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1、生猪重要疫病样品采集要求与实验室检测意义李峰李峰李峰李峰 研究员研究员研究员研究员山东省滨州畜牧兽医研究院山东省滨州畜牧兽医研究院山东省滨州畜牧兽医研究院山东省滨州畜牧兽医研究院山东省生猪创新团队滨州综合试验站山东省生猪创新团队滨州综合试验站山东省生猪创新团队滨州综合试验站山东省生猪创新团队滨州综合试验站生猪重要疫病实验室检测技术研修班生猪重要疫病实验室检测技术研修班分享内容实验室检测的重要意义实验室检测的主要内容生猪主要疫病样品采集要求与注意事项其他样品采集要求实验室室检测的重要意的重要意义明确所明确所发生的疾病种生的疾病种类：传染性因素：染性因素：细菌、病毒、支原体、其它微菌、病毒、支原体
2、、其它微生物；生物； 非非传染性因素染性因素 单纯感染感染 /混合感染混合感染 是否是否为人人兽共患病共患病病原分子生物学病原分子生物学检测分析分析区域区域优势毒株基因型分析毒株基因型分析病原分子病原分子进化与演化与演变病原分子序列与疫苗比病原分子序列与疫苗比对细菌培养与菌培养与药物敏感性物敏感性试验细菌初步菌初步鉴定：毒力、血清型定：毒力、血清型药物敏感性物敏感性试验：解决合理用：解决合理用药问题自家疫苗自家疫苗试制：技制：技术储备细菌的染色菌的染色形形态学学观察察培养基的制培养基的制备细菌分离培养菌分离培养纯化化细菌的生化菌的生化试验药物敏感物敏感试验病猪的剖检病猪的剖检病猪病料的采集、保
3、存病猪病料的采集、保存总总RNA的提取的提取反转录反转录聚合酶链式反应聚合酶链式反应（PCR）猪瘟病毒抗体猪瘟病毒抗体猪伪狂犬病病毒猪伪狂犬病病毒gPI抗体抗体(野毒野毒)猪流感血凝抑制猪流感血凝抑制试验试验猪细小病毒病乳猪细小病毒病乳胶凝集试验（胶凝集试验（LAT）猪繁殖与呼吸综猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体合征病毒抗体DNADNA提取提取 PCRPCR血清学检测血清学检测分子诊断分子诊断细菌分离细菌分离结果分析结果分析生猪主要疫病样品采集要求采样原则采样原则 1、适时采集适时采集适时采集适时采集 ：尽可能采集到新鲜样品。用于分离病原体：尽可能采集到新鲜样品。用于分离病原体的，须在病初发热期或出
4、现典型临诊症状时采集；若制备血的，须在病初发热期或出现典型临诊症状时采集；若制备血清，空腹时采血。尸体上采样，应在动物死后立即采集。清，空腹时采血。尸体上采样，应在动物死后立即采集。 2 2、典型采样、典型采样、典型采样、典型采样 ：样品具有代表性。选择典型动物，即未经：样品具有代表性。选择典型动物，即未经药物治疗、病状典型的动物；选择典型材料，病原体含量最药物治疗、病状典型的动物；选择典型材料，病原体含量最高的材料；尸体采样，采集有病变组织、器官或病变最明显、高的材料；尸体采样，采集有病变组织、器官或病变最明显、最典型的部位。最典型的部位。 3 3、合理采样、合理采样、合理采样、合理采样 ：
5、群体发病时，至少采：群体发病时，至少采5头动物的病料。每头动物的病料。每一种样品应有足够的数量。一种样品应有足够的数量。 4 4、无菌采样、无菌采样、无菌采样、无菌采样 ：无菌操作，尤其是供微生物学检查和血清：无菌操作，尤其是供微生物学检查和血清学检查的样品学检查的样品 5 5、安全采样、安全采样、安全采样、安全采样：注意人员安全，防止感染，防止病原扩散：注意人员安全，防止感染，防止病原扩散造成环境污染。造成环境污染。病理剖检病理剖检腹部朝上平放切开四肢颈部淋巴结股内则淋巴结剖检颌、颈部皮下组织、颌下淋巴结观察横切胸骨柄，暴露胸腹腔观察胸腹腔器官变化纵切胸骨柄取出胸腔器官剖开颅腔暴露脑部器器官
6、官症状症状/病变病变疑似疾病疑似疾病体体表表耳尖、屁股、腹部发紫耳尖、屁股、腹部发紫微循环障碍：猪瘟、弓形体微循环障碍：猪瘟、弓形体背部发紫，规则菱形，边缘背部发紫，规则菱形，边缘整体整体猪丹毒猪丹毒全身通红全身通红链球菌链球菌鼻子流血和鼻子流血和/泡沫泡沫胸膜肺炎胸膜肺炎背部点状出血、毛孔出血、背部点状出血、毛孔出血、皮肤发白皮肤发白附红细胞体、蓝耳病附红细胞体、蓝耳病会阴、臀部、四肢出现周边会阴、臀部、四肢出现周边紫色，中间白色圆形、边缘紫色，中间白色圆形、边缘紫褐色纽扣状坏死紫褐色纽扣状坏死圆环病毒圆环病毒依据剖检病变推导可能发生疫病依据剖检病变推导可能发生疫病淋淋巴巴结结颌下淋巴结肿大
7、，出血性坏死颌下淋巴结肿大，出血性坏死全身淋巴结有大理石样出血变化全身淋巴结有大理石样出血变化腹股沟浅淋巴结水肿、切口外翻，腹股沟浅淋巴结水肿、切口外翻，表面苍白，渗出透明液体表面苍白，渗出透明液体咽、颈及肠系膜淋巴结黄白色干酪咽、颈及肠系膜淋巴结黄白色干酪样坏死灶样坏死灶淋巴结充血、水肿、小点状出血淋巴结充血、水肿、小点状出血支气管淋巴结、肠系膜淋巴结髓样支气管淋巴结、肠系膜淋巴结髓样肿胀肿胀猪炭疽、链球菌病猪炭疽、链球菌病猪瘟、蓝耳、猪肺疫猪瘟、蓝耳、猪肺疫圆环病毒圆环病毒2型型猪结核猪结核急性猪肺疫、猪丹毒、链急性猪肺疫、猪丹毒、链球菌病球菌病猪气喘病、猪肺疫、传染猪气喘病、猪肺疫、传染
8、性胸膜肺炎、副伤寒性胸膜肺炎、副伤寒血血液液血液黑或发紫，不凝固血液黑或发紫，不凝固中毒，内源性毒素：弓形中毒，内源性毒素：弓形体、胸膜肺炎、链球菌、体、胸膜肺炎、链球菌、猪丹毒猪丹毒血液不凝固、稀薄血液不凝固、稀薄贫血，蓝耳、附红细胞体贫血，蓝耳、附红细胞体呼呼吸吸道道喉头出血喉头出血猪瘟猪瘟扁桃体化脓、出血扁桃体化脓、出血猪瘟、伪狂犬猪瘟、伪狂犬喉头有泡沫喉头有泡沫蓝耳、副猪、传胸蓝耳、副猪、传胸气管有很多粘液气管有很多粘液细菌性疾病细菌性疾病肺肺出血斑点出血斑点纤维素性肺炎纤维素性肺炎心叶、尖叶、中间叶肝样变心叶、尖叶、中间叶肝样变水肿，小点状坏死水肿，小点状坏死粟粒性、干酪样结节粟粒性
9、、干酪样结节表面零星、边界清楚、湿润肉样变表面零星、边界清楚、湿润肉样变猪瘟猪瘟猪肺疫、传染性胸膜肺炎猪肺疫、传染性胸膜肺炎气喘病气喘病弓形体病弓形体病结核病结核病流感流感心心脏脏心包积液心包积液心包炎、心外膜炎（绒毛心）心包炎、心外膜炎（绒毛心）心外膜斑点状出血心外膜斑点状出血心肌条纹状坏死带心肌条纹状坏死带心内膜出血心内膜出血心瓣膜呈菜花样心瓣膜呈菜花样心肌内有米粒大灰白色包囊泡心肌内有米粒大灰白色包囊泡副猪、传胸副猪、传胸副猪、传胸、气喘病副猪、传胸、气喘病猪瘟、猪肺疫、链球菌病猪瘟、猪肺疫、链球菌病口蹄疫口蹄疫败血症败血症链球菌、慢性猪丹毒链球菌、慢性猪丹毒猪囊尾蚴病猪囊尾蚴病肝肝淤血
10、肿大淤血肿大沙门氏菌沙门氏菌表面灰白色或灰黄色纤维素表面灰白色或灰黄色纤维素沙门氏菌病、副猪、大肠杆菌沙门氏菌病、副猪、大肠杆菌白色坏死点，白色坏死点，弥漫性坏死弥漫性坏死沙门氏菌、伪狂犬、沙门氏菌、伪狂犬、霉菌毒素、霉菌毒素、中毒中毒脂肪肝脂肪肝传染性胃肠炎、流行性腹泻、仔传染性胃肠炎、流行性腹泻、仔猪大肠杆菌猪大肠杆菌胆囊肿大、胆汁粘稠胆囊肿大、胆汁粘稠沙门氏菌沙门氏菌胆囊肿大，胆汁呈黄色泥状胆囊肿大，胆汁呈黄色泥状圆环病毒圆环病毒脾脾脾边缘有锯齿状出血、脾边缘有锯齿状出血、梗死梗死弥漫性出血弥漫性出血淤血肿大，坏死淤血肿大，坏死脾边缘有小点状出血脾边缘有小点状出血猪瘟猪瘟、仔猪副伤寒、仔
11、猪副伤寒猪瘟、猪丹毒、弓形体、猪肺疫猪瘟、猪丹毒、弓形体、猪肺疫弓形体病，弓形体病，霉菌毒素中毒（全）霉菌毒素中毒（全）仔猪红痢仔猪红痢胃胃胃粘膜斑点状出血，溃疡胃粘膜斑点状出血，溃疡胃粘膜充血、卡他性炎症，胃粘膜充血、卡他性炎症，呈大红布样呈大红布样/麦麸状假膜麦麸状假膜粘膜下水肿粘膜下水肿胃壁增厚胃壁增厚猪瘟、胃溃疡猪瘟、胃溃疡猪丹毒、食物中毒猪丹毒、食物中毒副伤寒副伤寒水肿病水肿病水肿、大肠杆菌、魏氏梭菌水肿、大肠杆菌、魏氏梭菌肠肠乳糜管内无脂肪、出血乳糜管内无脂肪、出血病毒性腹泻病毒性腹泻乳糜管内有脂肪乳糜管内有脂肪细菌、球虫或营养性腹泻细菌、球虫或营养性腹泻肠壁有白色绿豆大肉芽肿、肠
12、壁有白色绿豆大肉芽肿、淋巴滤泡增生淋巴滤泡增生沙门氏菌、食道线虫（大肠）、沙门氏菌、食道线虫（大肠）、球虫（结肠、盲肠）球虫（结肠、盲肠）浆膜出血浆膜出血猪瘟猪瘟回盲瓣出血、坏死，盲肠扣回盲瓣出血、坏死，盲肠扣状肿状肿猪瘟猪瘟肠粘膜出血肠粘膜出血流感、梭菌性肠炎、增生性肠炎流感、梭菌性肠炎、增生性肠炎肾肾苍白，针尖状出血苍白，针尖状出血猪瘟、伪狂犬猪瘟、伪狂犬淤血、肿大淤血、肿大猪丹毒、梭菌、链球菌（猪丹毒、梭菌、链球菌（紫红色、紫红色、红棕色红棕色）；蓝耳（）；蓝耳（紫黑色紫黑色）；增生）；增生性肠炎性肠炎（灰黑色，肾乳头淡黑色）（灰黑色，肾乳头淡黑色）灰白色、表面隆突不平灰白色、表面隆突不
13、平圆环病毒圆环病毒膀膀胱胱粘膜层有出血斑点粘膜层有出血斑点猪瘟猪瘟睾睾丸丸1 1个或个或2 2个睾丸肿大、发个睾丸肿大、发炎、坏死或萎缩炎、坏死或萎缩乙型脑炎、布氏杆菌病乙型脑炎、布氏杆菌病关关节节肿大、积液肿大、积液副猪、链球菌副猪、链球菌依据病种确定主要采集病料依据病种确定主要采集病料病名病名病原病原主要临床症状主要临床症状特征病理变化特征病理变化主要病料采集主要病料采集实验室诊断实验室诊断猪瘟HCV体温41左右，脓性结膜炎， 皮肤红斑点，指压不退色，先 便秘后腹泻，公猪包皮囊积尿， 小猪多有神经症状。实质器官多发性出血性为特 征的败血症病变，肾脏有出 血点或斑，尿道、膀胱、喉 头均有出血
14、点，脾脏边缘梗死。扁桃体、淋巴结、脾脏、肾脏和血清接种PK15细胞、分离病毒；ELISA、RT-PCR、GIA检测病原猪繁殖与呼吸障碍综合征（蓝耳病）PRRSV母猪流产，早产，死胎，木乃伊胎。胎儿大小比较一致，少数病猪双耳、尾部等发生短暂性皮肤紫绀。哺乳仔猪呈结膜炎，呼吸障碍及流鼻涕。青年 猪见呼吸道症状。间质性肺炎；肺水肿；淋巴 结肿大呈褐色。病猪的肺、流产胎儿的肠和腹水、母猪血清、鼻拭子、粪便、扁桃体、脾、淋 巴结 接种Marc-145细胞分离鉴定；ELISA方法检测抗体；分子生物学RT-PCR病名病名病原病原主要临床症状主要临床症状特征病理变化特征病理变化主要病料采集主要病料采集实验室诊
15、断实验室诊断猪伪狂 犬病PRV引起怀孕母猪流产，以死胎为主。仔猪也可出现体温升高，呼吸困难，下痢和特征性神经症状，15日龄以内仔猪易感， 病死率可达100%。 木乃伊胎或死胎重吸收。扁桃体白色溃疡或坏死灶，肝脏表面白色坏死点，脾脏白色坏死灶。脑部水肿等。扁桃体、脊髓、淋巴结、 脑组织动物试验；接种vero细胞分离病毒；PCR检测病原。猪圆环病毒病 PCV2被毛粗乱，喜挤堆，精神沉郁， 呼吸急促，皮肤苍白，腹泻，消瘦。淋巴结异常肿大、切面为白色。脾脏肿大，肾脏肿大呈土黄 色，并有散在的红色坏死斑 点，肺脏质地较硬似橡皮。肺脏、淋巴结、肾脏分子生物学PCR病名病名病原病原主要临床症状主要临床症状特
16、征病理特征病理变化变化主要病料采集主要病料采集实验室诊断实验室诊断流行性腹泻PEDV水样腹泻，或者在腹泻之间有呕吐。呕吐多发生于吃食或吃奶后。一周龄内新生仔猪发生腹泻后34天，呈现严重脱水而死亡，死亡率可达50%，最高的死亡率达100%。小肠扩张，内充满黄色液体，肠系膜充血，肠系膜淋巴结水肿。粪便、肠内容物接种Vero细胞，分离病原，RT-PCR检测。传染性胃肠炎TGEV一般2周龄以内的仔猪感染后12-24小时会出现呕吐，继而出现严重的水样或糊状腹泻，粪便呈黄色，常夹有未消化的凝乳块，恶臭，仔猪明显脱水，发病2-7天死亡，死亡率达100%；在2-3周龄的仔猪，死亡率在0-10%。主要病变在胃和
17、小肠，呈现充血、出血并含有未消化的小凝乳块，肠壁变薄。肠、肠内容物接种PK15细胞分离病毒，分子生物学RT-PCR病名病名病原病原主要临床症状主要临床症状特征病理变化特征病理变化主要病主要病料采集料采集实验室实验室诊断诊断口蹄疫FMDV猪口腔粘膜、鼻吻部、蹄部以及乳房皮肤发生水疱和溃烂为特征。不同年龄的猪易感程度不完全相同，一般是越年幼的仔猪发病率越高，病情越重，死亡率越高。仔猪心肌炎。水泡皮、水泡液、心脏、血清ELISA 检测抗体猪流感SIV发病初期病猪体温突然升高至40.341.5，厌食或食欲废绝，极度虚弱，常卧地。呼吸急促、腹式呼吸、阵发性咳嗽。从眼和鼻流出粘液，鼻分泌物有时带血。病猪挤
18、卧在一起，难以移动，触摸肌肉僵硬、疼痛，打嗝。剖检可见喉、气管充满含有气泡的黏液，黏膜充血，肺间质增宽，淋巴结肿大、充血，脾肿大，胃肠黏膜有卡他出血性炎症，胸腹腔、心包积液。肺、脾、淋巴结、血清、鼻拭子接种vero细胞、鸡胚分离病毒，分子生物学RT-PCR供病原学检查材料的采集、处理供病原学检查材料的采集、处理1、血液。前腔静脉或耳静脉采血。、血液。前腔静脉或耳静脉采血。2、分泌物和渗出液：采集口腔、鼻腔、喉气管、泄殖腔和阴道分泌物时，、分泌物和渗出液：采集口腔、鼻腔、喉气管、泄殖腔和阴道分泌物时，通常是将棉棒插入天然孔反复旋转后蘸上分泌物，然后将样品端剪下。通常是将棉棒插入天然孔反复旋转后蘸
19、上分泌物，然后将样品端剪下。3、淋巴结、内脏器官、肌肉：淋巴结连带周围脂肪整体采集；内脏器官和、淋巴结、内脏器官、肌肉：淋巴结连带周围脂肪整体采集；内脏器官和肌肉，通常取病变最明显的部位。肌肉，通常取病变最明显的部位。4、水疱皮：将病变部位清水清洗，剪取新鲜水疱皮、水疱皮：将病变部位清水清洗，剪取新鲜水疱皮35g放入灭菌小瓶内放入灭菌小瓶内5、肠管：选取至少、肠管：选取至少6cm肠管，两端结扎，从结扎线外端稍远端剪断。肠管，两端结扎，从结扎线外端稍远端剪断。以上病料采集后，立即放入灭菌的玻璃容器，密封，外贴标签。做细菌学检以上病料采集后，立即放入灭菌的玻璃容器，密封，外贴标签。做细菌学检查的，
20、尽快冷藏。做病毒学检查的，尽快冷冻或加入病毒保护液。常用的病查的，尽快冷藏。做病毒学检查的，尽快冷冻或加入病毒保护液。常用的病毒保护液：含抗生素的毒保护液：含抗生素的ph7.2-7.4磷酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、50%甘油磷酸盐缓冲液。甘油磷酸盐缓冲液。供血清学检查材料的采集、处理供血清学检查材料的采集、处理（1）采血。用于制备血清的血液采出后不加抗凝剂，不进）采血。用于制备血清的血液采出后不加抗凝剂，不进行脱纤处理。大中动物每头不少于行脱纤处理。大中动物每头不少于5ml。（2）制备血清。采血时使血液直接流入试管，加塞，立即）制备血清。采血时使血液直接流入试管，加塞，立即摆成斜面，待血液凝固后
21、竖起试管，使血清自然析出。也摆成斜面，待血液凝固后竖起试管，使血清自然析出。也可将血液离心分离血清。可将血液离心分离血清。作血清学检测的血液，在采集、运送、制备血清过程中，作血清学检测的血液，在采集、运送、制备血清过程中，均应避免震动和冻结，防止溶血，影响检测结果。均应避免震动和冻结，防止溶血，影响检测结果。（3）血清保存。制备的血清若能在一周内检测，）血清保存。制备的血清若能在一周内检测，4冷藏，冷藏，若需保存较长时间，应于若需保存较长时间，应于30冻结。冻结。猪的前腔静脉采血方法猪只的固定。公母猪用保定绳固定，要求尽可能吊得高一猪只的固定。公母猪用保定绳固定，要求尽可能吊得高一点，使猪的头
22、颈与水平面呈点，使猪的头颈与水平面呈3030度以上角度度以上角度( (如图如图1)1)，这样，这样，即方便采血人员察看采血部位，又使前腔静脉向外突出，即方便采血人员察看采血部位，又使前腔静脉向外突出，静脉血充胀。静脉血充胀。20kg20kg以上的中大猪，由以上的中大猪，由1-21-2个饲养员用捉猪个饲养员用捉猪器器( (或保定绳或保定绳) )拉住，头昂起，偏向右侧拉住，头昂起，偏向右侧( (如图如图2 2、3)3)；20kg20kg以下的小猪，可由以下的小猪，可由1-21-2个饲养员抓起，倒立，后背紧靠在个饲养员抓起，倒立，后背紧靠在栏架上栏架上( (如图如图4)4)。图1 公母猪保定图2 中
23、猪固定和采血图3 大猪固定和采血 图4 小猪的保定与采血选取合适的针筒和针头。选取合适的针筒和针头。根据经验，公母猪宜选用16#50mm针头(这种针头猪场不常用，但很多针头生产厂家都有生产，可以找兽医药械销售店联系购买)；30kg以上的中大猪，宜选用12#38mm针头；10-30kg小猪，可选用9#25mm(一次性注射器常配的针头)；10kg以下乳猪，应选择9#20mm针头(一次性注射器所配的另一种规格的针头) 找准下针部位。找准下针部位。猪的前腔静脉，越往头部越浅，但也越细；越靠胸部越粗，但越深。所以，采血应选择适当的部位。小猪取血的部位太靠前，血管太小，很难扎中，而且扎中了也很难抽到血液，
24、所以，小猪的采血部位应稍靠后。中大猪和公母猪血管比较大，往后太深，针头够不到血管，所以，应略靠前。根据我们的经验，20kg以下的小猪应采两前肢与气管交汇处(如图4)，公母猪和20kg以上中大猪可选颈部最低凹处(如图2、3 ）。下针和抽血。下针和抽血。小猪：小猪：对准以上描述的部位，用针垂直刺入。拉紧针筒活塞，若针头扎中前腔静脉，可见到血液自血管源源流出，抽取所需的血量即可。公母猪和中大猪：公母猪和中大猪：对准下针部位，使针头偏向气管约15o方向下针，拉紧针筒活塞，若扎中，可见血液流出。如果见不至血液流出，说明没有扎中，有可能是前腔静脉较深，可用手顶紧针筒，使针头扎深一点。 处理好所采的血液。处
25、理好所采的血液。采到血液后，应立即将注射器内的血液沿着贮藏血液的容器（试管或青霉素空瓶）徐徐注入，不能有气泡，也不能振荡，同时倾斜放置好。也可放在注射器内倾斜放置好后送检。若要送检血清，夏天在常温下放置一段时间，冬天要放置在2537温水中一段时间，以利血清析出。若需抗凝全血，在注射器或试管内需预先加入抗凝剂。 耳静脉采血方法 1)将猪站立或横卧保定，或用保定器具保定。 2)耳静脉局部按常规消毒处理。 3)1人用手指捏压耳根部静脉血管处，使静脉充盈、怒张（或用酒精棉反复局部涂擦以引起其充血）。 4)术者用左手把持耳朵，将其托平并使采血部位稍高。 5)右手持连接针头的采血器，沿静脉管使针头与皮肤呈
26、300450角，刺入皮肤及血管内，轻轻回抽针芯，如有回血即证明已刺入血管，再将针管放平并沿血管稍向前伸入，抽取血液。 实验室检测策略以前：以前：我们的误区我们的误区猪群发病了，采发病猪的血，化验。猪群发病了，采发病猪的血，化验。结果：无所适从。结果：无所适从。结论：化验无用，没有帮助。结论：化验无用，没有帮助。缺乏缺乏有效有效的实验室支持，是造成盲目用药、的实验室支持，是造成盲目用药、用苗的原因之一用苗的原因之一服务承诺服务口号：快速、高效、及时服务承诺： 对于已有检验方法的检验项目，对于已有检验方法的检验项目，对于已有检验方法的检验项目，对于已有检验方法的检验项目，48484848小时小时小
27、时小时内给出准确检验结果；内给出准确检验结果；内给出准确检验结果；内给出准确检验结果； 对于尚无检验方法的项目，对于尚无检验方法的项目，对于尚无检验方法的项目，对于尚无检验方法的项目，5 5 5 5个工作日个工作日个工作日个工作日内给予相关疫病的分子内给予相关疫病的分子内给予相关疫病的分子内给予相关疫病的分子检测检测结果；检测检测结果；检测检测结果；检测检测结果； 对使用过我公司研发的试剂盒的客户，对使用过我公司研发的试剂盒的客户，对使用过我公司研发的试剂盒的客户，对使用过我公司研发的试剂盒的客户，第一时间第一时间第一时间第一时间安排专职的安排专职的安排专职的安排专职的研究人员，提供全程技术支持服务；研究人员，提供全程技术支持服务；研究人员，提供全程技术支持服务；研究人员，提供全程技术支持服务；
