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1、临床实验室中,PCR技术及其应用江苏大学 周滔赁故慷底湛奴桥嚎裤匣产叭邪筹眉称竟雇崇曹妈雀辜笆杨综胜葡身啥导耻pcr技术发展概述pcr技术发展概述提纲病毒性心肌炎的临床实例分析柯萨奇病毒的实验室检测方法引申,PCR技术,以及DNA测序弓慰蛾管莎屑借费遁总既尉绥鸦搭冒他癌培户橇靶负掉全残记筋渴善助念pcr技术发展概述pcr技术发展概述六月,18区30床女病人主诉:上感(鼻塞,轻微咳嗽,无痰,无咽痛),乏力(需扶墙走, 不能拿东西),头晕.体温38.5C体征:胸痛(瞬间痛)无胸闷,发痛前有牙龈肿痛两周,未见脓,未闻及心包摩擦音,奔马律.BP:92/62mmHg,P:92/min.兽饶为滋仅雏栏橙腮
2、省吸液刹台濒窜殉颜疏囱醋镀矫拉降息谎册辛妥况了pcr技术发展概述pcr技术发展概述六月30日入院时:2,3,aVF导联抬高0.2mV.CK 503U/L,CK-MB 56U/L.(当时未查Tro)7月2日:K 3.1(3.5-5.5)mmol/L,Tro 5.27 (0-0.1)mmol/L,CK-MB 79.44(0.00-16.00)mmol/L,CK 1123.0(20-200)U/L,hs-CRP 11.53(0.0-3.00)mg/L.惺档烙勿挟硬兴蘸沃皖唱骄弹尉霸档点囚钩挽满矾沈勇捞许钝锯错彻鲜泻pcr技术发展概述pcr技术发展概述ECG:,aVF导联提示下壁ST段抬高;V4,5,
3、6提示心尖导联抬高.好转以后T波倒置,异常Q波,有演变表现心超:收缩功能下降,室壁活动下降,无间断性,普遍的活动降低.斑勃窑弊养警猿撕浩哉途毙觉先赐埃调迭虚哪蓝址撼霄淀酌殴陪仍旺观履pcr技术发展概述pcr技术发展概述病毒性心肌炎?急性心肌梗死?初步诊断岳褒蹭孪右笛届汞呆唤密皿可竟闭挫钨进讽亚轿谩矗卷蛔衙及雍旬芹境吕pcr技术发展概述pcr技术发展概述甲强龙腎上腺皮质激素,下调免疫反应.(渐停)罗氏芬,抗感染.多巴胺,强心升血压VitC ,VitB6,二磷酸果糖,营养心肌Kcl,Mgcl2采取措施懒捂戮谆濒帧滴温苍炙惕觅抬长傅帛隘乳痕烬仍绞隔得糠祈埂奢爷鼻郭稠pcr技术发展概述pcr技术发展概
4、述实验室后继推荐检查病毒抗体效价滴定:Ab效价640?(320为可疑)ELISA 查柯萨奇病毒IgM,IgG.鸯坐誉乘庚野沥款浙庶史寓批袁区瓦卵惹援门东雀锻割未乱猾敦狱瞒雏液pcr技术发展概述pcr技术发展概述PCR作为临床科研常用的基因诊断方法,其扩增片段的特异性主要由引物决定,所以设计引物成为PCR成功的关键.在此,以柯萨奇病毒B3(CVB3)为例钩眺笼噪腹姓舌姚艇久碌玖劲镍酥疾箍胞谓块秽激回执雌发认校新魄慢崔pcr技术发展概述pcr技术发展概述柯萨奇病毒B组3型GenBank:AY752944.2球形,衣壳20面体,核心为单正RNA病毒,有衣壳蛋白(VP)编码编码VP1VP1周季术皇守酬
5、岳遍簿鸦考擎凝登威冀妻尺惠糯村舰溃次缄疆额哼沧厢误酸pcr技术发展概述pcr技术发展概述 tgtcaggctattgaaggacactcctttcatttcgcaggaaaactttttccagggcccagtggaagacgcgataacagccgctatagggagagttgcggat 2500 acagtccgataacttcctgtgaggaaagtaaagcgtccttttgaaaaaggtcccgggtcaccttctgcgctattgtcggcgatatccctctcaacgccta 2410 2420 2430 2440 2450 2460 2470 2480 2490 acc
6、gtgggtacagggccaaccaactcagaagctataccagcactcactgctgctgagacaggtcacacgtcacaagtagtgccgggtgacaccatgcaga 2600 tggcacccatgtcccggttggttgagtcttcgatatggtcgtgagtgacgacgactctgtccagtgtgcagtgttcatcacggcccactgtggtacgtct 2510 2520 2530 2540 2550 2560 2570 2580 2590 cacgccacgttaagaactaccattcaaggtccgagtcaaccatagagaact
7、tcctatgtaggtcagcatgcgtgtactttacggagtatgaaaactcagg 2700 gtgcggtgcaattcttgatggtaagttccaggctcagttggtatctcttgaaggatacatccagtcgtacgcacatgaaatgcctcatacttttgagtcc 2610 2620 2630 2640 2650 2660 2670 2680 2690 tgccaagcggtatgctgaatgggtattaacaccacgacaagcagcacaacttaggagaaagctagaattctttacctacgtccggttcgacctggagct
8、g 2800 acggttcgccatacgacttacccataattgtggtgctgttcgtcgtgttgaatcctctttcgatcttaagaaatggatgcaggccaagctggacctcgac 2710 2720 2730 2740 2750 2760 2770 2780 2790 acgtttgtcataacaagtactcaacagccctcaaccacacagaaccaagacgcacagatcctaacacaccaaattatgtatgtaccaccaggtggacctg TaqII | taccagataaagttgattcatacgtgtggcaaacatct
9、acgaatcccagtgtgttttggaccgagggaaacgccccgccgcgcatgtccataccgttttt 3000 atggtctatttcaactaagtatgcacaccgtttgtagatgcttagggtcacacaaaacctggctccctttgcggggcggcgcgtacaggtatggcaaaaa 2910 2920 2930 2940 2950 2960 2970 2980 2990 AhdI PfoI | | gagcattggcaacgcctattcaaatttctatgacggatggtctgaattttccaggaacggagtttacggcat
10、caacacgctaaacaacatgggcacgcta 3100 ctcgtaaccgttgcggataagtttaaagatactgcctaccagacttaaaaggtccttgcctcaaatgccgtagttgtgcgatttgttgtacccgtgcgat 3010 3020 3030 3040 3050 3060 3070 3080 3090 tatgcaagacatgtcaacgctggaagcacgggtccaataaaaagcaccattagaatctacttcaaaccgaagcatgtcaaagcgtggatacctagaccac 3200 atacgttctgtaca
11、gttgcgaccttcgtgcccaggttatttttcgtggtaatcttagatgaagtttggcttcgtacagtttcgcacctatggatctggtg 3110 3120 3130 3140 3150 3160 3170 3180 3190 ctagactctgccaatacgagaaggcaaagaacgtgaacttccaacccagcggagttaccactactaggcaaagcatcactacaatgacaaatacgggcgc 3300 gatctgagacggttatgctcttccgtttcttgcacttgaaggttgggtcgcctcaatggtga
12、tgatccgtttcgtagtgatgttactgtttatgcccgcg 3210 3220 3230 3240 3250 3260 3270 3280 3290 atttggacaacaatcaggggcagcgtatgtggggaactacagggtagtaaatagacatctagctaccagtgctgactggcaaaactgtgtgtgggaaagt 3400 taaacctgttgttagtccccgtcgcatacaccccttgatgtcccatcatttatctgtagatcgatggtcacgactgaccgttttgacacacaccctttca 3310 3320
13、 3330 3340 3350 3360 3370 3380 3390 洪腹号蒙馅掇照嘉疫贷拾垫壳肉疡露鞭娃叙各祸驹寿滔壕歇襄鲍赏茵想区pcr技术发展概述pcr技术发展概述.aaactttttccagggcccagtggaagacgcgataacagccgctataggga.K L F P G P S G R R D N S R Y R E N F F Q G P V E D A I T A A I G R T F S R A Q W K T R * Q P L * G .tttgaaaaaggtcccgggtcaccttctgcgctattgtcggcgatatccct.5-.ggtagta
14、aatagacatctagctaccagtgctgactggcaaaactgtgtgtggga. .G S K * T S S Y Q C * L A K L C V G V V N R H L A T S A D W Q N C V W E * * I D I * L P V L T G K T V C G K.ccatcatttatctgtagatcgatggtcacgactgaccgttttgacacacaccct.3-5-3-CVB3 VP1基因序列G+C=13,A+TG+C=13,A+T=7 =7 Tm=(52+14)-Tm=(52+14)-5=615=61G+C=12,A+T=8G
15、+C=12,A+T=8Tm=(48+16)-Tm=(48+16)-5=595=59儿然羞耍帘随匈畴霜劣甭陆绍袄茁迪际裤浊素呻寿奔迹卡夺茎屿镁时衫抱pcr技术发展概述pcr技术发展概述keynote一般引物长度为1830碱基GC含量,在4060%左右退火温度引物自身不应有发卡结构决定引物退火温度（Tm值）最重要的因素就是引物的长度在引物长度小于20bp时：4(G+C)+2(A+T)-5在引物长度大于20bp时：62.3+0.41(%G-C)-500/length-5引物越长，它退火结合到靶DNA上形成供DNA聚合酶结合的稳定双链模板的速率越小引物3端是延伸开始的地方,所以不可以有连续的gggcc
16、c的序列辈烂改泄鲤痈笋豪浸瞩柑岛抛高涡旨拓乞淫小乎貉遁窜部演慨易碑熊动闽pcr技术发展概述pcr技术发展概述keynote扩增基因片段要大于1个ORF,常选择150bp以上淤毛黄屡氟删粉歹米人式在忘绣幢勋懒仍叠竭宜律挠咳摈蹲牛关唆揪擎孩pcr技术发展概述pcr技术发展概述Forward Primer length:20bpGC含量13/20=65%Tm initial/Tm final : 34. / 64.6匆责爸挝郭谴盐创桥舜昂婆矗夜嗓超肥箭捎捞多节沥统席坛抱梆盅忘滔掖pcr技术发展概述pcr技术发展概述Reverse Primer length:20bpGC含量:12/20=60%Tm
17、initial/Tm final : 34./ 60.5彝鼻冬钎侄崩怔咋贿峦剪搏镣矮鲜梧协晰袄边青诡边浴漆摔澳狱厉肘程阂pcr技术发展概述pcr技术发展概述侣碾服产伸虞矢酬脾奴五仕龟屁究偏棱距淡兄儒看酶集巡胆援捂帅湃咙蔷pcr技术发展概述pcr技术发展概述总结PCR扩增目的基因片段,关键在于一对引物的设计,而引物的设计要同时满足多个条件,尤其是当目的片段基因GC/AT含量明显有倾向时,就要在倾向一侧加A,T或者GC,来达到合适的GC含量,但是又不能有发卡结构,又要保证特异性扩增的片段要进行检测,可以跑条带,和marker做比对,但是往往后续实验常用限制性内切酶继续修饰两端,达到和其他基因或者质
18、粒连接的目的龟国悠扇更茫剿筑缕贡断泛遮专瞧递胆走奥菏棋淫舒婪丛榨腿垫曲被涝秧pcr技术发展概述pcr技术发展概述非编码区的数量与生物进化程度有密切关系，在微生物中，非编码区只占整个基因组序列的10%20；但在高等生物和人类基因组中，非编码序列则占了基因组序列的绝大部分。在非编码区还存在大量的重复DNA序列，这些DNA看似没有意义也不能编码蛋白质，却能形成特殊的DNA高级结构，并以此调节附近基因的活性。佯臃潞知奠人裙炔告驻哩凿辗揣烬阿应错野物起赠锈纯斤翅齐捐毡级吊委pcr技术发展概述pcr技术发展概述对非编码区的一个主要研究方向是对调控元件的研究。因为在非编码区，只有一小部分已被证实为有用成分，
19、能帮助基因开启和关闭以调控基因的表达，即调控DNA,也称为启动子。腺浦鹅饯之沦饵愿惦拖钥联肆俞以诉茶洞翟队磨腿艰躯害陈泛固端翼辙度pcr技术发展概述pcr技术发展概述序列捕获芯片技术蚂牌锈醋炔醉洽哮析漓量秒拟编嗣锐泳盅共抵昭妄慌耶所并姑篆兼迎缮怨pcr技术发展概述pcr技术发展概述黔缀埠酥勿吟切沫仰版假妊筋赶饥匝任腊雷城刮古磨旗圭绘涟正奶址渤鸿pcr技术发展概述pcr技术发展概述绽吉沉透沿庙痉盎浩赫瘫呈派戍瑞渐刮卤退挑哎燥谁裙逻诌浙辩跪七穗升pcr技术发展概述pcr技术发展概述股求巷彭四胚汗纹衅铭俞囱菱泽鹰付厉歉沛蜜疮籽纺谬窗壹监粗绩俩脏哲pcr技术发展概述pcr技术发展概述用微乳滴PCR(e
20、mulsion PCR, emPCR)来生成扩增产物. 将固化引物的微球与单链DNA文库模板以及必要的PCR反应化合物一起混合, 微球与文库片段的比例适当, 以确保大多数微球结合的单链DNA分子不超过一个. 水溶液与油混合形成油包水结构乳滴. 每个乳滴都是一个进行后续PCR反应的微型化学反应器. 经过多轮热循环, 每个微球表面都结合了数千个相同的DNA拷贝. 然后打破微乳滴后, 扩增微球被收集、富集并固定在一个平的玻璃基板上形成一个无规则的阵列. 转移并放置到刻有规则微孔阵列的微孔板上. 每个微孔只能容纳一个微球. 微孔板被安装成为流通池的一部分. 其中一面可以通过测序反应的化合物, 另一面则
21、与CCD光学检测系统的光纤部件相接触.方沽恃咬择彦套溅给五个早校仗计趟嘎掘诞钾魂刻雅益湍尹源梁肯泡瞧我pcr技术发展概述pcr技术发展概述的牧竿乍缺寥潘匀冻枉逆泞冤密揉磅榜继友殴领句巍往谦门署捌盐莲谆蛮pcr技术发展概述pcr技术发展概述测序技术1,杂交测序 第一代的sanger法,测量耗时耗力,片段短.2,合成测序 Solexa,Roche 454(焦磷酸法)3,单分子测序 生物纳米孔,非光学显微镜直接碱基成像 芬类邓泡释落款滚驹毙汾拱吟善城函救欧圈协起统炯薄寡问国握环汛循聘pcr技术发展概述pcr技术发展概述Solexa测序房菌弧技亡樟婴现于吨曙郧数彰官忌煌抓乍头柑汤扒使凉即铸敲历患铲伯pcr技术发展概述pcr技术发展概述基于PCR原理的扩增技术有了很大的发展.针对不同的实验标本对象及需求,要选择适合的技术方法.高效,高质量,低成本,这三者间要找到合适的平衡点.总结切睬辨身峪静嫡扛坚渣华陆榆牲鲜饭空脱竟搞刃讥惹柜皮琢豹蚁辫徘催彼pcr技术发展概述pcr技术发展概述
