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1、DNA复制复制DNA复制可能的三种方式复制可能的三种方式由Meselson和Stahl设计证明半保留复制的实验的被誉为生物学最美丽的实验半保留复制实验亲代DNA；15N标记在15N标记培养基中培养：15N标记DNA移到14N标记DNA培养基中氯化铯密度梯度超离心15N DNA在14N DNA培养基中培养第1.n代亲代F1F2FnMeselson 和Stahl的证明DNA半保留复制的实验流程 Meselson 和和Stahl的的实验结实验结果果Meselson与与Stalh在在42年以后在年以后在最初他们相最初他们相遇的一颗树遇的一颗树下重逢时的下重逢时的合影合影半保留复制的实验结果15N DN
2、A显示为一条重密度带位于离心管的管底。15N DNA和14N -DNA的杂交分子中密度带。第二代有中密度带及低密度带两个区带，这表明它们分别为15N 14N DNA和14N -DNA。在14N培养基中培养代数的增加，低密度带增强，而中密度带逐渐减弱。半保留复制进一步的实验证椐15N DNA、14N DNA杂交分子经加热变性，对于变性前后的DNA分别进行CsCl密度梯度离心。结果变性前的杂交分子为一条中密度带，变性后则分为两条区带，即重密度带(15N DNA)及低密度带(14N DNA)。15N DNA第一代变性前后超离心15N DNA第一代：变性前变性后排除了弥散复制排除了弥散复制Taylor
3、以蚕豆根尖以蚕豆根尖细细胞胞为为材料、使用放射性同位材料、使用放射性同位素素证证明真核明真核细细胞胞DNA也是半保留复制也是半保留复制的的实验实验。DNA的半保留复制两条链分别做模板各自合成一条新的DNA链，子代DNA 分子中一条链来自亲代DNA ，另一条链是新合成的，这种复制方式称为半保留复制。某些生物DNA复制的引物序列 证证明明DNA复制的方向始复制的方向始终终是是53的末端的末端终终止止实验实验 DNA复制起始区的特征复制起始区的特征由多个短的重复序列组成；能够被多亚基的复制起始区结合蛋白识别；通常富含AT碱基对，这有利于DNA复制起动时的解链，因为AT碱基对含有的氢键数目低于GC碱基
4、对。DNA复制起始区的特征复制起始区的特征电镜电镜下真核生物下真核生物DNA的多个复制叉的多个复制叉结结构构复制叉的复制叉的结结构构当当DNA复制从起复制从起始区起动的时候，始区起动的时候，起始区的起始区的DNA双双链因发生解链而链因发生解链而形成叉状结构，形成叉状结构，这样的结构被称这样的结构被称为复制叉为复制叉 真核生物真核生物DNA复制子复制子Cairns的实验的实验复制开始时，将大肠杆菌放在含低剂量的复制开始时，将大肠杆菌放在含低剂量的3H-dT的培养基中培养的培养基中培养几分钟；随后，将细菌转移到含高剂量的几分钟；随后，将细菌转移到含高剂量的3H-dT的培养基中继续的培养基中继续培养
5、一段时间；最后，收集细胞，小心地裂解以抽取其中的染色培养一段时间；最后，收集细胞，小心地裂解以抽取其中的染色体体DNA进行放射自显影。如果是单向复制，自显影图谱上银颗粒进行放射自显影。如果是单向复制，自显影图谱上银颗粒的密度应该是一端高、一端低；如果是双向复制，则应该中间是的密度应该是一端高、一端低；如果是双向复制，则应该中间是一段低密度的银颗粒，两侧是高密度的银颗粒。低密度银颗粒意一段低密度的银颗粒，两侧是高密度的银颗粒。低密度银颗粒意味着这一段味着这一段DNA属于复制起始区，高密度颗粒代表的是后来合成属于复制起始区，高密度颗粒代表的是后来合成的。的。Cairns证证明大明大肠肠杆菌杆菌DN
6、A双向复制的双向复制的实验实验Reiji Okazaki的实验的实验脉冲标记目的在于即时标记在特定时段内合成的DNA。和脉冲追踪目的则是要弄清那些被标记上的DNA片段后来的去向。 Okazaki的脉冲的脉冲标记标记和脉冲追踪的和脉冲追踪的实验实验脉冲标记在培养时，培养基中加入同位素在培养时，培养基中加入同位素3H标记的标记的dTTP，经，经30秒后，秒后，DNA刚开始复制，分离刚开始复制，分离DNA，然后，然后在碱中沉淀，变性，让新合成的单链和模板链分在碱中沉淀，变性，让新合成的单链和模板链分开，再用开，再用CsCl密度梯度离心密度梯度离心，以沉降的快慢来确，以沉降的快慢来确定片段的大小，再检
7、测放射标记，结果表明被定片段的大小，再检测放射标记，结果表明被3H标记的片段，也就是新合成的片段，沉淀系数为标记的片段，也就是新合成的片段，沉淀系数为20S左右，即都是长左右，即都是长10002000Nt的的DNA片段，而片段，而亲本链要比它大亲本链要比它大2050倍；倍； 脉冲追踪这个实验是先进行标记培养这个实验是先进行标记培养30秒，以后除秒，以后除去同位素继续培养几分钟，再分离去同位素继续培养几分钟，再分离DNA在碱在碱中沉淀，检测结果。先合成的（带标记）中沉淀，检测结果。先合成的（带标记）的的DNA不再是短片段，而和总不再是短片段，而和总DNA的情况相的情况相似，沉淀系数为似，沉淀系数
8、为70S120S较长的片段，这较长的片段，这意味着刚开始合成的片段都是短片段，以意味着刚开始合成的片段都是短片段，以后再连接成长片段，人们就把最初合成的后再连接成长片段，人们就把最初合成的短片段称为冈崎片段（短片段称为冈崎片段（Okazakifragment） Okazaki的脉冲的脉冲标记标记和脉冲追踪的和脉冲追踪的实验结实验结果分析果分析不连续复制不连续复制由于这个实验的结果使得人们普遍认为：由于这个实验的结果使得人们普遍认为：无论是前导链还是后滞链都是先合成小片段，无论是前导链还是后滞链都是先合成小片段，然后在连成大片段，称为然后在连成大片段，称为“不连续复制不连续复制“（discont
9、inuousreplication） 在复制叉中不连续合成的DNA片段称为冈崎片段，连续合成的DNA子链被称为前导链，不连续合成的DNA子链被称为后随链或滞后链。 1978年年Olivera提出了半不连续（提出了半不连续（semidiscontinuous）复制模型，）复制模型，也就是说前导链上的合成是连续的，只有后滞链上的合成才是半连续的。也就是说前导链上的合成是连续的，只有后滞链上的合成才是半连续的。 由于细胞内都存在有dTTP和dUTP，而DNApol却并不能区分它们，因此也会将dUTP加入到DNA中，形成AU对。那么在DNA中为什么没有U的存在呢？这是因为E.coli细胞里有双重“保险
10、”，防止了U的“混入”。 第一道关是细胞里的dUTPase，它能使dUTP变成dUMP，dUMP是不能作为DNA合成的底物，这样它就不再能加入DNA中。但总还有些漏网之“鱼”，它们还是逃过此关，混入DNA中，这就靠第二道关来清除“异己”，这道关的主角是尿嘧啶N-糖苷酶（uracilN-glycosylase），它可以切断混合尿苷的糖苷键，形成无Pu和Py位点（apurinicorapyrimidinic，AP），再由AP内切酶在AP位点切出一个缺口，进一步进行切除修复。在细胞内尿嘧啶N-糖苷酶作用较快，而AP酶作用较慢，在新链合成之初约1200bp就有可能掺进一个U，但很快就被尿嘧啶N-糖苷酶
11、切断糖苷键，在AP酶未作用前在脉冲标记实验中就提取了，用NaOH沉淀时，AP位点十分易断裂，所以前导链也成了小片段。复制的速度和方向复制的速度和方向DNA复制过程的三个阶段DNA复制的起始阶段，包括起始点，复制方向以及引发体的形成。DNA链的延长，包括前导链及随从链的形成和切除RNA引物后填补空缺及连接岗崎片段。DNA复制的终止阶段。（一）DNA复制的起始阶段复制是从DNA分子上的特定部位开始的，复制起始点(originofreplication)常用ori或o表示，称为复制子或复制单元(replicon)。在原核细胞中只有一个复制起始点，一个复制子。在真核生物中复制是从许多起始点同时开始的，
12、即有多个复制子。1、DNA复制起始点的结构特性大肠杆菌Ori由422个核苷酸组成，是一系列对称排列的反向重复序列，即回文结构(palindrome)。有些生物复制起始点Ori是富含AT的区段。这些特殊的结构对于在DNA复制起始过程中参与的酶和许多蛋白质分子的识别和结合都是必须的。2、DNA复制的方向性定点开始双向复制：定点开始单向复制：两点开始单向复制：ori3、DNA复制的起始DNA双螺旋的解旋由多种酶来完成的DNA解链酶：水解ATP获能解开双链DNA单链结合蛋白（SSB蛋白）：保持单链结构RNA聚合酶：合成RNA引物对于随从链是由引发体来完成的，引发体由6种蛋白组成：n、n/、n / /
13、、DnaB、C、I（二）DNA链的延长DNA的复制实际上就是以DNA为模板在DNA聚合酶作用下，将四种dNTP聚合成DNA的过程。需要许多种酶和蛋白质参与。1、DNA聚合酶1957年，Arthur kornberg首次在大肠杆菌中发现DNA聚合酶简写DNA pol，后来又相继发现了DNA聚合酶和DNA聚合酶。大肠杆菌中DNA复制的主要过程靠DNA pol起作用，而DNA pol和DNA pol在DNA错配的校正和修复中起作用。真核生物DNA聚合酶真核生物DNA聚合酶有、及。复制中起主要作用的是DNA pol。与DNA修复有关。在线粒体DNA的复制中起作用。前导链合成靠催化，还需要调节因子参与。
14、随从链的合成靠和引发酶配合作用完成。DNA聚合酶的性质需要DNA模板需要RNA做为引物催化dNTP加到引物的3-OH末端DNA聚合酶都属于多功能酶，它们在DNA复制和修复过程的不同阶段发挥作用。2、与超螺旋松驰有关的酶拓扑异构酶(topoisomerase)改变DNA拓扑性质的酶，松驰超螺旋，有利于复制叉的前进合成。拓扑异构酶有型和型，原核、真核中均有。（三）DNA复制的终止阶段大肠杆菌DNA具有复制终止位点，此处可以结合一种特异的蛋白质分子叫做Tus，通过阻止解链酶(Helicase)的解链活性而终止复制。“滚环复制滚环复制”某些噬菌体（如M13和X174）DNA和一些小的质粒（如枯草杆菌内
15、的pIM13质粒）在宿主细胞内通过滚环复制方式扩增DNA。 真核细胞的某些基因，如某些两栖动物卵母细胞内的rRNA基因和哺乳动物细胞内的二氢叶酸还原酶基因，在特定的情况下会通过滚环复制在较短的时间内迅速增加目标基因的拷贝数。 滚环复制滚环复制 D-环复制环复制线粒体和叶绿体DNA通常以D-环的方式进行复制。少数病毒，如腺病毒，也进行D-环复制 。催化线粒体DNA复制的酶是DNA聚合酶，两条链的合成都需要先合成RNA引物，但都不形成冈崎片段，因此都是连续合成。 两条子链的合成在时间上的不同步。 D环复制环复制 干细胞分裂过程中的干细胞分裂过程中的“不朽链假说不朽链假说”干细胞的分裂是不对称的，而
16、分裂的不对称性使以后的干细胞能够选择性得到含有最老的DNA模板的染色体。这样的假设是合乎逻辑的，因为如果一个干细胞在分裂中抓住最老的DNA，就等于将复制可能产生的错误“拒之门外”，从而大大降低了细胞癌变的可能性，而将来分化成体细胞的子细胞得到易错的新DNA也没有什么危险，因为它们很快停止分裂或者死亡，特别是在高度更新的组织。“不朽链假说不朽链假说”图解图解 原核生物原核生物DNA复制的特点复制的特点过程复杂；需要多种酶和蛋白质参与（包括拓扑异构酶、解旋酶、单链DNA结合蛋白、引物合成酶、DNA聚合酶及连接酶等）。原核生物DNA复制的特点1. DNA复制的起始复制的起始复制起始原点复制起始原点D
17、NA双螺旋的解旋双螺旋的解旋复制的引发复制的引发 大肠杆菌大肠杆菌(E. coli)的的 OriC 复制原点复制原点大肠杆菌基因组的复制原点位于天冬酰胺合大肠杆菌基因组的复制原点位于天冬酰胺合酶和酶和ATP合酶操纵子之间，全长合酶操纵子之间，全长245 bp, 称为称为oriC。参与参与DNA复制起始和引发的蛋白质复制起始和引发的蛋白质DNA解旋酶解旋酶(DNA helicase) 催化催化DNA双链的解链过程。双链的解链过程。单链单链DNA结合蛋白结合蛋白(single strand DNA binding protein)： 以四聚体形式存在于复制叉处，只保持单链的存以四聚体形式存在于复制
18、叉处，只保持单链的存在，并不能起解链作用。在，并不能起解链作用。DNA拓扑异构酶拓扑异构酶(DNA topoisomerase) 消除消除DNA双链的超螺旋堆积。双链的超螺旋堆积。引物酶引物酶(primase) 合成一小段合成一小段RNA引物，为引物，为DNA新链的合成提供新链的合成提供3-OH末端。末端。1.1 1.1 解旋酶解旋酶（helicase)DNADNA复制时，解旋酶利用复制时，解旋酶利用ATP的能量启动的能量启动DNADNA解旋，使双连分开形成单链。解旋，使双连分开形成单链。 1. DNA双螺旋的解旋双螺旋的解旋在在EcoliEcoli中，解旋酶中，解旋酶DnaBDnaB作为引发
19、体的成员，参与复制叉作为引发体的成员，参与复制叉形成，并结合于一个复制叉，利用形成，并结合于一个复制叉，利用ATP水解的能量解水解的能量解开双螺旋，开双螺旋，推动复制叉向前延伸推动复制叉向前延伸; 大部分大部分DNADNA解链酶可沿后随链的解链酶可沿后随链的5 5-3-3方向随着复制叉方向随着复制叉的前进而移动，的前进而移动，RepRep蛋白则沿前导链模板的蛋白则沿前导链模板的3 3-5-5方向移动。方向移动。生物体内的解旋酶有多种，有些解旋酶还参与生物体内的解旋酶有多种，有些解旋酶还参与DNA修复，修复，重组等非复制过程。重组等非复制过程。1.2 1.2 拓扑异构酶（拓扑异构酶（topois
20、omerasetopoisomerase) )可以使可以使DNADNA的两种拓扑异构体互变的酶。的两种拓扑异构体互变的酶。DNADNA分子在细胞内以超螺旋形式存在，分子在细胞内以超螺旋形式存在， DNADNA拓拓扑异构酶催化同一扑异构酶催化同一DNADNA分子不同超螺旋状态之分子不同超螺旋状态之间转变。间转变。Action of topoisomerase at the replication forkTopoisomerase rapidly remove the positive supercoils accumulate in front of the replication fork.
21、功能：功能：与与DNA形成共价结合中间体，使形成共价结合中间体，使DNA磷磷酸二酯键断裂，酸二酯键断裂，形成形成DNA nick ，DNA的一的一条链进行解旋旋转而改变条链进行解旋旋转而改变DNA分子的拓扑分子的拓扑状态。状态。v 参与复制、转录、重组。参与复制、转录、重组。效应：效应：拓扑异构酶可使拓扑异构酶可使DNA发生：发生：连环化（连环化（catenate)脱连环化脱连环化(decatenate)打结（打结（knot)解结（解结（unknot)拓扑异构酶类别拓扑异构酶拓扑异构酶I DNA拓扑异构酶拓扑异构酶I对单链对单链DNA的亲和力要比双链高得多，这正是它识别的亲和力要比双链高得多，
22、这正是它识别负超螺旋负超螺旋DNA的分子基础，因为负超螺旋的分子基础，因为负超螺旋DNA常常会有一定程度的单链区。负超螺常常会有一定程度的单链区。负超螺旋越高，旋越高，DNA拓扑异构酶拓扑异构酶I作用越快作用越快 生物体内负超螺旋稳定在生物体内负超螺旋稳定在5%左右，低了不行，高了也不行。生物体通过拓扑异构酶左右，低了不行，高了也不行。生物体通过拓扑异构酶1和和II的相反作用而使负超螺旋达到一个稳定状态。现已发现，编码的相反作用而使负超螺旋达到一个稳定状态。现已发现，编码Ecoli拓扑异构酶拓扑异构酶I的基因的基因topA发生突变，则会引起旋转酶基因的代偿性突变；否则，负超螺旋增高，发生突变，
23、则会引起旋转酶基因的代偿性突变；否则，负超螺旋增高，细胞生活能力降低。细胞生活能力降低。 拓扑异构酶拓扑异构酶II II类拓扑异构酶没有碱基序列特异性，它们可以和任何相交的两对双链类拓扑异构酶没有碱基序列特异性，它们可以和任何相交的两对双链DNA结合。结合。 通过切断通过切断DNA的一条或两条链中的磷酸二酯键，的一条或两条链中的磷酸二酯键，然后重新缠绕和封口来更正然后重新缠绕和封口来更正DNA连环数的酶。连环数的酶。 解旋酶沿着复制叉向前延伸产生了一段解旋酶沿着复制叉向前延伸产生了一段单链，细胞内大量单链，细胞内大量的单链结合蛋白能和单的单链结合蛋白能和单链链DNA结合，防止其重新配对形成双链
24、。结合，防止其重新配对形成双链。1.3 1.3 单链结合蛋白单链结合蛋白（SSB） SSB SSB的作用：的作用：v 使使DNADNA单链保持一种伸展构象，它们与磷酸骨单链保持一种伸展构象，它们与磷酸骨架结合，离开暴露的碱基，此次那些碱基能作架结合，离开暴露的碱基，此次那些碱基能作为为DNADNA合成的模板；合成的模板；v 使解开的单链不形成发卡结构；使解开的单链不形成发卡结构；v 保护保护DNADNA单链不受单链不受DnaseDnase水解。水解。2 DNA复制的引发复制的引发oriC(84min)（dnaA结合位点）此序列在所有细菌复制起始位点中此序列在所有细菌复制起始位点中都是保守的。都
25、是保守的。oriC在不同原核生物中有同源性，很多细菌的在不同原核生物中有同源性，很多细菌的oriC区区在结构上相似的，在序列上有相当的保守性，而在结构上相似的，在序列上有相当的保守性，而且在分类上越接近的细菌其同源性越高，表明且在分类上越接近的细菌其同源性越高，表明DNA复制起点的重要性。复制起点的重要性。将将DNA分子的复制起始位点（复制器）分子的复制起始位点（复制器）连接到任何一个连接到任何一个DNA分子上，都能分子上，都能起始其复制。起始其复制。v起始蛋白与特异序列结合、起始蛋白与特异序列结合、促进解旋和引发体组装促进解旋和引发体组装引发体是由很多蛋白质因子参与形成的。引发体是由很多蛋白
26、质因子参与形成的。引发体primosome引发前体preprimosome引发酶Primase(DnaG)DnaB helicaseDnaC helicase assistantDnaInnn只有当引发前体把这只有当引发前体把这6种蛋白质合在一起种蛋白质合在一起并与引发酶进一步组并与引发酶进一步组装后形成引发体，才装后形成引发体，才能发挥其功效。能发挥其功效。4.3.4 4.3.4 引发酶（引发酶（Primase，或引物酶，或引物酶) )DNA DNA 合成时需要一段大约合成时需要一段大约6-106-10个核苷酸长的个核苷酸长的RNARNA，作为作为DNA DNA 合成的引物；这段引物是由引物
27、酶合成的。合成的引物；这段引物是由引物酶合成的。是在特定环境下发挥作用的是在特定环境下发挥作用的RNARNA聚合酶，仅用于合成聚合酶，仅用于合成DNADNA复制所需的一小段复制所需的一小段RNARNA。引物酶以单链引物酶以单链DNADNA为模板，利用核糖核苷酸为模板，利用核糖核苷酸直接从头合成直接从头合成RNARNA引物引物（6-10nt)6-10nt)。 减少致死突变。减少致死突变。 DNADNA合成中最初几个核苷酸正确性远合成中最初几个核苷酸正确性远比其后的低。引物比其后的低。引物RNA RNA 随后被降解，从随后被降解，从而减少了复制错误。而减少了复制错误。引物的意义：引物酶催化引物引物
28、酶催化引物RNARNA的合成，但它不同于的合成，但它不同于RNARNA聚合酶聚合酶。引物酶只在复制起点处合成引物酶只在复制起点处合成RNARNA引物以引发引物以引发DNADNA复制，复制，而而RNARNA聚合酶则是启动聚合酶则是启动DNADNA转录合成转录合成RNA RNA ，从而将，从而将遗传信息由遗传信息由DNADNA传递到传递到RNARNA。E.coliE.coli的引物酶由一条肽链组成，分子量为的引物酶由一条肽链组成，分子量为60KD,DnaG60KD,DnaG基因编码。基因编码。DnaA protein molecules binds to the four 9 bp repeats
29、 in the origin，then recognizes and successively denatures the DNA in the region of the three 13 bp repeats, which are rich in A=T pairsThis process requires ATP and the bacterial histonelike protein HU.HU prevents nonspecific initiation at sites other than oriCThe DnaA protein then mediates the sepa
30、ration of the strands of the DNA duplex by acting on three AT-rich tandem repeats located at the 5-end of the sequence defining oriCFormation of this 45-bp “open complex” by DnaA protein is ATP-dependent.DnaB protein (a hexamer of 50-kD subunits) binds to the “open” oriC.DnaB protein is delivered to
31、 oriC by DnaC protein assisted by DnaT protein.The addition of DnaB protein completes assembly of the pre-priming complex（引发前体）（引发前体）. ATP hydrolysis drives the formation of this complex . DnaB protein has helicase activity and it further unwinds the DNA in the pre-priming complex in both directions
32、SSB tetramers coat singlestranded regions as they arise.引物酶（引物酶（）结合到引发前体上结合到引发前体上组装成了引发体组装成了引发体（primosomeprimosome ）。）。在在SSBSSB和拓扑异构和拓扑异构酶的参与下，引发酶的参与下，引发体可在单链体可在单链上移动，在上移动，在的帮助下，识别的帮助下，识别复制的起始起点位复制的起始起点位置。置。引发体在复制叉先合成先引发体在复制叉先合成先导链的导链的RNARNA引物，再合成后滞引物，再合成后滞链的引物（链的引物（Primase association with DnaB is
33、transient; once a primer has been synthesized, primase dissociates until another round of primer synthesis is necessary.)在复制叉在复制叉DNA polymerase DNA polymerase III III 组装成组装成非对称的二聚体非对称的二聚体，它催化第一个按碱它催化第一个按碱基互补配对原则加在基互补配对原则加在引物的引物的端，而进端，而进入链的延伸阶段入链的延伸阶段. DNA链的延伸需要的蛋白质链的延伸需要的蛋白质:DNA聚合酶聚合酶滑动夹（滑动夹（Sliding
34、 DNA clamp）RNA酶酶(RNase H 等等) 在复制完成后切除在复制完成后切除RNA引物。引物。DNA连接酶连接酶 (DNA ligase) 通过生成通过生成35-磷酸二酯键连接两条磷酸二酯键连接两条DNA链。链。2. DNA链的延伸链的延伸DNA polymerase use a single active site to catalyze DNA synthesisDNA polymerase bound to a primer:template junctionpalmProcessivity (持续合成能力持续合成能力)Processivity is a character
35、istic of enzymes that operate on polymeric substrates.For DNA polymerase, the degree of processivity is defined as the average number of nucleotides added each time the enzyme binds a primer:template junction (a few50,000). Structure of a sliding DNA clampSliding DNA clamps encircle the newly replic
36、ated DNA produced by an associated DNA polymerase.Sliding clamps dramatically increase DNA polymerase processivity (持续合成能力持续合成能力)The composition of the DNA Pol III holoenzyme Three enzymes: Two copies of the DNA Pol III core enzyme One copy of the -complexThe “trombone” model for coordinating replic
37、ation by two DNA polymerase at the E. coli replication fork冈崎片段与半不连续复制冈崎片段与半不连续复制冈崎片段(Okazaki fragment)一般长约1000-2000个碱基，原核比真核长。前导链Leading strand后随链Lagging strand然后，RNaseH降解RNA引物，DNA聚合酶I补齐缺口，再由DNA连接酶连接两个冈崎片段。Steps in the synthesis of the lagging strandRemoval of RNA primers from newly synthesized DNA
38、RNAse H removes all of the RNA primer except the ribonucleotide directly linked to the DNA end.An exonuclease removes the final ribonucleotide.DNA polymerase fills the gap, leaving a a break in the backbone between the 3OH and 5 phosphate of the repaired strand.DNA ligase repaires this “nick”.当复制叉前移
39、，遇到当复制叉前移，遇到20bp重复性终止子序列重复性终止子序列( (Ter) )时，时，Ter-Tus复合物能阻挡复制叉的继续复合物能阻挡复制叉的继续前移，等到相反方向的复制叉到达后在前移，等到相反方向的复制叉到达后在DNA拓拓扑异构酶扑异构酶IV的作用下使复制叉解体，释放子链的作用下使复制叉解体，释放子链DNA。 ter3. 复制的终止复制的终止复制的终止位点复制的终止位点在在E.coli DNA上存在着复制的终止位点上存在着复制的终止位点;终止位点的序列终止位点的序列Ter ():A A T T A G T A T G T T G T A A C T A A A G TT T A A T
40、 C A T A C A A C A T T G A T T T C A终止序列可被终止序列可被tus蛋白（蛋白（tus基因编码）识别，基因编码）识别，并结合于其上；并结合于其上；Ter-Tus复合物能使复合物能使DnaB不再将不再将DNA解链，使解链，使复制叉停止前移；复制叉停止前移；E. coli两个复制叉在相距两个复制叉在相距100kb时，复制速度时，复制速度减慢从而协调两个复制叉到达时间。减慢从而协调两个复制叉到达时间。Tus protein只让一侧复制叉通过，使只让一侧复制叉通过，使DNA的的复制在终点位置终止。复制在终点位置终止。复制终止的协调：复制终止的协调：在在Forks me
41、et 两侧各两侧各有几个段序列有几个段序列如：如：terE. D. A. terC. B。当一侧复制叉前进的当一侧复制叉前进的快，而另一侧前进的快，而另一侧前进的慢时，快侧复制酶则慢时，快侧复制酶则会在会在ter位点停止，等位点停止，等待直到慢侧跟上。待直到慢侧跟上。以上似乎构成一个以上似乎构成一个“replication fork trap”E .coli DNA复制到最复制到最后，子代后，子代DNA链套在一起链套在一起,由由DNA拓扑异构酶拓扑异构酶II切开切开双链将两个双链将两个DNA分子分开分子分开成为两个完整地与亲代成为两个完整地与亲代DNA分子完全一样的子代分子完全一样的子代DNA
42、分子。分子。DNA聚聚合合酶酶I (coded by polA)不不是是复复制制大大肠肠杆杆菌菌染染色色体体的的主主要要聚聚合合酶酶，它它有有 3 5核核酸酸外外切切酶酶活活性性,与与DNA聚聚合合酶的校正功能有关，酶的校正功能有关，保证了保证了DNA复制的准确性复制的准确性。DNA Polymerase I它的它的5 3核酸外切酶活性也可用来除去冈崎片段核酸外切酶活性也可用来除去冈崎片段5端端RNA引物，使冈崎片段间缺口消失，引物，使冈崎片段间缺口消失，保证连接酶将片段保证连接酶将片段连接起来连接起来。DNA聚聚合合酶酶II (coded by polB)的的活活性性很很低低，只只有有DNA
43、聚聚合合酶酶I的的5%，所所以以也也不不是复制中主要的酶。是复制中主要的酶。生理功能主要是生理功能主要是起修复起修复DNA的作用的作用。DNA Polymerase IIDNA聚合酶聚合酶III (codedbypolC)包含有包含有7种种不同的亚单位和不同的亚单位和9个个亚基，其生物活性形式亚基，其生物活性形式为为二聚体二聚体。Core enzyme & Core enzyme & holoenzymeholoenzymeDNA Polymerase III 它的它的聚合活性较强聚合活性较强，为，为DNA聚合酶聚合酶I的的15倍，聚合酶倍，聚合酶II的的300倍。倍。 它能在引物的它能在引物
44、的3OH上以每分钟约上以每分钟约5万个万个核苷酸的速率延长新生的核苷酸的速率延长新生的DNA链，是大肠杆链，是大肠杆菌菌DNA复制中链延长反应的复制中链延长反应的主导聚合酶主导聚合酶。全酶DNA Polymerase IIIThe holoenzyme consists of:The core enzyme ,The sliding clamp - The clamp loader complex A processivity switch - DNA聚合酶聚合酶I(DNA损伤的修复）损伤的修复）DNA聚合酶聚合酶I、II、III(a proofreading activity)DNA聚合酶聚
45、合酶III DNA聚合酶聚合酶IV和和V分别由分别由dinB和和umuD2C基因编码，基因编码， 主要在主要在SOS修复过程修复过程中发挥功能。中发挥功能。DNA Polymerase IV& V1 1、都以、都以dNTP为底物为底物。2、都需要、都需要Mg2+激活激活。3、聚合时必须有、聚合时必须有模板链模板链和具有和具有 3-OH末端的末端的引物链引物链。4、链的延伸都方向为、链的延伸都方向为53。DNA聚合酶的共同点：聚合酶的共同点：6 DNA6 DNA连接酶（连接酶（ligaseligase) )催化双链DNA切口处的5-磷酸和3-羟基生成磷酸二酯键;连接反应需要供给能量。大肠杆菌和其
46、它细菌的DNA连接酶以NAD作为能量来源;动物细胞和噬菌体的连接酶则以ATP作为能量来源。DNA 滞滞后链上的复制是不连续的，各合成的后链上的复制是不连续的，各合成的片段需要连接酶连接，连接酶的反应条件：片段需要连接酶连接，连接酶的反应条件：v 被连接的两链必须与另一链（模板链）被连接的两链必须与另一链（模板链）互补；互补；v 两链相邻；两链相邻；v 每次只能连接一个缺口；每次只能连接一个缺口；v 使一条链的使一条链的5- P 与另一链的与另一链的3- OH形成形成磷酸二酯键；磷酸二酯键；v 缺口缺失核苷酸不连接。缺口缺失核苷酸不连接。T4 T4 LigaseLigase 特性：特性：v可连接
47、可连接DNA与与DNA，也可连接，也可连接RNA与与RNA。v可连接可连接DNA中的单链切口，也可连接粘性末端切中的单链切口，也可连接粘性末端切口和齐末端切口。口和齐末端切口。v T4 Ligase 可作为重组工具酶。可作为重组工具酶。T4连接酶T4连接酶真核生物真核生物DNA的复制的复制真核生物真核生物DNA的复制特点的复制特点有有多处复制起始点多处复制起始点；在全部完成复制之前，各个起始点上在全部完成复制之前，各个起始点上DNA的复制不能再开始；的复制不能再开始；原核生物起始点上可连续开始新的DNA复制。DNA复制复制只在只在S期进行期进行。复制子相对较小复制子相对较小，为，为40-100
48、kb。E.coli?真核生物的复制起始位点被称为自主复制序列真核生物的复制起始位点被称为自主复制序列(autonomous replicating sequence, ARS) 这个序列是这个序列是染色体正常起始复制染色体正常起始复制所必需的。所必需的。所有的所有的ARS的的DNA均有一段保守序列：均有一段保守序列： （A区）区） -A(T)TTTAT(C)A(G)TTTA(T)- 起始点识别复合物起始点识别复合物(origin recognition complex, ORC)DNA的复制起始需要的复制起始需要ORC的参与的参与ORC结合于结合于ARS，形成复制叉。，形成复制叉。ORC它是由
49、它是由6种蛋白质组成的启动。种蛋白质组成的启动。 酵母的复制起始位点：酵母的复制起始位点：长约长约150bp左右，左右，包括数个复制起始必需的保守区。包括数个复制起始必需的保守区。酵母染色体酵母染色体的着丝粒附近为的着丝粒附近为ARS1序列序列起始点识别复合物起始点识别复合物ARS1分为A,B,C三个功能区, A,B起主要作用,C起次要作用。A区为15bp,其中11个保守，称ACS (ARS consensus sequence)。有复制起始子的功能B区约为80bp,含B1,B2,B3三个功能区。B3是ABF1（ARS-binding factor 1）结合区，ARS1序列特征序列特征 真核生
50、物真核生物DNA复制叉的移动速度大复制叉的移动速度大约只有约只有50bp/秒。秒。 因此，人类因此，人类DNA中每隔中每隔30,000-300,000bp就有一个复制起始位点。就有一个复制起始位点。已已发发现现的的真真核核生生物物DNA聚聚合合酶酶有有15种以上。种以上。在在哺哺乳乳动动物物细细胞胞中中主主要要有有5种种DNA聚聚合合酶酶，分分别别称称为为DNA聚聚合合酶酶、和和 。真核生物真核生物DNA聚合酶的特性比较聚合酶的特性比较性质性质DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶亚基数亚基数4122-31在在细细胞胞内内分布分布核内核内核内
51、核内线粒体线粒体核内核内核内核内(?)功能功能DNA引物合引物合成成损伤修损伤修复复线粒体线粒体DNA复制复制主要主要DNA复复制酶制酶DNA复复制制(?)35外外切切无无无无有有有有有有53外外切切无无无无无无无无无无DNA聚合酶聚合酶主要参与主要参与引物合成引物合成。DNA聚合酶聚合酶活性水平稳定，主要在活性水平稳定，主要在DNA损损伤的修复伤的修复中起作用。高忠实性修复酶中起作用。高忠实性修复酶DNA聚合酶聚合酶主要负责主要负责DNA的复制。的复制。DNA聚合酶聚合酶与与后随链后随链合成有关，在合成有关，在DNA合合成过程中核苷切除以及碱基的切除修复中成过程中核苷切除以及碱基的切除修复中
52、起着重要的作用起着重要的作用。DNA聚合酶聚合酶 在线粒体在线粒体DNA的复制中发挥作的复制中发挥作用。用。 真核生物中还存在真核生物中还存在 、 、 和和 等等几种几种DNA聚合酶，它们承担着聚合酶，它们承担着修修复损伤复损伤的功能，但这些修复酶的的功能，但这些修复酶的忠实性都很低。忠实性都很低。 真核生物DNA聚合酶特征dNTP Mg2+3-OH5-3真核生物真核生物DNA聚合酶一般聚合酶一般不具有外切酶活性不具有外切酶活性。Key Concepts A replication fork has 1 complex of DNA polymerase /primase and 2 comp
53、lexes of DNA polymerase and /or . The DNA polymerase /primase complex initiates the synthesis of both DNA strands. DNA polymerase elongates the leading strand and a second DNA polymerase or DNA polymerase elongates the lagging strand. 去除冈崎片段：分两步去除冈崎片段：分两步RNA酶酶H1切断切断DNA-RNA，FEN1蛋白降解蛋白降解RNA片段。片段。真核生物的
54、聚合酶没有5-3外切酶活性，需要一种叫FEN1的蛋白切除5端引物 DNA连接酶连接酶I将相邻的冈崎片段连接起来将相邻的冈崎片段连接起来DNA末端复制端粒端粒(telomere)真核生物染色体线性真核生物染色体线性DNA分子末分子末 端的结构。端的结构。结构特点：结构特点：1. 由末端单链由末端单链DNA序列和蛋白质构成序列和蛋白质构成2. 末端末端DNA序列是多次重复的富含序列是多次重复的富含G、C 碱基的短序列碱基的短序列功能：功能：1. 维持染色体的稳定性维持染色体的稳定性 2. 维持维持DNA复制的完整性复制的完整性端粒酶端粒酶(telomerase)特点：特点：1. 由由RNA和蛋白质
55、构成的复合物和蛋白质构成的复合物2. 为特殊的逆转录酶，能以自身的为特殊的逆转录酶，能以自身的RNA为为模板逆转录合成端粒模板逆转录合成端粒DNA功能：功能：合成端粒合成端粒DNA，维持端粒的长度，维持端粒的长度 爬行模型：爬行模型：离开离开RNA模板的端粒模板的端粒DNA3端可反折为双链，并常出现两个端可反折为双链，并常出现两个G之间的配对，以有利于之间的配对，以有利于DNA-RNA杂交链之间的相对滑动。杂交链之间的相对滑动。 端粒及端粒酶的意义：端粒及端粒酶的意义：端粒特别是端粒酶的活性与细胞的生长、繁殖、衰老凋亡以及肿瘤的发生密切相关。端粒的平均长度随细胞分裂次数的增多及年龄的增长而逐渐
56、变短至消失，可导致染色体稳定性下降，导致细胞衰老凋亡。体细胞几乎没有端粒酶活性，随多次细胞分裂端粒逐渐缩短，细胞失去增殖能力。而端粒酶活性较高的胚原细胞，端粒长度未缩短。肿瘤细胞端粒酶重新获得活性，以维持端粒结构致使染色体稳定而成为永生细胞。肿瘤细胞的端粒比正常人同类细胞显著缩短。DNA复制的调控 大肠杆菌染色体大肠杆菌染色体DNA的复制调控的复制调控 ColEI 质粒质粒DNA的复制调控的复制调控 真核细胞中真核细胞中DNA的复制调控的复制调控复制的调控复制的调控许多现象表明，许多现象表明，DNA的复制是受到调控的。的复制是受到调控的。比如原核细胞在不同的生长条件下细胞的分裂比如原核细胞在不
57、同的生长条件下细胞的分裂速度是不同的，速度是不同的，举个例子：举个例子：大肠杆菌细胞在大肠杆菌细胞在37碳源充足的时候，分裂一碳源充足的时候，分裂一次需要次需要46分钟；而在碳源不充足的时候，分裂分钟；而在碳源不充足的时候，分裂一次需要一次需要10个小时，但是在两种情况下，个小时，但是在两种情况下，DNA复制的速度都是复制的速度都是40分钟左右分钟左右大肠杆菌的复制调控大肠杆菌的复制调控调节蛋白通过与复制复合物的相互作用确调节蛋白通过与复制复合物的相互作用确定复制起始的频率定复制起始的频率和复制方式。和复制方式。复制子由起始物位点和复制起点两部分。复制子由起始物位点和复制起点两部分。大肠杆菌染
58、色体DNA的复制调控复制起始不依赖于细胞分裂，复制终止则能引发细 胞分裂。复制调控主要发生在起始阶段。dnaA-ADP复合物； DNA复制的调控机制之一 细菌细菌(E.coli)DNA每个细胞周期复制每个细胞周期复制一次可能受一次可能受OriC甲基化的控制甲基化的控制甲基化-活化半甲基化-失活 对dam- E.Coli 的研究表明，半甲基化的OriC不能发动一轮新的复制 在复制过程中，OriC的半甲基化状态约保留13 min。而在基因组其它区域的GATC位点，在复制后1.5 min内即被甲基化。6646bp的小质粒宿主细胞的拷贝数为20-30个拷贝ColEI质粒ColE1DNA复制不依赖于本身
59、编码的蛋白质，而是完全依靠宿主DNA聚合酶。质粒DNA编码两个负调控因子Rop蛋白和反义RNA（RNA1),它们控制了起始DNA复制必须的引物合成。ColEI质粒DNA的复制调控ColE1质粒DNA的复制调控前导链的合成oriV引物RNA前体的转录起始于复制起点上游555个核苷酸处，需经RNaseH加工后产生有555个核苷酸的引物，然后由DNA聚合酶I在引物的3末端起始DNA合成。RNA1的编码区在引物RNA编码区的5末端，转录方向与引物RNA相反，因此与引物RNA的5末端互补。RNA1通过氢键配对与引物RNA前体相互作用，阻止了RNaseH加工引物前体，使其不能转化为有活性的引物而对复制起负
60、调控作用。当不存在RNA1时，RNA引物前体形成自身的发夹结构，起类似终止子的作用当前体RNA与RNA1互补配对时，类终止子效应消失，引物前体的转录被继续，阻止了RNase H加工引物前体Rop蛋白能够提高前体RNA与RNA1的相互作用，加强负调控作用质粒质粒Col 1的复制调控的复制调控负调控因子负调控因子Rop蛋白和反义蛋白和反义RNA共同控制了共同控制了复制起始所必须的复制起始所必须的RNA引物的合成，从而来引物的合成，从而来控制控制DNA复制的起始复制的起始 真核细胞的复制调控（1）细胞生活周期水平调控）细胞生活周期水平调控 （2）染色体水平调控）染色体水平调控 （3）复制子水平调控）
61、复制子水平调控 真核细胞中真核细胞中DNA复制复制3个水平的调控个水平的调控（1）细胞生活周期水平的调控也称限制点调控即决定细胞停留在G1期还是S期，许多外部因素和细胞因子参与限制点的调控。促细胞分裂剂、致癌剂、外科手术切除四磷酸二腺苷、聚ADP-核糖染色体水平调控决定不同染色体或同一染色体不同部位的复制子按一定的顺序在S期起始复制与染色体是否处于活化状态有关与染色体是否处于活化状态有关（3）复制子水平调控决定复制的起始与否，高度保守复制子参与的多种因子均可参与调节，主要是复制起始调控，如酵母复制起始受时序调控。复制起始的许可因子复制起始的许可因子（licensing factor）调控调控
62、激活状态的，为下一次复制提供起始信号激活状态的，为下一次复制提供起始信号复制完成后，核内的复制完成后，核内的licensing factor失活失活细胞质中合成新的细胞质中合成新的licensing factor核膜的裂解，核膜的裂解，licensing factor才有机会才有机会与核物质一起进入与核物质一起进入进入细胞核，进入细胞核，licensing factor就会活化就会活化不同点不同点原核生物原核生物真核生物真核生物起始位点起始位点一个一个多个多个(多至千个多至千个)前前导链导链合成合成DNA聚合聚合酶酶DNA聚合聚合酶酶随后随后链链合成合成DNA聚合聚合酶酶DNA聚合聚合酶酶或或引物引物长长短短50100个核苷酸个核苷酸10个核苷酸个核苷酸冈冈崎片段崎片段长长短短10002000个核苷酸个核苷酸100200个核苷酸个核苷酸RNA引物水解引物水解DNA聚合聚合酶酶核酸核酸酶酶H修修补补缺口缺口DNA聚合聚合酶酶DNA聚合聚合酶酶复制速度复制速度快快慢慢原核生物与真核生物DNA复制的不同点
