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1、分子流行病学分子流行病学Molecular Epidemiology 流行病学教研室流行病学教研室王安辉王安辉1 1主要内容主要内容分子流行病学为何产生？分子流行病学为何产生？ 动力分子流行病学怎样产生？分子流行病学怎样产生？ 条件分子流行病学是什么？分子流行病学是什么？ 定义分子流行病学做什么？分子流行病学做什么？ 任务分子流行病学如何做？分子流行病学如何做？ 方法2 2一、分子流行病学为何产生？一、分子流行病学为何产生？实践需求是学科发展的根本动力实践需求是学科发展的根本动力疾病防治中新问题疾病防治中新问题分子生物学的发展分子生物学的发展 3 3暴露暴露疾病疾病吸烟吸烟Molecular
2、Epidemiology肺癌肺癌Black BoxBlack Box4 4疾病的疾病的“冰山冰山现象象”健 康 者亚临床者患者“海平面海平面”5 5二、分子流行病学怎样产生？二、分子流行病学怎样产生？n n分子生物学的发展分子生物学的发展n n分子遗传学的发展分子遗传学的发展n n生物与化学分析技术的发展生物与化学分析技术的发展6 6分子生物学技术突破分子生物学技术突破n nDNA双螺旋结构双螺旋结构n n限制性内切酶限制性内切酶n n重组重组DNA技术技术n nDNA碱基序列测定碱基序列测定(1980)n n聚合酶链式反应法（聚合酶链式反应法（1987Mullis)7 78 89 91010
3、G050035G050035（肺腺癌）（肺腺癌）EGFREGFRExon 21Exon 21 L833V and H835L L833V and H835L T2497GL833V A2504TH835L 1111发展历程发展历程n n分子流行病学产生于分子流行病学产生于20世纪世纪70年代，发年代，发展状大在展状大在90年代年代n n1972年，年，Kilbourne提出提出“流感的分子流流感的分子流行病学行病学”n n1977年年,法国法国Higginson提出应用精细技术提出应用精细技术进行生物材料流行病学研究进行生物材料流行病学研究1212n n1986年，核心是运用实验室方法和分析流
4、年，核心是运用实验室方法和分析流行病学，查明环境和宿主病因行病学，查明环境和宿主病因n n1993年，年，Schulte提出流行病学中应用生提出流行病学中应用生物标志或生物学测量的功能定义物标志或生物学测量的功能定义n n1996年，测量作为暴露和效应的生物标志年，测量作为暴露和效应的生物标志即信息大分子如即信息大分子如DNA、RNA和蛋白质和蛋白质1313国内国内n n1988年，从基因水平分析病原体特征，解年，从基因水平分析病原体特征，解决传染源和传播途径等流行病学问题，轮决传染源和传播途径等流行病学问题，轮状病毒腹泻、大肠杆菌腹泻等状病毒腹泻、大肠杆菌腹泻等n n1992年，从分子至基因
5、水平上研究医学事年，从分子至基因水平上研究医学事件分布及其决定因素和调控手段的学科件分布及其决定因素和调控手段的学科1414n n分子流行病学从九十年代分子流行病学从九十年代初期开始逐初期开始逐渐引入到了我引入到了我国流行病学的教学中国流行病学的教学中n n19981998年由第四年由第四军医大学主医大学主编出版了国内首本分子出版了国内首本分子流行病学流行病学专著著1515人类基因组流行病学人类基因组流行病学（human genome epidemiology, HuGE）n n应用流行病学与基因组信息相结合应用流行病学与基因组信息相结合的研究方法，开展以人群为基础的的研究方法，开展以人群为基
6、础的研究，评价基因组信息（基因或基研究，评价基因组信息（基因或基因变异及其相应编码的产物）对人因变异及其相应编码的产物）对人群健康和疾病的流行病学意义，是群健康和疾病的流行病学意义，是遗传流行病学与分子流行病学交叉遗传流行病学与分子流行病学交叉的前沿领域的前沿领域 1616分子流行病学现状分子流行病学现状n n研究内容更加丰富：从研究传染病开始，研究内容更加丰富：从研究传染病开始，拓展到流行病研究的更多领域拓展到流行病研究的更多领域 n n研究手段越来越多：芯片技术、色谱分研究手段越来越多：芯片技术、色谱分析、蛋白质谱分析等析、蛋白质谱分析等n n应用范围不断扩大：传染病、非传染病、应用范围不
7、断扩大：传染病、非传染病、健康相关事件等健康相关事件等1717三、分子流行病学是什么三、分子流行病学是什么? n n分子流行病学是阐明疾病与健康状态相关分子流行病学是阐明疾病与健康状态相关标志（或分子事件）在人群和生物群体中标志（或分子事件）在人群和生物群体中的分布及其影响因素，并研究防治疾病、的分布及其影响因素，并研究防治疾病、促进健康的策略与措施的科学促进健康的策略与措施的科学n n“分子分子”指运用分子生物学的技术方法来指运用分子生物学的技术方法来解决流行病学中的问题解决流行病学中的问题1818国际上的定义国际上的定义 n nTheterm“molecularepidemiology”m
8、aybeusedtodescribesuchanApproach:theincorporationof molecular, cellular, andotherbiologicmeasurementsintoepidemiologicresearch. 1919生物学生物学标志志(biologicalmarkers，biomarkers) 1 1、是指从暴露到疾病各个连续过程中可测是指从暴露到疾病各个连续过程中可测量的、能反映结构和功能改变的各种细胞量的、能反映结构和功能改变的各种细胞的、生物化学的、免疫学的遗传学的或生的、生物化学的、免疫学的遗传学的或生理功能等理功能等 2 2、分子流行病
9、学关注反映机体在分子水平、分子流行病学关注反映机体在分子水平的微小变化，因此有人把能反映分子水平、的微小变化，因此有人把能反映分子水平、基因水平的基因水平的DNADNA损伤、变异和表达异常的蛋损伤、变异和表达异常的蛋白分子的生物学标志称为白分子的生物学标志称为分子生物学标志分子生物学标志(molecular biomarkers)(molecular biomarkers) 2020主要生物学标志主要生物学标志按从暴露到疾病的连续事件分为按从暴露到疾病的连续事件分为1、暴露标志、暴露标志(exposuremarker,EM)2、效应标志、效应标志(effectivemarker)3、易感性标志
10、、易感性标志(susceptibilitymarker,SM)21211 1、暴露生物、暴露生物标志志 exposure biomarkerexposure biomarkern n与疾病或健康状态有关的暴露因素的生物标与疾病或健康状态有关的暴露因素的生物标志，称为暴露标志志，称为暴露标志n n分为外暴露标志和内暴露标志分为外暴露标志和内暴露标志2222n n外暴露标志：是指暴露因素进入机体之前外暴露标志：是指暴露因素进入机体之前的标志和剂量，如病毒、细菌、生物毒素、的标志和剂量，如病毒、细菌、生物毒素、吸烟烟雾、环境物质等吸烟烟雾、环境物质等 n n内暴露标志：是指暴露因素进入机体之后内暴露
11、标志：是指暴露因素进入机体之后的标志；的标志；有人称之为有人称之为体内剂量（体内剂量（internal internal dosedose）。如烟草中尼古丁。如烟草中尼古丁(nicotine)(nicotine)的代的代谢产物尿中的可丁宁谢产物尿中的可丁宁(cotinine)(cotinine)2323体内剂量标志体内剂量标志 环境暴露物质环境暴露物质生物学标标志生物学标标志 生物材料生物材料 尼古丁尼古丁 可丁宁可丁宁 体液体液 食物原料食物原料 体液体液 黄曲霉素黄曲霉素 食物食物 亚硝亚硝胺化合物胺化合物 尿尿 亚硝氨基酸亚硝氨基酸 24242 2、效、效应标志志n n指宿主暴露后产生功
12、能性或结构性变化指宿主暴露后产生功能性或结构性变化的生物标志，如突变的基因、畸变的染的生物标志，如突变的基因、畸变的染色体、特异蛋白等色体、特异蛋白等n n包括疾病标志（包括疾病标志（diseasemarker)n n健康状态标志（健康状态标志（healthmarker）2525n n健康状态标志健康状态标志(healthconditionmarker,HCM)n n早期生物效应标志早期生物效应标志(earlybiologicaleffectmarker,EBEM)n n结构和功能改变标志结构和功能改变标志(alteredstructureandfunctionmarker,ASFM)2626
13、n n病理标志病理标志(pathologicalmarker,PM)n n亚临床态亚临床态(sub-clinicalconditionmarker,SCCM)n n临床疾病标志临床疾病标志(clinicaldiseasemarker,CDM)2727健康状态健康状态HCM EBEM亚健康状态亚健康状态潜在疾病态潜在疾病态ASFM亚临床态亚临床态SCCM临界疾病态临界疾病态PM临床态临床态CDM28283、易感性标志、易感性标志susceptibilitymarkern n宿主体内在暴露之前就已存在的遗传性或获宿主体内在暴露之前就已存在的遗传性或获得性的、决定着因暴露而导致疾病发生可能得性的、决
14、定着因暴露而导致疾病发生可能性的可测量指标性的可测量指标 n n易感性与暴露至疾病发生的整个过程中的每易感性与暴露至疾病发生的整个过程中的每一个环节均有关系，是决定暴露至发病整个一个环节均有关系，是决定暴露至发病整个进程的重要因素进程的重要因素 2929健康状态健康状态HCM EBEM亚健康状态亚健康状态潜在疾病态潜在疾病态ASFM亚临床态亚临床态SCCM临界疾病态临界疾病态PM临床态临床态CDM3030四、分子流行病学做什么？四、分子流行病学做什么？ 任务( (一一) )疾病病因的探讨疾病病因的探讨 n n大多是环境因素与遗传因素同时起作用大多是环境因素与遗传因素同时起作用 n n遗传因素起
15、重要作用的疾病往往与基因有关遗传因素起重要作用的疾病往往与基因有关 n n很很多多与与环环境境因因素素有有关关的的疾疾病病，也也常常常常需需从从基基因因方方面面去去研研究究，因因为为环环境境因因素素可可以以通通过过宿宿主主的基因突变或异常表达引起疾病的基因突变或异常表达引起疾病 分子流行病学研究有着非常重要的作用分子流行病学研究有着非常重要的作用3131( (二二) )危险因子致病机制的研究危险因子致病机制的研究 n n癌癌症症发发病病的的分分子子流流行行病病学学研研究究是是个个典典型型的的例子例子 n n肿瘤的病因十分复杂，是环境和宿主多因肿瘤的病因十分复杂，是环境和宿主多因素作用的结果素作
16、用的结果3232大肠癌发生的基因异常模式大肠癌发生的基因异常模式正常上皮上皮形成过度 早期腺癌 中期腺癌 晚期腺癌 癌转移5q变形或缺失 17q-P缺失p53K-ras 17-变异 18q缺失 DCCDNA低甲基化3333从分子水平看从分子水平看n n肿瘤的发生与发展与癌基因激活和抑癌基肿瘤的发生与发展与癌基因激活和抑癌基因失活密切相关因失活密切相关 n n但究竟是哪些危险因素起作用，其作用机但究竟是哪些危险因素起作用，其作用机制是什么制是什么 n n分子流行病学研究将会提供进一步的证据分子流行病学研究将会提供进一步的证据3434肿瘤发生过程肿瘤发生过程促进 promotion启动 initi
17、ation转化 inversion发展 progression3535n n例如，大量的流行病学调查显示，黄曲霉例如，大量的流行病学调查显示，黄曲霉毒素（毒素（aflatoxin,AFTaflatoxin,AFT）是肝癌发生的主要）是肝癌发生的主要危险因素危险因素 n n进一步的分子流行病学研究发现，进一步的分子流行病学研究发现，AFTAFT可在可在体内氧化酶的作用下，形成体内氧化酶的作用下，形成AFTAFT环氧化物，环氧化物，其易与肝细胞内的其易与肝细胞内的DNADNA分子分子N N7 7鸟嘌呤残基结鸟嘌呤残基结合，从而造成合，从而造成DNADNA的损伤的损伤 3636n n另外，研究还发现
18、肝脏解毒酶之一，谷另外，研究还发现肝脏解毒酶之一，谷胱甘肽转硫酶（胱甘肽转硫酶（GSTGST）在肝癌患者的肝组）在肝癌患者的肝组织中的织中的T1T1基因缺失比例远远高于对照组基因缺失比例远远高于对照组3737( (三三) )疾病易感性的测定疾病易感性的测定 n n近来分子生物学与免疫学研究发现，如近来分子生物学与免疫学研究发现，如同传染病一样，机体对慢性病也同样存同传染病一样，机体对慢性病也同样存在着易感性，且往往与个体的某些基因在着易感性，且往往与个体的某些基因型别或序列或其表达产物有关，如果与型别或序列或其表达产物有关，如果与遗传有联系，往往称之为遗传易感性遗传有联系，往往称之为遗传易感性
19、 3838n n19871987年国外学者发现了一种新的病症，家年国外学者发现了一种新的病症，家族性载脂蛋白族性载脂蛋白-100-100缺陷缺陷 n n由于其低密度脂蛋白受体结合力下降，发由于其低密度脂蛋白受体结合力下降，发生高脂血症生高脂血症39394040载脂蛋白载脂蛋白-100第第10、708位碱基突变，结合力下降位碱基突变，结合力下降建立了等位基因特异性建立了等位基因特异性PCR检测这个突变位点检测这个突变位点表明这些携带者为冠心病的易感者表明这些携带者为冠心病的易感者流行病学研究，显示此突变携带者中，流行病学研究，显示此突变携带者中，50岁时男性岁时男性40%、女性、女性20%患冠心
20、病患冠心病4141( (四四) )流行规律研究流行规律研究 n n传染病流行规律传染病流行规律n n在在传传播播范范围围的的确确定定；传传播播途途径径的的判判断断与与传传染源的追索方面；染源的追索方面；n n分子流行病学可以发挥无与伦比的作用分子流行病学可以发挥无与伦比的作用 42421.1.传播范围的确定传播范围的确定 n n按按照照传传染染病病流流行行病病学学基基本本理理论论，在在一一次次暴暴发发或或流流行行中中，其其受受染染范范围围的的确确定定应应根根据如下原则据如下原则 n n在在暴暴发发或或流流行行期期间间，有有共共同同或或有有效效暴暴露露史史，经经过过一一个个平平均均潜潜伏伏期期发
21、发病病或或出出现现急急性性感感染染的的生生物物学学标标志志可可判判定定为为受受染染者者，然然后后总总计计受受染染人人员员，结结合合这这些些人人员员活活动动的区域以确定受染或流行涉及范围的区域以确定受染或流行涉及范围4343n n可是，过去测定的生物学标志主要是属可是，过去测定的生物学标志主要是属于血清学、免疫学、微生物学范围，缺于血清学、免疫学、微生物学范围，缺乏基因型标志，因而可能出现错误的判乏基因型标志，因而可能出现错误的判断断 4444举例：举例：n n以以色色列列海海法法市市(Haifa)Rambam(Haifa)Rambam医医学学中中心心的的急急性性乙乙型型肝肝炎炎暴暴发发的的分分
22、子子流流行行病病学学调调查查就就是是典典型型的一个例子的一个例子 19861986年年6 6月月7 7日日至至2626日日有有4 4例例暴暴发发性性乙乙型型肝肝炎炎( (患者患者-)-)入院，均死亡入院，均死亡 8 8月月1717日又有日又有1 1例例( (患者患者)同样入院后病故同样入院后病故经经过过血血清清学学调调查查又又发发现现1 1例例亚亚临临床床乙乙肝肝( (患患者者) ) 4545流行病学调查发现：流行病学调查发现：n n患患者者-于于同同年年4 4月月2323日日至至6 6月月2828日日同同住住在在一一个个病病房房，有有共共同同暴暴露露史史，经经描描述述性性与与分分析析性性流流
23、行行病病学学调调查查，确确定定这这是是一一次乙肝的暴发流行次乙肝的暴发流行n n传播时间很可能在传播时间很可能在4 4月月2929日日n n传传染染来来源源为为一一名名HBsAgHBsAg携携带带者者，当当时时也也住在同一病房住在同一病房 4646n n研究者此后又考虑到病人在此暴发中研究者此后又考虑到病人在此暴发中5 5名均为致死性的暴发性肝炎，且潜伏期名均为致死性的暴发性肝炎，且潜伏期非常短非常短 n n而传染来源，即那名而传染来源，即那名HBsAgHBsAg携带者为抗携带者为抗HBeHBe阳性的慢性肝病患者，故决心弄清阳性的慢性肝病患者，故决心弄清其基因有否特殊的突变其基因有否特殊的突变
24、 4747结果意外地发现结果意外地发现n n传染源、病人传染源、病人 - - 、这这6 6人的人的HBVHBV的的前前C C区区18981898与与19011901位核苷酸均发生了点突位核苷酸均发生了点突变，此外在变，此外在X X、前、前C C与与C C区还有很多突变区还有很多突变n n而患者而患者与与4 4名对照患者名对照患者(4(4名该医学中心名该医学中心的急性乙肝的急性乙肝) )的病毒株却无此突变的病毒株却无此突变 4848结果提示结果提示n n 此次暴发是由此次暴发是由HBVHBV的突变株引起的突变株引起 n n病病人人不不是是这这次次暴暴发发中中的的病病例例，引引起起其其发发病病的的
25、病病毒毒株株不不同同于于传传染染源源与与其其他他5 5名名病人病人 49492.2.传播途径的判定传播途径的判定 n n以往，传染病流行中传播途径或传播媒以往，传染病流行中传播途径或传播媒介的调查通常使用排除法，同时尽可能介的调查通常使用排除法，同时尽可能在媒介物中分离到引起流行的病原体或在媒介物中分离到引起流行的病原体或检测到病原学标志检测到病原学标志n n近来分子流行病学研究引入了一些新的近来分子流行病学研究引入了一些新的技术，如分子进化诊断技术，如分子进化诊断(molecular (molecular evolutionary diagnosis) evolutionary diagno
26、sis) 50503.3.传染源的追索传染源的追索 n n判判定定传传染染来来源源或或两两人人之之间间的的传传播播关关系系应应符符合合如下如下4条原则条原则n nA(传染源传染源)与与B(受染者受染者)的接触是有效接触的接触是有效接触n n接触发生在接触发生在A的传染期内的传染期内n nB的的发发病病时时间间是是在在暴暴露露后后该该病病最最短短与与最最长长潜潜伏期之间伏期之间n nA与与B受染致病的血清学型别一致受染致病的血清学型别一致n n如今看来，第如今看来，第条应该用基因型别来代替条应该用基因型别来代替 5151( (五五) )防制措施的研究防制措施的研究 1.1. 传染病预防传染病预防
27、n n由由于于对对传传播播与与流流行行范范围围的的确确定定，传传播播途途径径、传传播播媒媒介介与与因因子子以以及及传传染染来来源源的的推推断断更更为为精精确确，所所以以提提出出的的控控制制措措施施更更有有针对性，更有成效针对性，更有成效5252n n传染病预防中最可靠的手段是疫苗接种传染病预防中最可靠的手段是疫苗接种 n n但在疫苗预防注射方面尚存在一些问题，但在疫苗预防注射方面尚存在一些问题，如接种的效果，接种的副作用如接种的效果，接种的副作用 n n近来由于分子流行病学研究的进展，对近来由于分子流行病学研究的进展，对一些问题有了比较清晰的了解一些问题有了比较清晰的了解53532.2.非传染
28、病的预防非传染病的预防n n由于分子流行病学不仅研究疾病的危险由于分子流行病学不仅研究疾病的危险因素，而且研究其引起疾病整个过程中因素，而且研究其引起疾病整个过程中的所有环节的所有环节n n因此，这就为疾病的预防特别是第二级因此，这就为疾病的预防特别是第二级预防采取针对性措施奠定了科学的基础预防采取针对性措施奠定了科学的基础 5454( (六六) )其他方面的研究其他方面的研究n n除除了了上上述述五五个个方方面面的的研研究究范范围围外外，分分子子流流行行病病学学在在传传染染病病病病原原体体进进化化、人人群群健健康康的的影影响响因因素素及及其其遗遗传传背背景景等等方方面面的的研研究也将发挥重要
29、作用究也将发挥重要作用 5555五、分子流行病学怎么做？五、分子流行病学怎么做？ 方法方法 分子流行病学在某种意义上讲，是一分子流行病学在某种意义上讲，是一种流行病学宏观与实验室微观结合的方法种流行病学宏观与实验室微观结合的方法学，需要现场流行病学调查研究与实验室学，需要现场流行病学调查研究与实验室先进的检测技术相结合先进的检测技术相结合 因此，分子流行病学的研究方法大致因此，分子流行病学的研究方法大致可以分为可以分为二大类二大类：实验室技术与流行病学：实验室技术与流行病学现场研究方法现场研究方法5656( (一一) )实验室技术实验室技术 n n分分子子流流行行病病学学中中使使用用的的实实验
30、验室室技技术术相相当当广广泛泛，因因为为只只要要检检测测与与致致病病因因子子及及其其致致病病机机制制中中相相关关的的生生化化、生生理理、免免疫疫、分分子子、遗遗传传等等的的生生物物学学标标志志的的技技术术均均可可被被应用于分子流行病学研究应用于分子流行病学研究n n同时需要指出的是，现今的一些分子技同时需要指出的是，现今的一些分子技术有可能在将来被取代而废弃术有可能在将来被取代而废弃5757n n常常用用的的是是：血血清清学学、免免疫疫学学、生生物物化化学学、分分子子生生物物学学技技术术等等n n常常用用的的技技术术操操作作：ELISAELISA，RIARIA、免免疫疫组组织织化化学学、质质粒
31、粒提提取取、限限制制性性内内切切酶酶图图谱谱分分析析、DNADNA杂杂交交、多多聚聚酶酶链链反反应应、分分子子克克隆隆、核核酸酸序序列列分分析等析等5858( (二二) )现场流行病学研究方法现场流行病学研究方法n n在在传传统统的的流流行行病病学学研研究究中中，结结合合检检测测一一些些生生物物学学标标志志，以以从从分分子子水水平平更更深深层层次次揭揭示示病病因因联联系系或或致致病病因因子子的的致致病病机机制制，是是目目前前比比较较常常见见的的分分子子流流行行病病学学研研究究模模式式5959现场流行病学方法现场流行病学方法n n描述性研究描述性研究n n分析性研究：病例对照研究、队列研究分析性
32、研究：病例对照研究、队列研究 （病例（病例-病例研究、巢式病例对照研究）病例研究、巢式病例对照研究）n n实验性研究实验性研究6060目前比较常用的有下面目前比较常用的有下面2 2种种n n巢式巢式( (套式、嵌入式套式、嵌入式) )病例对照研究病例对照研究(nested case control study)(nested case control study)n n病例病例-病例研究病例研究(case-casestudy)61611.巢式病例对照研究巢式病例对照研究(nestedcasecontrolstudy)n n运作开始是按队列研究的方式进行：选择运作开始是按队列研究的方式进行：选择
33、一队列，收集基线资料一队列，收集基线资料n n采集所需研究的生物学标志的组织或体液采集所需研究的生物学标志的组织或体液标本储存备用标本储存备用n n然后随访到出现能满足病例对照研究样本然后随访到出现能满足病例对照研究样本量的病例数为止量的病例数为止6262n n把这些病例作为病例组，按配比条件，把这些病例作为病例组，按配比条件，从同一队列中选择从同一队列中选择1 1或数个非病例作对或数个非病例作对照，抽出病例与对照的基线资料并检测照，抽出病例与对照的基线资料并检测收集的标本，进行病例对照研究收集的标本，进行病例对照研究 63632.病例病例-病例研究病例研究(case-casestudy)n
34、n在病例对照研究的病例组中，临床类型可在病例对照研究的病例组中，临床类型可以不同，如脑卒中有出血型、缺血型，冠以不同，如脑卒中有出血型、缺血型，冠心病有心梗型、无心梗型心病有心梗型、无心梗型 n n某些生物学标志往往也是不均一的，即部某些生物学标志往往也是不均一的，即部分病例有某种生物学标志，而其余的则没分病例有某种生物学标志，而其余的则没6464n n那么就可把不同的临床类型或具有标志的那么就可把不同的临床类型或具有标志的这些病例与无标志的病例，按病例对照研这些病例与无标志的病例，按病例对照研究的方式处理资料，以探讨不同临床类型究的方式处理资料，以探讨不同临床类型的危险因素的差异或者这个生物
35、学标志与的危险因素的差异或者这个生物学标志与该疾病的其他危险因素之间的关系和相互该疾病的其他危险因素之间的关系和相互作用作用 6565传染病研究中的应用传染病研究中的应用 n n既往传统流行病学研究已经表明既往传统流行病学研究已经表明HCVHCV可经微可经微量血暴露而传播，但是传播的确切证据尚难量血暴露而传播，但是传播的确切证据尚难得到得到n nSuzukiSuzuki等通过等通过3 3对发生针刺事故的当事人对发生针刺事故的当事人HCVHCV感染的分子进化分析研究，在分子水平上找感染的分子进化分析研究，在分子水平上找到了易感者可经微量血暴露而感染到了易感者可经微量血暴露而感染HCVHCV的直的
36、直接证据，而且为传播途径的流行病学研究提接证据，而且为传播途径的流行病学研究提供了新方法，更重要的是使人们看到了分子供了新方法，更重要的是使人们看到了分子流行病学研究的意义流行病学研究的意义6666n n研究者首先通过流行病学调查方法研究研究者首先通过流行病学调查方法研究了了3 3例由于针刺事故而发生例由于针刺事故而发生HCVHCV感染的患感染的患者者(A(A2 2、B B2 2 和和C C2 2) )的详细感染过程的详细感染过程6767第一对（第一对（A1-A2）n n第第1 1个指示病例个指示病例(A(A1 1) )为1 1名名2424岁的因的因输血而血而受染的慢性受染的慢性HCVHCV感
37、染的男性患者感染的男性患者( (抗抗HCVHCV和和HCV RNAHCV RNA均阳性均阳性) )，受染者，受染者(A(A2 2) )是是1 1名名2424岁的的女女护士士n nA A2 2在在给A A1 1采血采血时左手食指被左手食指被针头刺破，当刺破，当即即鲜血流出，她血流出，她马上清洗了上清洗了伤口，并口，并报告告了医院了医院6868n如何调查？如何调查？n n在事故发生当天检测肝功未发现异常，在事故发生当天检测肝功未发现异常，抗抗HCVHCV和和HCV RNAHCV RNA均阴性均阴性n n但但2 2个月后发生了急性丙型肝炎，并转个月后发生了急性丙型肝炎，并转为慢性为慢性6969第第2
38、对（对（ B1-B2 ）n n第第2 2个指示病例个指示病例(B(B1 1) )为为1 1名名5959岁肝硬化肝岁肝硬化肝癌男性患者癌男性患者( (抗抗HCVHCV和和HCV RNAHCV RNA均阳性均阳性) )，受染者受染者(B(B2 2) )是是1 1名名3535岁内科医生岁内科医生 7070n n当护士给当护士给B B1 1抽肘静脉血时，抽肘静脉血时，B B1 1肝性脑病肝性脑病发作，护士只好拔出针，并放在病床旁发作，护士只好拔出针，并放在病床旁的椅子上，这时的椅子上，这时B B2 2过来帮忙，不慎坐在过来帮忙，不慎坐在该椅子上深度扎伤左臀部该椅子上深度扎伤左臀部 n n虽然在以后随访
39、时无明显临床症状，但虽然在以后随访时无明显临床症状，但检测特异性生物学标志发现检测特异性生物学标志发现B B2 2在在2 2个月个月后发展为慢性后发展为慢性HCVHCV感染感染 7171第第3对（对（ C1-C2 ）n n第第3 3个指示病例个指示病例(C(C1 1) )为为1 1名名6868岁的肝硬化岁的肝硬化肝癌男性患者肝癌男性患者( (抗抗HCVHCV和和HCV RNAHCV RNA均阳性均阳性) )，受染者，受染者(C(C2 2) )是是1 1名名4343岁无症状岁无症状HBVHBV携带携带的护士的护士 7272n nC C2 2在给在给C C1 1插静脉导管后拔针时扎伤左手插静脉导管
40、后拔针时扎伤左手中指与无名指间的手掌，当时出现流血，中指与无名指间的手掌，当时出现流血，便向院方作了报告便向院方作了报告 n nC C2 2在在2 2个月后发生了急性丙型肝炎，并个月后发生了急性丙型肝炎，并转为慢型转为慢型 7373 为了阐明为了阐明A A1 1与与A A2 2、B B1 1与与B B2 2和和C C1 1与与C C2 2之之间的传播关系和方向，间的传播关系和方向，分子流行病分子流行病学如何研究？学如何研究？7474生物学标志生物学标志n n抗抗-HCV-HCV：ELISAELISA法法n nHCV RNAHCV RNA：巢式：巢式RT-PCRRT-PCR法，引物选自法，引物选
41、自55端高保守区端高保守区 7575n n选择选择HCVHCV高变异区高变异区E E2 2区进行巢式区进行巢式PCRPCR扩增、扩增、克隆、测序，然后进行克隆、测序，然后进行种系发生分析种系发生分析种系发生分析种系发生分析(phylogenetic tree (phylogenetic tree (phylogenetic tree (phylogenetic tree analysis)analysis)analysis)analysis)基因序列差异估计基因序列差异估计基因序列差异估计基因序列差异估计(estimation of (estimation of (estimation of
42、(estimation of nucleotide sequence diversity)nucleotide sequence diversity)nucleotide sequence diversity)nucleotide sequence diversity) “ “ “ “靴襻靴襻靴襻靴襻”分析分析分析分析(bootstrap analysis)(bootstrap analysis)(bootstrap analysis)(bootstrap analysis)。n n结合计算机辅助分析结合计算机辅助分析7676n n种系发生分析显示该种系发生分析显示该3 3对当事人均为对当事人
43、均为HCV 1bHCV 1b基因型；进化距离非常接近基因型；进化距离非常接近 n n分析分析3 3对当事人的对当事人的E2E2区序列多克隆、多次重区序列多克隆、多次重复试验结果，并结合统计分析表明：同一复试验结果，并结合统计分析表明：同一对当事人不同的克隆间的序列变异存在着对当事人不同的克隆间的序列变异存在着非常密切的同源进化关系非常密切的同源进化关系 7777从本研究案例可看出从本研究案例可看出n n传统流行病学研究仅能明确暴露方式与传统流行病学研究仅能明确暴露方式与可能的传染源可能的传染源n n通过与分子流行病学研究的结合，可进通过与分子流行病学研究的结合，可进一步从分子水平上为微量血传播
44、提供可一步从分子水平上为微量血传播提供可靠证据，并精确地判断传染来源靠证据，并精确地判断传染来源 7878非传染病研究中的应用非传染病研究中的应用 n n近年来，随着分子流行病学的发展，使近年来，随着分子流行病学的发展，使人们对各类致癌物及其作用于人体后所人们对各类致癌物及其作用于人体后所产生的各种生物学效应和宿主的易感性，产生的各种生物学效应和宿主的易感性，尤其是环境和遗传对肿瘤发生的相互作尤其是环境和遗传对肿瘤发生的相互作用有了更加深入的认识，从而有利地促用有了更加深入的认识，从而有利地促进了肿瘤的防治进了肿瘤的防治 79798080分子流行病学在临床中的应用分子流行病学在临床中的应用 n
45、 n美国国家卫生署（美国国家卫生署（NCINCI）在）在20052005年年底开始了底开始了“人类癌症基因组测序人类癌症基因组测序”的宏伟计划，预计用十年时间完成的宏伟计划，预计用十年时间完成主要癌症的基因测序及其序列基础主要癌症的基因测序及其序列基础上的诊断和基因靶向药物治疗上的诊断和基因靶向药物治疗8181n n基因测序技术在癌症基因研究及临床治疗基因测序技术在癌症基因研究及临床治疗领域的应用领域的应用n n更快速可靠地对癌症进行诊断更快速可靠地对癌症进行诊断, , 对其发生对其发生的内在分子机理也将有更深入的了解的内在分子机理也将有更深入的了解n n同时也将对癌症治疗药物的开发提供极大同
46、时也将对癌症治疗药物的开发提供极大帮助帮助8282与临床医学及病理密切相关的基因检测与临床医学及病理密切相关的基因检测项目项目nP53nBRCA1 、 BRCA2nAPCnK-rasnApoEnEGFRnC-kitnFVnYMDD nHNPCC片段分析 n尿路肿瘤微卫星片段分析 83838484P53P53基因基因pP53基因定位于17号染色体短臂，含有11个外显子和10个内含子，编码由393个氨基酸组成 ，分子量为53KD核酸蛋白，包括DNA结合、转录和激活结构域。pP53几乎参与了所有恶性肿瘤和癌变的肿瘤发生和演进过程。pP53基因病理改变主要有突变、重排、缺失等。突变是主要的致病方式，最
47、常见的突变部位在第59外显子区域 。8585临床应用临床应用 1.1.肿瘤诊断：肿瘤诊断：肝癌、乳癌、膀胱癌、胃癌、肠癌、肝癌、乳癌、膀胱癌、胃癌、肠癌、前列腺癌、肺癌、食道癌、卵巢癌、脑肿瘤、前列腺癌、肺癌、食道癌、卵巢癌、脑肿瘤、软组织肉瘤、骨肉瘤、白血病、淋巴瘤。软组织肉瘤、骨肉瘤、白血病、淋巴瘤。2.2.癌前及癌相关家族：萎缩性胃炎、大肠息肉、癌前及癌相关家族：萎缩性胃炎、大肠息肉、腺瘤、宫颈异型增生、乙肝和丙肝、子宫内膜腺瘤、宫颈异型增生、乙肝和丙肝、子宫内膜不典型增生、痰、膀胱、粪便中异型细胞、乳不典型增生、痰、膀胱、粪便中异型细胞、乳腺囊性增生症及腺病等、骨髓异常增生综合症、腺囊
48、性增生症及腺病等、骨髓异常增生综合症、低恶肉瘤、淋巴造血疾病等。低恶肉瘤、淋巴造血疾病等。86861.1.药物分子靶点和耐药基因：药物分子靶点和耐药基因：P53P53蛋白丢失，肿蛋白丢失，肿瘤细胞侵袭性增强，化疗凋亡作用受抑。某瘤细胞侵袭性增强，化疗凋亡作用受抑。某些肉瘤如脑肿瘤和癌的分子药物基因靶点治些肉瘤如脑肿瘤和癌的分子药物基因靶点治疗和化疗效果不佳。疗和化疗效果不佳。2.2.临床预后分析临床预后分析：P53P53基因突变癌症患者的生存基因突变癌症患者的生存预期短，易复发转移且家族血亲之间具肿瘤预期短，易复发转移且家族血亲之间具肿瘤易感性。易感性。8787BRCA1BRCA1基因基因1.
49、1.BRCA1BRCA1外外显显子子约约全全长长序序列列，可可分分成成4444项项完成全基因组检测。完成全基因组检测。2.2.BRCA2BRCA2基基因因位位于于13q12-1313q12-13，BRCA1BRCA1抑抑癌癌基基因因位位于于染染色色体体17q2117q21，是是目目前前极极受受重重视视与与乳乳腺腺癌癌明明确确相相关关的的易易感感基基因因，BRCABRCA癌癌基基因因异异常常者者在在一一生生中中患患乳乳腺腺癌癌的理论概率为的理论概率为100100。 8888临床应用BRCA1BRCA1基基因因突突变变：主主要要为为乳乳腺腺癌癌、卵卵巢巢癌癌，同同时时也也有有胰胰腺腺癌癌、胃胃癌癌
50、、胆胆囊囊癌癌、恶恶性性黑黑色色素素瘤瘤、白白血血病、前列腺癌、子宫癌等。病、前列腺癌、子宫癌等。p其其中中6060为为1-5bp1-5bp的的缺缺失失框框移移，1919为为插插入入，1414为无义突变，也有大缺失或插入及剪接子突变。为无义突变，也有大缺失或插入及剪接子突变。p伴卵巢癌的乳癌家系约有伴卵巢癌的乳癌家系约有80%80%是由是由BRCA1BRCA1的异常的异常pBRCA2BRCA2基基因因突突变变：主主要要与与家家族族性性乳乳癌癌和和男男性性乳乳癌癌发发病病有有关关，另另也也有有上上述述其其它它系系统统的的恶恶性性肿肿瘤瘤发发生生概率。概率。8989p癌的分化：BRCA1的突变及杂
51、合子缺失与乳癌的中低分化生物学行为有关，临床上多表现为期及早晚期患者。p癌前及症前诊断：主要用于乳癌、卵巢癌及消化系统癌症家族患者的基因突变检测。9090APC基因基因pAPC APC 基基因因位位于于第第五五号号染染色色体体的的长长臂臂（5q21-5q21-2222），长达），长达120KB120KB，共有共有2121个外显子个外显子 pAPCAPC基基因因突突变变主主要要位位于于基基因因中中段段的的第第9-119-11外外显显子子，其其中中密密码码子子第第10611061，13091309的的突突变变占占了了20%20%。患患者者可可次次序序发发生生10001000个个以以上上的的息息肉肉
52、，年龄轻，癌变早年龄轻，癌变早 9191pAPC基因前、后段的基因突变与数量较少的小息肉有关，发病年龄较晚。可伴有纤维瘤病，后者与第1444位密码子突变有关。如在第386和1465位的突变，对野生型APC基因干扰弱，息肉少，发病年龄较晚。pAPC基因突变分为有害（轻，中，重），多态性，和意义不明性。须结合病理形态诊断来评估基因突变的临床病理意义9292n n家族性腺瘤性息肉病（FAP）：APC致病基因突变，几乎100%的预示该家族成员的息肉存在（WHO资料）恶变可能，需密切复查肠镜病理检查n nGardner 综合征： 除了肠腺瘤外，病人还有表皮样囊肿，骨瘤，牙疾和纤维瘤病n n特克综合征（T
53、urkot syndrome）：多发性肠腺瘤伴脑髓母细胞瘤n n减性家族性腺瘤性息肉（Atteneuated FAP）:腺瘤少于100个，发病晚，癌变率较低9393p其他：APC基因突变相关的疾病和肿瘤还有遗传性大肠癌组织APC基因突变率高达70% -90% 以上，散发性大肠癌组织中也有30%以上的突变率.p癌组织体细胞APC基因突变，意味着癌变的早期分子事件，肿瘤的亚克隆选择，去分化恶性演进，浸润转移耐药等生物学行为暂未发生，预后尚好。p肺癌、胃癌、食道癌、肝癌、乳腺癌等也有不同比例的APC基因突变。9494注意事项：注意事项：p检查材料主要是肠镜病理活检息肉或肿瘤组织，石蜡包埋病变组织，血
54、液等。pAPC基因与NHPCC微卫星不稳定都是早期癌基因检测互补项目，最好结合应用。p大肠多发性腺瘤性息肉病APC基因突变测序，也可检测胃癌，乳腺癌，胰腺癌及癌前病变和少数肉瘤的APC癌基因突变。它反映早期的癌变趋势。9595RasRas基因基因pRasRas基基因因家家族族由由H-H-rasras、K-K-rasras和和N-N-rasras组组成。成。p我我们们检检测测K-RASK-RAS最最常常突突变变第第一一外外显显子子点点突突变变常常位位于于第第1212、1313、5959或或6161密密码码子子处处，不不同同的的rasras基基因因突突变变在在不不同同的的肿肿瘤瘤中中呈呈优势激活。
55、优势激活。9696临床应用：临床应用： p肿瘤诊断：K-ras突变：肠癌、胃癌、胰腺癌、肺癌等为主H-ras突变：急慢性淋巴造血系肿瘤为主N-ras突变: 泌尿系肿瘤为主9797癌前及家系检查：癌前及家系检查：n n癌前疾病患者ras基因突变提示细胞早期的恶性转化n n癌病家族受检者ras基因突变提示正常细胞的恶性演进和癌变9898ApoE基因基因 APOE（载脂蛋白E）基因位于19q，全长3.7 Kb，含有4个外显子，产生的APOE功能蛋白是低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白和乳糜微粒受体的配基。既进行脂质代谢，也活化水解脂肪的酶类。9999n nAPOE表型异常患者表现为脂质代谢疾病（高胆固醇症
56、）、心脑血管病、高血压、肥胖、糖尿病、脑卒中和冠心病、神经再生退行性变（老年性痴呆）和免疫调节紊乱（桥本甲状腺功能低下和肿瘤易感）、它汀降脂类耐药及高血压耐药等。100100n nAPOE基因在正常人群中呈多态性表现，即人群中有不同的APOE类型，导致人类发病种类和危险频率呈明显的差异性n nAPOE在同一基因座位有三个不同的等位基因（2 3 4）可编码成三个纯合子（2/2 ， 3/3、4/4）和三个杂合子（2/3 、2/ 4 3/4 ），形成6种不同的基因型，从而表现出不同的致病状态101101n n预报老年性痴呆发病率可能概率，特别是家族性受检者n n检查高脂血症发病和分型，治疗疗效和耐药
57、n n监测脑血管病复发性出血（脑梗塞）并作出警示性预报n n监测冠心病发病状况102102n n监测糖尿病和肾病发病状况n n对原发性高血压可评估家族性发病，治疗耐药及内脏器质损害现象n n对绝经和更年期妇女进行激素替代治疗。2 基因者可使总胆固醇明显升高，故需事先检测APOE基因n n评价妇女绝经期综合征103103p4/4 基因型者比3/4者老年痴呆尤其是血管型痴呆发病率更高，且发病年龄明显提前，程度加重，对治疗AD的他克林类药呈耐药性，并且是早发冠心病中年猝死的独立致病因子。p缺血性心脑血管病（ICVD）也呈高发，对调脂的他汀类呈耐药性。p4/4 基因型者型高脂血症明显增高并与高TC、L
58、DL-C和APOB水平密切相关。104104p3/4 3/4 基因型者是高胆固醇血症和遗传易感基因型者是高胆固醇血症和遗传易感性高危因子，发生心肌梗塞的年龄提前，且性高危因子，发生心肌梗塞的年龄提前，且老年性痴呆的发病率比非老年性痴呆的发病率比非4 4 者高者高3 3倍以上。倍以上。高血压呈耐药性。高血压呈耐药性。p2/4 2/4 基因型有中等量的脑复发出血梗塞率基因型有中等量的脑复发出血梗塞率和糖尿病肾病综合症发生率。高血压呈一定和糖尿病肾病综合症发生率。高血压呈一定耐药性。耐药性。105105pp 3/3 3/3 基基因因型型者者为为缺缺血血性性脑脑血血管管病病低低发发性性保保护护因因子子
59、，尚尚使使保保护护性性高高密密度度脂脂蛋蛋白白呈呈高高水水平平，故故属属优优良良的的APOEAPOE基基因因型型。但但可可在在脑脑缺缺血血脑脑梗梗塞塞患患者者中中致致复复发发致致死死性性出出血血。高高血血压压患患者者经经适适当当药药物物保保护护可可明明显显减减少少内内脏脏器器质质病变。病变。p2/3 2/3 基基因因型型老老年年痴痴呆呆发发病病率率低低，发发病病年年龄龄晚晚，与与长长寿寿有有关关，属属保保护护性性基基因因型型。但但可可发发生生缺缺血血性性脑脑病病（ICVDICVD）。妇妇女女更更年年期期后后激激素素替替代代治治疗疗时时总总胆胆固固醇醇可可明显升高。明显升高。106106p2/2
60、 基因型者几乎均为型高脂血症，早期发生动脉硬化，但对心脏呈保护性，对糖尿病呈低发性，但有糖尿病的治疗性胰岛素抵抗。p女性绝经激素替代治疗时总胆固醇明显升高107107EGFR基因基因pEGFR基因家族最常应用为Her1（受体酪氨酸激酶TK）和Her2（Cerb-B2）两类，其中EGFR-TK调控癌细胞的浸润，分化，转移。p近年来针对该基因的靶向药物Iressa（易瑞沙）和Tarciva（它西瓦）治疗非小细胞肺癌为首的上皮性肿瘤起到神奇的疗效。最关键的机理已经明确，当EGFR第18，19，21外显子发生各种突变时，易瑞沙疗效达90以上,而没有化疗的毒副作用。108108临床应用：临床应用： p各
61、种非小细胞肺癌占肺癌发病率80以上，尤其是在经过、期晚期癌症化疗后病人，转移的病人，体弱的老年性病人；p特别适合检测亚洲妇女肺腺癌和不吸烟者，突变率高达26-40；各种恶性上皮性肿瘤如大肠癌，乳腺癌，前列腺癌，甲状腺癌，胃癌，食道癌，肝癌；109109n n体检发现EGFR基因突变，意味着机体细胞的增生/凋亡比例发生异常，需立即对机体相关器官进行医学检查和随访，比如提示子宫平滑肌瘤的增生。110110c-kit基因基因n nCkit基因基因t（8；21）（）（q22；q22）的慢）的慢粒患者有粒患者有BCR/ABL融合基因疾病而受体酪融合基因疾病而受体酪氨酸激酶通路突变，主要是氨酸激酶通路突变
62、，主要是C-kit基因的第基因的第8外显子常发生突变及缺失外显子常发生突变及缺失n n针对该类基因靶点的药物格列卫（针对该类基因靶点的药物格列卫（Gleveev伊马替尼）可以修饰上述基因缺陷，也可伊马替尼）可以修饰上述基因缺陷，也可抑制抑制BCR/ABL融合基因肿瘤细胞融合基因肿瘤细胞111111n n近来发现在抑制PDGF受体SCF（干细胞）和Ckit基因突变的其他肉瘤和胃肠间质瘤有明确的疗效，主要依赖于C-KIT基因的突变，因此疗效直接依赖基因测序的结果112112发展前景发展前景n n尽管分子流行病学是一门新兴的边缘学科，尽管分子流行病学是一门新兴的边缘学科，目前尚有很多不成熟的地方，但
63、显示出了强目前尚有很多不成熟的地方，但显示出了强大的生命力，有关研究文献层出不穷大的生命力，有关研究文献层出不穷n n分子流行病学能使传统的宏观研究与现代的分子流行病学能使传统的宏观研究与现代的微观研究有机结合微观研究有机结合113113n n既从群体水平又从细胞与分子水平阐明疾病既从群体水平又从细胞与分子水平阐明疾病的病因与发生机制的病因与发生机制n n三间分布的影响因素、流行的规律等，从而三间分布的影响因素、流行的规律等，从而将进一步提高疾病监测的准确性，干预和预将进一步提高疾病监测的准确性，干预和预防措施针对性、有效性和可靠性防措施针对性、有效性和可靠性 114114小小 结结n n了解分子流行病学的产生和发展对疾病了解分子流行病学的产生和发展对疾病防治、健康促进的意义防治、健康促进的意义 n n掌握分子流行病学的基本概念掌握分子流行病学的基本概念n n熟悉分子流行病学主要研究内容和方法熟悉分子流行病学主要研究内容和方法115115116116117117118118
