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1、武武汉轻工大学工大学青霉素的消青霉素的消费工工艺主讲人：张璐团队人员：周聪、吴昊、张杰、李春晓知知识识目的：目的： 掌握掌握发发酵消酵消费费青霉素的条件控青霉素的条件控制，及青霉素提取与精制的控制点。制，及青霉素提取与精制的控制点。重点重点:掌握掌握发发酵消酵消费费青霉素的工青霉素的工艺艺流流程程难难点点:青霉素提取与精制的控制点青霉素提取与精制的控制点什么是青霉素什么是青霉素青霉素青霉素 又被称又被称为为青霉素青霉素G、青霉、青霉素素钠钠、苄苄青霉素青霉素钠钠、青霉素、青霉素钾钾、苄苄青霉素青霉素钾钾等。青霉素是抗菌素等。青霉素是抗菌素的一种，能破坏的一种，能破坏细细菌的菌的细细胞壁胞壁 革
2、革兰兰氏阳性菌氏阳性菌 并在并在细细菌菌细细胞的胞的繁衍期起繁衍期起杀杀菌作用的一菌作用的一类类抗生素，抗生素，是第一种可以治是第一种可以治疗疗人人类类疾病的抗疾病的抗生素。青霉素是生素。青霉素是-内内酰酰胺胺类类抗生抗生素的典型代表。素的典型代表。青霉素构造青霉素构造青霉素的理化性青霉素的理化性质1、稳定性：固体青霉素盐的稳定性与其含水量和纯度有很大的关系；2、溶解度：青霉素游离酸在水中溶解度很小，易溶于有机溶剂如醋酸乙酯、苯、氯仿、丙酮和乙醚中，而其钾盐、钠盐易溶于水和甲醇，可溶于乙醇；3、降解反响：青霉素是很不稳定的化合物，遇酸碱或加热易分解而失去活性，并发生分子重排。a最早发现的产生青
3、霉素的 原始菌种是点青霉菌，消费才干 很低，不能满足工业消费要求， 所以被淘汰。如今主要采用的的 产黄青霉菌。b为了提高产黄青霉的青霉素产量 运用的诱变剂如：二环氧丁烷、 甲磺酸乙酯、乙烯亚胺、亚硝酸、 X射线等。 菌种：n产黄青霉：产黄青霉：Penicillium chrosogenumn深层培育深层培育n 菌丝形状菌丝形状n菌落：平坦或皱褶，圆形。菌落：平坦或皱褶，圆形。 n分生孢子：链状；分生孢子：链状；n 颜色颜色丝状菌球状菌黄孢子丝状菌绿孢子丝状菌：发酵单位85000U/mL绿孢子球状菌白孢子球状菌：发酵单位高，对原材 料、设备要求高，提 炼收率低。青霉素青霉素发酵工酵工艺1.发酵工
4、艺流程 孢子制子制备1、将沙土孢子先在用甘油、葡萄糖、蛋白胨组成的培育基进展斜面培育，经传代活化，得单菌落。2、再传斜面，培育7天，制得斜面孢子。3、再移植到优质小米或大米固体培育基上，25C，相对湿度45%-50%，生长7天，大米外表长出明显小菌落时要再振摇均匀，使菌丝在大米外表能均匀生长，制得绿色小米孢子。留意：每批孢子必需进展严厉摇瓶实验，测定效价及检查杂菌情况。斜面孢子和米孢子培育要留意湿度控制种子罐培育工种子罐培育工艺一级种子发酵：发芽罐，孢子萌生，构成菌丝。培育基：葡萄糖，玉米浆，碳酸钙，玉米油 消沫剂等；接种量:200亿孢子/t培育基空气流量: 1：3通气量与发酵液体积比m3 /
5、 m3 min；搅拌转速:300-350r/min； 温度：271 ； 时间: 40h。质量：菌丝浓度达40%，菌丝形状正常二二级级种子罐：繁衍罐，大量繁衍。种子罐：繁衍罐，大量繁衍。培育基：葡萄糖、玉米培育基：葡萄糖、玉米浆浆、碳酸、碳酸钙钙，玉米油，玉米油，消沫消沫剂剂等；等；接种量：接种量：10；空气流量：空气流量：1:1-1.5 m3 / m3 min ；搅搅拌拌转转速：速：250-280r/min；pH：自然；：自然；温度：温度：251；时间时间： 10-14h；质质量：菌量：菌丝浓丝浓度达度达40%，残糖，残糖1.0%以下，菌以下，菌丝丝粗壮，粗壮，III期期 脂肪粒，脂肪粒，积积
6、累累贮贮藏物藏物 ，无，无杂杂菌，效价在菌，效价在700u/ml左右。左右。消消费罐培育工罐培育工艺三三级级罐：消罐：消费费罐；罐；培育基：培育基： 花生花生饼饼粉，葡萄粉，葡萄糖，尿素，硝酸糖，尿素，硝酸铵铵， 硫代硫酸硫代硫酸钠钠，苯乙，苯乙酰酰胺，胺，CaCO3, 玉米油玉米油, 硅油硅油.培育基培育基碳源青霉菌能利用多种糖，如：葡萄糖、乳糖。目前采用碳源青霉菌能利用多种糖，如：葡萄糖、乳糖。目前采用淀粉水解糖，糖化液进展流加。淀粉水解糖，糖化液进展流加。氮源可采用玉米浆、花生饼粉、精制棉籽饼粉或麸皮粉等氮源可采用玉米浆、花生饼粉、精制棉籽饼粉或麸皮粉等有机氮源，及氯化氨、硫酸氨、硝酸氨
7、等无机氮源。有机氮源，及氯化氨、硫酸氨、硝酸氨等无机氮源。前体为生物合成含有苄基基团的青霉素前体为生物合成含有苄基基团的青霉素G，需求在发酵中，需求在发酵中参与前体如苯乙酸或苯乙酰胺。由于它们对青霉素有一定参与前体如苯乙酸或苯乙酰胺。由于它们对青霉素有一定毒性，故一次参与量不能大于毒性，故一次参与量不能大于0.1%，并采用多次参与方式。，并采用多次参与方式。无机盐包括硫、磷、钙、镁、钾前少后多，氮源转为氨无机盐包括硫、磷、钙、镁、钾前少后多，氮源转为氨基酸等盐类。铁离子对青霉素有毒害作用，应严厉控制基酸等盐类。铁离子对青霉素有毒害作用，应严厉控制发酵液中铁含量在发酵液中铁含量在30ug/mL以
8、下。以下。温度控制温度控制适宜菌适宜菌丝丝生生长长温度普通温度普通为为27C，分泌青霉素，分泌青霉素2020青霉素破坏少，周期很青霉素破坏少，周期很长长。变变温控制，不同温控制，不同阶阶段不同温度。段不同温度。生生长阶长阶段段:较较高温度，高温度，缩缩短生短生长时间长时间；消；消费阶费阶段适段适当降低温度，以利于青霉素合成。当降低温度，以利于青霉素合成。前期控制前期控制26左右，后期降温控制左右，后期降温控制22pH控制控制合成适宜pH6.46.6左右，防止超越7.0直接加酸或碱：自动控制流加葡萄糖：速度取决于pH变化快慢。pH下降：补加CaCO3、通氨、尿素或提高通气量pH上升：补加糖补糖的
9、控制可根据残糖量及发酵过程中的PH值或最好是根据排气中CO2及O2量来控制。普通在残糖降至0.6%左右，PH值上升时开场补糖。、生理酸性物质硫酸铵、油脂恒速补糖，用酸或碱控制方式 溶氧控制溶氧控制30饱饱和度，和度，产产率急率急剧剧下降；下降；10，呵斥不可逆的，呵斥不可逆的损损害。害。临临界溶氧界溶氧浓浓度：度：30。通气比：通气比：1：0.81.5 。适宜的适宜的搅搅拌速度拌速度:保保证证气液混合，提高溶氧气液混合，提高溶氧各各阶段的供氧比段的供氧比较消沫消沫天然油脂：玉米油；化学消沫天然油脂：玉米油；化学消沫剂剂：泡：泡敌敌。前期前期:主主间间歇歇搅搅拌拌,少加油少加油中期中期:搅搅拌、
10、加油、略微降低通气量拌、加油、略微降低通气量 必要必要时时 ，战战略：少量多次，一次略：少量多次，一次过过多影响呼吸代多影响呼吸代谢谢。后期后期:尽量少加消沫尽量少加消沫剂剂，可加水稀，可加水稀释释提提炼工工艺过程程青霉素不稳定，遇酸、碱、热分解失活水溶液中不稳定，非极性溶剂中稳定易溶于有机溶剂，水中溶解度很小青霉素盐很稳定；降解产物具有致敏性防止降解，条件温暖、快速。预处置置青霉素的存在部位：发酵液浓度较低：1030Kg/M3含有大量杂质：菌体细胞、核酸、杂蛋白质、细胞壁多糖等、残留的培育基、色素、盐离子、代谢产物等目的：浓缩目的产物，去除大部分杂质，改动发酵液的流变学特征，利于后续的分别纯
11、化过程。预处置:发酵液加少量絮凝剂沉淀蛋白过滤鼓式真空过滤机过滤：草酸或黄血盐一次滤液：pH6.2-7.2，略浑，棕黄或绿色，蛋白质含量0. 5-2.0%。板框式过滤机过滤：硫酸调理pH4.5-5.0，参与0.07%PPB溴代十五烷吡啶，0.07%硅藻土为助虑剂。二次滤液：廓清透明，用于提取收率90溶溶剂萃取萃取原理：青霉素游离酸易溶于有机溶原理：青霉素游离酸易溶于有机溶剂剂，而青霉素而青霉素盐盐易溶于水。易溶于水。萃取萃取剂剂：青霉素分配系数高的有机溶：青霉素分配系数高的有机溶剂剂。工工业业上通常用：醋酸丁上通常用：醋酸丁酯酯和醋酸戊和醋酸戊酯酯。除去蛋白除去蛋白质质：加：加0.05-0.1
12、%乳化乳化剂剂PPB(溴代十五溴代十五烷烷吡吡啶啶)。萃取：萃取：23次。次。逆流萃取逆流萃取过程程正相萃取：酸化正相萃取：酸化pH1.8-2.0，滤滤液：醋酸丁液：醋酸丁酯酯1：0.3，碟片式离心机分，碟片式离心机分别别 浓缩浓缩1.5-2.1 反相萃取：反相萃取：pH6.8-7.4 磷酸磷酸盐盐、碳酸、碳酸盐缓盐缓冲冲液液 。把青霉素从丁。把青霉素从丁酯酯中提取到中提取到缓缓冲液中。冲液中。反复萃取反复萃取23次，到达次，到达结结晶要求。晶要求。萃取条件：萃取条件：10下。萃取罐冷下。萃取罐冷冻盐冻盐水冷却。水冷却。青霉素萃取方式 多级逆流萃取脱色脱色1.萃取液中萃取液中添加活性炭，添加活性炭，除去色素。除去色素。2.过滤，除，除去活性炭。去活性炭。结结晶晶直接直接结结晶晶加醋酸钠乙醇溶液反响：得到结晶钠盐。加醋酸钾乙醇溶液：得到青霉素钾盐。薄膜蒸发工艺图结结晶晶共沸蒸共沸蒸馏结馏结晶晶萃取液，再用0.5 M NaOH萃取pH6.4-6.8下得到钠盐水浓缩液。加3-4倍体积丁醇，16-26，真空0.67-1.3KPa下蒸馏。 水和丁醇构成共沸物而蒸出。钠盐结晶析出。结晶经过洗涤、枯燥60真空16h，磨粉，装桶，得到青霉素产品。谢谢！
