尿素10.0g10.0g葡萄糖葡萄糖0.2g0.2gMgSOMgSO447H7H2 2O O2.1g2.1gNaHNaH2 2POPO4 41.4g1.4gKHKH2 2POPO4 4分离能够分解尿素的选择性培养基成分：分离能够分解尿素的选择性培养基成分：鉴别培养基鉴别培养基酚红酚红选择培养基选择培养基鉴别培养基鉴别培养基 在以尿素为唯一氮源的培
15、养基中加入在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红酚红指示剂。培养某种细菌后，如果指示剂。培养某种细菌后，如果PHPH升高，指示剂将变红，培养基中将出现升高，指示剂将变红，培养基中将出现红色环带红色环带的菌落，说明该细菌能够分解的菌落，说明该细菌能够分解尿素。尿素。测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 伊红美蓝伊红美蓝伊红美蓝伊红美蓝 培养培
16、养培养培养基上培养，大肠杆菌基上培养，大肠杆菌基上培养，大肠杆菌基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色菌落呈现黑色菌落呈现黑色菌落呈现黑色，通过记述得出，通过记述得出，通过记述得出，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。水样中大肠杆菌的数量。水样中大肠杆菌的数量。水样中大肠杆菌的数量。大肠杆菌呈大肠杆菌呈 黑色中心黑色中心 , ,有或无金属光泽有或无金属光泽大肠杆菌在大肠杆菌在伊红美蓝琼脂伊红美蓝琼脂(EMB)(EMB)上典型特征上典型特征 显微镜直接显微镜直接计数计数： 利用利用血球计数板血球计数板，在显微镜下计算一定，在显微镜下计算一定容容积里样品中微生物的数量。积里样品中微生物的数量。显微镜直接计数
17、：显微镜直接计数： 不能区分死菌与活菌；不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数；不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度；需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察；个体小的细菌在显微镜下难以观察；缺点缺点设置对照的主要目的是排除实验组中设置对照的主要目的是排除实验组中非测试非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。信度。设置对照：设置对照：实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌 落数目的实验时，落数目的实验时，A A同学从对应的同学从对应的10106 6 倍稀释的培养基中筛选出大约倍稀
18、释的培养基中筛选出大约150150个菌个菌 落，但是其他同学在同样的稀释度下落，但是其他同学在同样的稀释度下 只选择出大约只选择出大约5050个菌落。分析其原因。个菌落。分析其原因。原因：原因：土样不同，土样不同， 培养基污染或操作失误培养基污染或操作失误 ( (或者是混入了其他的含氮物质或者是混入了其他的含氮物质) )小结：小结：通过这个事例可以看出，实验结果通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。要有说服力，对照的设置是必不可少的。方案一：方案一：由其他同学用与由其他同学用与A A同学相同土样进行实验同学相同土样进行实验 方案二：方案二：将将A A同学配制的培养基
19、在不加土样的情同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。否受到污染。结果预测：结果预测：如果结果与如果结果与A A同学一致，则证明同学一致，则证明A A无误；无误；如果结果不同，则证明如果结果不同，则证明A A同学存在操作失误或培养同学存在操作失误或培养基的配制有问题。基的配制有问题。结果分析与评价结果分析与评价1.1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染，通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出菌落形态多样，菌落
20、数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。分解尿素的微生物。2.2.提示：选择每个平板上长有提示：选择每个平板上长有3030300300个个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。六、例题解析六、例题解析 例例1 1对细菌群体生长规律测定的正确的表述是对细菌群体生长规律测定的正确的表述是A A在液体培养基上进行在液体培养基上进行 B B至少接种一种细菌至少接种一种细菌 C C接种一个细菌接种一个细菌 D D及时补充消耗的营
21、养物质及时补充消耗的营养物质 解析：细菌群体解析：细菌群体生长规律的测定生长规律的测定是人们在一定条件下进行的。是人们在一定条件下进行的。这些条件是：一这些条件是：一种细菌、恒定容积的培养基，液体培养基、定时种细菌、恒定容积的培养基，液体培养基、定时测定细菌总数测定细菌总数。在这些条件下，才能测定出细菌的生长规律。测。在这些条件下，才能测定出细菌的生长规律。测定时只能用一种细菌的子细胞群体的变化规律表达微生物的生长；定时只能用一种细菌的子细胞群体的变化规律表达微生物的生长；恒定容积是给微生物提供一定的生存环境；液体培养基才能通过恒定容积是给微生物提供一定的生存环境；液体培养基才能通过样品推测细
22、菌总数。若接种多种细菌，则会发生种间斗争而不能样品推测细菌总数。若接种多种细菌，则会发生种间斗争而不能测定一种微生物的生长规律。在接种时，要保证一定的接种量。测定一种微生物的生长规律。在接种时，要保证一定的接种量。答案：答案：A A例例2 2在微生物群体生长规律的测定中，种内在微生物群体生长规律的测定中，种内斗争最显著最激烈的时期是斗争最显著最激烈的时期是A A调整期调整期 B B对数期对数期 C C稳定期稳定期 D D衰亡期衰亡期解析：种内斗争是一种生态因素。种内斗争反应了种内生物解析：种内斗争是一种生态因素。种内斗争反应了种内生物对生存空间和生活资源的争夺。在生活空间充裕，营养充足的时对生
23、存空间和生活资源的争夺。在生活空间充裕，营养充足的时候，种内斗争的程度是比较低的。随着微生物个体数目的增加，候，种内斗争的程度是比较低的。随着微生物个体数目的增加，每个个体的生存空间越来越少，营养物质也越来越少，每个个体每个个体的生存空间越来越少，营养物质也越来越少，每个个体对生存空间和资源的争夺也越来越激烈，种内斗争就越来越激烈。对生存空间和资源的争夺也越来越激烈，种内斗争就越来越激烈。由此可知，在由此可知，在稳定期稳定期的种内斗争最激烈。在衰亡期，微生物的数的种内斗争最激烈。在衰亡期，微生物的数目已经开始减少，目已经开始减少，pHpH已经极度不适于微生物的生存，次级代谢产已经极度不适于微生
24、物的生存，次级代谢产物积累到很高的程度，这时的微生物的生存斗争主要是与无机环物积累到很高的程度，这时的微生物的生存斗争主要是与无机环境的斗争。境的斗争。答案：答案：C C1.1.对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（ ） A.A.在液体培养基上进行在液体培养基上进行 B.B.至少接种一种细菌至少接种一种细菌 C.C.接种一个细菌接种一个细菌 D.D.及时补充消耗的营养物质及时补充消耗的营养物质 2.2.使用选择培养基的目的是（使用选择培养基的目的是（ ） A.A.培养细菌培养细菌 B.B.培养真菌培养真菌 C.C.使需要的微生物大量繁殖使需要的微生物大量繁
25、殖 D.D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别3.3.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是( ( ) ) A.CO A.CO2 2和和N N2 2 B. B.葡萄糖和葡萄糖和NHNH3 3 C.COC.CO2 2和尿素和尿素 D.D.葡萄糖和尿素葡萄糖和尿素实践训练实践训练A A C CD D4.4.下列说法不正确的是（下列说法不正确的是（ ） A.A.科学家从科学家从70708080度热泉中分离到耐高温的度热泉中分离到耐高温的TaqDNATaqDNA聚聚合酶合酶 B.B.统计某一稀释度的统计某一
26、稀释度的5 5个平板的菌落数依次为个平板的菌落数依次为M1M1、M2M2、M3M3、M4M4、M5M5，以，以M3M3作为该样品菌落数的估计值作为该样品菌落数的估计值 C.C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度 D.D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。种类最多。5.5.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（）入（） A.A.较多的氮源物质较
27、多的氮源物质 B.B.较多的碳源物质较多的碳源物质 C.C.青霉素类药物青霉素类药物 D.D.高浓度食盐高浓度食盐B BC C例例3 3（20052005年江苏）抗生素作为治疗细菌感染年江苏）抗生素作为治疗细菌感染的药物，其高效性和巨大的经济价值使抗生素工业经的药物，其高效性和巨大的经济价值使抗生素工业经久不衰。其中青霉素的发现和应用具有划时代的意义。久不衰。其中青霉素的发现和应用具有划时代的意义。青霉素发酵产生青霉素。青霉菌的新陈代谢类型青霉素发酵产生青霉素。青霉菌的新陈代谢类型是是 ， 青霉素是青霉菌的青霉素是青霉菌的 代谢产物。代谢产物。在生产和科研中，常选用处于在生产和科研中，常选用处于 期的青霉期的青霉菌作为菌种或研究材料，因为此时的青霉菌代谢旺盛，菌作为菌种或研究材料，因为此时的青霉菌代谢旺盛， 和和 比较稳定。比较稳定。对青霉菌菌体生长情况的测定：取一定体积的发对青霉菌菌体生长情况的测定：取一定体积的发酵液，经离心分离、反复洗涤后，酵液，经离心分离、反复洗涤后， ，再计算发酵罐中菌体的总重量。再计算发酵罐中菌体的总重量。异养需氧型异养需氧型次级次级对数对数个体的形态个体的形态生理特性生理特性称菌体的湿重称菌体的湿重 （称烘干后的重量）（称烘干后的重量）四、操作提示四、操作提示 无菌操作无菌操作 做好标记做好标记 规划时间规划时间 本课题知识小结本课题知识小结: :
