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1、第七章第七章 生物制品生产的基本设施与流程生物制品生产的基本设施与流程一、生物制品制造的原则一、生物制品制造的原则v1预防用生物制品必须是安全的，不应有明显预防用生物制品必须是安全的，不应有明显的副作用，无相应的疾病、持续感染和过敏反应。的副作用，无相应的疾病、持续感染和过敏反应。v 2预防用生物制品应具有能使机体产生保护性预防用生物制品应具有能使机体产生保护性免疫能力类似患病后所引起的免疫效应。免疫能力类似患病后所引起的免疫效应。v 3预防用生物制品应考虑运输、保存及使用上预防用生物制品应考虑运输、保存及使用上的方便。的方便。v 4预防用生物制品必须经过国家检定机构检定预防用生物制品必须经过
2、国家检定机构检定合格，包括流行病学效果观察证明是有效合格，包括流行病学效果观察证明是有效。二、生物制品制造的基本条件二、生物制品制造的基本条件v1.相应的厂房和动物舍；相应的厂房和动物舍；v2.相应的生产设施（培养基制造和灭菌设备；细菌培相应的生产设施（培养基制造和灭菌设备；细菌培育设备；细胞培养装置；温室、冻干、冷藏等）育设备；细胞培养装置；温室、冻干、冷藏等）v3.一定专业人员（生产技术、检验技术）一定专业人员（生产技术、检验技术）v4.具有防止散毒的设施和隔离条件具有防止散毒的设施和隔离条件v5.消毒和排污条件消毒和排污条件v6.供水供电供水供电v7.经国家有关部门批准取得生产许可证经国
3、家有关部门批准取得生产许可证。三、一般生物制品的生产流程v1. 由国家指定的部门领取生产用菌种或毒种 启封菌（毒）种。v2. 按规程标准进行鉴定v 符合标准的菌（毒）种接种于规 定的培养基或动物或禽胚胎或细胞 。 v3. 繁殖菌（毒）种 检验纯度、接种于制苗的培养基、 动物或细胞或胚胎。v4. 大量繁殖菌液或毒液 （1）免疫动物、采血制成高免血清 （2）灭活加佐剂制成灭活疫苗 （3）减毒加保护剂制成冻干活苗 （4）灭活制成诊断用抗原等。v5. 配制成半成品v6. 混合分装并冷藏。抗生素瓶洗烘灌塞生产联动线抗生素瓶洗烘灌塞生产联动线v7. 按规程抽样检验 （1）纯粹或无菌检验 （2）活菌计数、毒
4、价测定 （3）安全检验 （4）效力检验 （5）诊断液效价和特异性检验 （6）冻干的残水，真空度测定 （7）物理状态检验等。v8.签发合格通知交成品库v9.包装v10.发运出厂、使用。四、菌（毒）种的选择v1. 菌（毒）种的重要性：v是疫苗生产的根本v是对制品质量的直接保证。v2. 菌（毒）种的选择原则：v安全性：毒力能灭活或毒力低v免疫原性良好v遗传学稳定v无致癌性v生产适用性。v3. 注意事项v我国现有用于生产的菌（毒）种，都是经过研究单位进行大量研究之后选出的。v我国兽医生物制品制造及检验规程规定，凡经部、省（自治区）发给批准文号的产品，生产所需的菌（毒）种，由中监所或中监所委托分管的单位
5、供应。v制造用的病原微生物，必须按规程要求经过选择和鉴定后、符合标准的方得用于生产。v总则：总则：v制造死苗：标准强毒株，其免疫原性良好。制造死苗：标准强毒株，其免疫原性良好。v制造活苗：经过严格审查、鉴定的弱毒或无毒菌株，制造活苗：经过严格审查、鉴定的弱毒或无毒菌株，其毒力稳定，形态特征典型，不易变异，血清型与其毒力稳定，形态特征典型，不易变异，血清型与当地流行的相同当地流行的相同。（一）菌种v1. 菌种来源：v（1）历史清楚：流行地区、动物种、流行资料清楚，分离鉴定资料完整，传代、保存、生物学特性检查方法明确。v（2）生物学性状明显：以便易于鉴别。如培养、电镜、免疫、病理变化等。v（3）遗
6、传学性相对纯一和稳定：在生产中也经常挑选、纯化、克隆化等。v（4）反应原性和免疫原性优良：在生产中也通常通过浓缩、提纯、导入佐剂等方法改善。v（5）毒力在规定范围内。v2、菌种鉴定：v（1）形态及培养特性检查：v（2）血清凝集试验：v（3）毒力鉴定： 强毒株本动物、试验动物的致死剂量、死亡率 弱毒株致死与不致死的剂量范围等。v例：麻疹活疫苗规程部分v每批至少10只成鼠（1520g），脑内接种0.03ml和腹腔接种0.5ml，观察21d，至少有原接种小鼠80%成活，并且无一小鼠呈现因病毒种子中外源性传染因子感染，则试验合格。v所有死后24h后或有症状的小鼠均应解剖接种5只，观察21d 。v（4）
7、免疫原性鉴定（免疫力试验）：v用于制造菌苗的各菌种，按各自的制造方法制成菌苗，免疫实验动物，经过13周后，攻击致死剂量或若干致死剂量的强毒菌，观察动物发病、死亡和保护等情况。v菌种抗致死量强毒越多，保护率越高，免疫原性越好。v保护率一般应能达5080%小鼠成活，各制品的指标各不相同。v（5）稳定性试验： 制造弱毒活苗的菌种，要特别注意其毒力是否稳定v在培养基上传2030代后，其菌落形态无变化、毒力不明显增强，免疫原性不减弱，则初步认为是稳定的。v接种动物传代510代后，其毒力不增强则稳定。v（6）毒性试验：v按规定制成死苗注射小鼠（1518g）（不加入防腐剂），注射后3天，小鼠体重不应有降低。
8、7天后增重不少于对照组60%增重，且不得有死亡。（二）毒种（二）毒种v通过动物、鸡胚胎或细胞（CPE、蚀斑）来进行鉴定，依据各自的致病力及特定的组织的含毒量和对动物的免疫力作为选择和鉴定的标准。 （见例）例例1、猪瘟毒株、猪瘟毒株猪瘟兔化弱毒株 接种家兔 经过一定潜伏期 出现定型热而无明显可见的症状。例例2 新城疫病毒新城疫病毒鸡新城疫I系弱毒株 接种10日龄鸡胚，在2472h内死亡，胎儿有明显的病变，红细胞凝集价为1:801:320。接种24月龄健康莱航鸡无不良反应为合格。v1.无菌试验v2.病毒毒力v3.纯毒试验。五、菌苗制造v（一）细菌的培养繁殖（一）细菌的培养繁殖v制造（活菌苗、死菌苗
9、）首先要大量繁殖细菌，在繁殖时依据其特性进行需氧、厌氧培养，其又分为固体培养和液体培养。在50年代后逐渐发展为液体培养基大罐通气培养，它适合工厂大量培养或连续培养制造菌苗。v培养罐以不锈钢或耐酸搪瓷罐为主体，装有：搅拌、通气、测温、测压、测PH、测溶解氧等。五、菌苗制造v（二）细菌灭活苗（二）细菌灭活苗v1. 将强菌株的纯培养物用物理或化学方法将其杀死或使之失去活力，再加入防腐剂或加入佐剂制成。v2. 此类疫苗安全，但疫苗用量大，局部有反应。五、菌苗制造v3. 制造程序： 菌种种子培养（纯粹检查）种子液菌液培养（活菌计数）灭活浓缩（稀释）配苗（加佐剂、防腐剂）分装。（见例）例：猪肺疫氢氧化铝菌
10、苗例：猪肺疫氢氧化铝菌苗v选取菌株（选取菌株（B B型多杀性巴氏杆菌）型多杀性巴氏杆菌）接种血琼脂接种血琼脂斜面斜面24h24h作为种子作为种子马丁肉汤马丁肉汤3720h3720h，作为种子，作为种子液液接种大量马丁肉汤培养基，加入量为接种大量马丁肉汤培养基，加入量为1%1%，36371224h36371224h， 纯粹检验，计数纯粹检验，计数加入加入0.1%0.1%甲醛甲醛 37712h 37712h 加入菌液加入菌液:Al(OH):Al(OH)3 3=5:1=5:1的的Al(OH)Al(OH)3 3 分装。分装。v使用：免疫期持续使用：免疫期持续6 6个月，皮下个月，皮下5ml5ml，25
11、25保存保存1 1年，年，1628916289个月个月。五、菌苗制造v（三）细菌弱毒冻干活苗（三）细菌弱毒冻干活苗v1. 将检验合格的种子液，按12%的量接种于适量的液体（或固体）培养基中，37824h，然后进行纯粹检验，无杂菌污染时，用于配苗，然后按7:15:1的比例加入保护剂（明胶蔗糖等），混合分装，冻干。 v2. 制造程序： 菌种种子培养（纯粹检查）种子液菌液培养（活菌计数）浓缩（稀释）配苗（加保护剂）分装预冻真空干燥。六、疫苗制造v选用材料：病毒或含病毒的组织 病毒是严格的细胞内寄生的微生物，在无细胞的条件下不能繁殖。v不论制造活疫苗或死疫苗，可有如下三种途径：（一）接种易感动物制苗（
12、二）接种鸡胚制苗（三）细胞培养制苗。病毒性疫苗生产流程及区域划分（一）接种易感动物制苗v即用动物培养繁殖病毒v1. 动物的选择： 其对动物的选择十分重要（对该病毒易感性高；尽量使用纯种、体重和年龄应符合规程的要求；外购动物要经过严格的隔离观察）。 常用：小白鼠、家兔、绵羊、牛、驴、马。v2.病毒材料处理v（1）液体材料直接离心取上清液体。 （2） 组织 剪成小块 研磨 加缓冲液1:10稀释 加1000ug链霉素和1000u青霉素，371h或4过夜。v3. 接种动物v4. 采集材料 病毒繁殖后，取含毒量高的组织器官，如脾脏、肝脏、淋巴结等v5.病毒材料粉碎（参考2步骤方法处理）v（1）捣粹后加入
13、适当的稀释液（PBS）v（2）铜纱网过滤除去粗粒，制成乳剂v6. 灭活（活苗加保护剂冻干）v7. 检验v8. 分装例1：水貂病毒性肠炎脏器灭活苗v病毒v水貂、仔猫、仔犬v出现典型症状后、捕杀v取胃、肠、肠系膜淋巴结、肝脏、脾脏。v称重、捣粹v制成1315%的生理盐水水乳剂v多层纱布过滤。v测定HA在1:120以上、HI阳性v加入甲醛使之终浓度在0.35%，3724hv然后在无菌的条件下开盖，包以无菌纱布，使甲醛挥发24h，必要时加入0.01%的结晶紫。例2：猪瘟活疫苗v猪瘟病毒v反复通过猪和兔交叉继代v家兔若干代。v2040倍稀释乳剂v接种35日龄乳兔1ml/只v3640h冻死v取心、肝、脾、
14、肌肉组织制苗（此种乳剂液体亦称为湿苗，或加入保护剂制成冻干疫苗） 。（二）接种鸡胚制苗v1. 优点：v（1）鸡胚营养丰富，许多病毒可以在鸡胚中生长繁殖v（2）鸡胚培养容易掌握，鸡蛋来源方便，价格低，不需要特殊的仪器设备，污染机会少，易于消毒。v2. 缺点：v（1）很多病毒不能适应，特别是哺乳动物的病毒。v（2）某些鸡胚可能带毒，如：新城疫病毒、禽白血病病毒、支原体、沙门氏菌等。v（3）受感染的鸡胚一般看不到变化（除引起死亡的外）。v（4）母源抗体的干扰。v（5）有些病原可能从母鸡传递到鸡胚等。v3. 鸡胚的选用：v（1）受精卵v（2）受精卵来自未免疫接种的健康鸡群。v（3）孵化前可用40温水配
15、制的新洁尔灭或莱苏尔液体浸泡四层纱布来擦表层消毒。v（4）孵化温度3839，湿度为6070。v4. 鸡胚接种：v（1）接种鸡胚通常是714日龄v（2）接种途径和方法）接种途径和方法 尿囊腔：911日龄 绒毛尿囊膜：1113日龄 卵黄囊：69日龄 羊膜腔：1012日龄 鸡胚脑内接种：812日龄 静脉接种：1014日龄。v（3）鸡胚感染病毒的标志是检查鸡胚的死亡、畸形、胚体出血、绒毛尿囊膜水肿、出血、坏死性病灶等例：ND I系弱毒疫苗v受精卵消毒v38.539孵化，选取发育良好的911日龄鸡胚v100倍稀释毒种0.1ml于尿囊腔接种。v接种后24h前和48h后死亡的鸡胚弃之v36h死亡的立即取之，
16、气室向上， 010中冷却424hv表面消毒。v除去蛋壳v剪破尿囊膜及羊膜v吸取鸡胚液。v加入青霉素500u/ml，链霉素500ug/mlv经过无菌检验等后，分装，备用。如制冻干苗，以5%蔗糖脱脂乳为保护剂，混合，过滤，分装，冻干。（三）细胞培养制苗（三）细胞培养制苗v1.自50年代起，细胞培养即广泛用于病毒工作中。v细胞培养分为： 原代细胞常用于病毒的分离、疫苗生产、血清学测定等； 传代细胞制苗、病毒的分离 细胞系不适合制苗。（二）接种鸡胚制苗v2. 常用的原代细胞：（1）鸡胚细胞：用于鸡马立克病、新城疫、鸡痘、鸭瘟、伪狂犬病等疫苗的制造。 制法：910日龄鸡胚胎儿去头、爪、PBS洗3次剪成0
17、.51.0mm小块，加入组织量510倍的0.25%胰酶液3637水浴消化1030min弃胰酶洗3次培养37 ，2448h长成单层即可接毒。v（2）兔、地鼠、绵羊、山羊、猪肾脏细胞：用于伪狂犬病、马脑炎、羊痘、猪瘟等疫苗的制造。v（3）牛、羊睾丸细胞：用于猪瘟、绵羊痘、山羊痘等弱毒疫苗的制造。v（4）驴白细胞：用于培养马传染性贫血病毒，制造弱毒疫苗。细胞培养制苗细胞培养制苗:细胞转瓶机结构细胞转瓶机结构例：马立克火鸡疱疹病毒细胞苗 鸡胚细胞单层倒掉营养液加入含毒细胞的裂解液（1:601:100）加维持液37.538.5培养6472h待60%以上的单层细胞出现典型的细胞病变时收获细胞液裂解冻干支原
18、体检验出厂七、冷冻真空干燥技术及冻干保护剂七、冷冻真空干燥技术及冻干保护剂v特点：蛋白质、微生物、酶、激素等冻干后变性很少，生物活性仍能得到保持。v优点:v（1）使不稳定的物质在冻干过程中失去绝大部分水分，保持不变质，延长有效的保存时间，便于储藏。v（2）冻干制品加水后易于溶解恢复原状，便于使用。（一）冷冻真空干燥的基本原理（一）冷冻真空干燥的基本原理v1.原理：原理：v（1）根据热力学中的相平衡理论，随压力的降低，水的冰点变化不大，而沸点却越来越低，向冰点靠近。v（2）当压力降到一定的真空度时，水的沸点和冰点重合，冰就可以不经液态而直接汽化为气体，这一过程称为升华。v（3）真空冷冻干燥是在水
19、的三相点以下，即在低温低压条件下，使生物制品中冻结的水分升华而脱去。v2.真空冷冻干燥器真空冷冻干燥器v（1）冷冻干燥机组成）冷冻干燥机组成:v制冷系统v真空系统v加热系统v控制系统。（二）冷冻真空干燥的操作程序二）冷冻真空干燥的操作程序v1. 预冻：预冻： 共熔点：不同溶剂和溶质全部凝成固体的温度。一般共溶点在-20-35 ，故预冷则在-40 以下。要求：（1）快速冷冻对细胞的影响较小，缓慢冷冻容易引起细胞死亡。（2）生物制品一般预冻时间为34 h即可开始升华。v2. 干燥：干燥：v 通常在24左右，有低于共溶点下抽真空和高于共溶点下抽真空。预冻结束之时即是抽真空开始，按要求在30min 左
20、右真空度必须达到10Pa。v（1）升华干燥阶段v 1）在共熔点温度将冻结物质中的水分除去的过程称为升华。v 2）制品在升华干燥中可除去85以上的水分。v3）制品在升华时需要吸收热量，必须对制品进行加温，但不能使制品的温度超过共熔点温度，冻结物质的共熔点温度亦即其升华温度。v4）升华干燥的制品温度如果低于共熔点温度过多，则升华的速率降低，升华时间延长；如果高于共熔点温度，则制品发生溶化，干燥后发生体积缩小、出现气泡、颜色加深、溶解困难等现象。v（二）解吸干燥阶段（二）解吸干燥阶段：v 使与物质结合的水分子通过加热方式除去的过程称为解吸干燥。v 1）在解吸干燥阶段，可以使制品的温度迅速上升到该制品的最高容许温度，并在该温度一直维持到冻干结束。v 2）病毒性制品为25，细菌性制品为30，血清、抗生素等可高达40，甚至更高。v 3）解吸干燥的时间一般不少于2 h。v3. 加塞、压盖：加塞、压盖：v 在箱内加塞和压塞。在箱内加塞和压塞。v4. 冻干机的清洗和消毒：冻干机的清洗和消毒：v 常用的消毒方法有蒸汽消毒法和化学消常用的消毒方法有蒸汽消毒法和化学消毒法两种。毒法两种。v（1）使用蒸汽消毒法的冻干机本身相当于一台高压蒸汽消毒柜。v（2）化学消毒法常用的消毒剂有酒精、甲醛和环氧乙烷。酒精一般用于喷洗法，甲醛、环氧乙烷一般用于熏蒸法。
